Extracto
Antecedentes
Hay una demanda creciente de biomarcadores precisos para no invasiva precoz la detección del cáncer colorrectal. Se empleó un método de detección de marcador de escala del genoma para identificar y verificar los biomarcadores de metilación del ADN candidato para la detección basada en la sangre de cáncer colorrectal.
Metodología /Principales conclusiones
Hemos utilizado los datos de metilación de ADN de 711 colorrectal tumores, 53 emparejados adyacentes muestras de tejido normal del colon, 286 muestras de sangre sanos y 4.201 muestras tumorales de 15 tipos diferentes de cáncer. los datos de metilación del ADN se generaron por el Illumina Infinium HumanMethylation27 y las plataformas HumanMethylation450, que determinan el estado de metilación de 27.578 y 482,421 sitios CpG, respectivamente. Primero realizó una selección de marcadores múltiples pasos para identificar marcadores candidatos con alta metilación en todos los tumores colorrectales, mientras que alberga baja metilación en muestras sanas y otros tipos de cáncer. A continuación, utiliza muestras antes del tratamiento de plasma y suero de 107 pacientes con cáncer colorrectal y 98 controles sin cáncer colorrectal, confirmada por colonoscopia, para verificar marcadores candidatos. Se seleccionaron dos marcadores para una evaluación adicional: metilado
THBD gratis (THBD-M) y metilado
C9orf50 gratis (C9orf50-M). Cuando se probó en muestras de plasma y suero estos marcadores clínicos superaron antígeno (CEA) de medición en suero carcinoembrionario y dio lugar a un alto rendimiento de la prueba sensible y específica para la detección del cáncer colorrectal temprano.
Conclusiones /Importancia
Nuestro descubrimiento marcador sistemática y estudio de verificación para los marcadores de metilación de ADN basados en la sangre como resultado dos nuevos biomarcadores de cáncer colorrectal, THBD-M y C9orf50-M. THBD-M en particular mostró prometedora actuación en muestras clínicas, lo que justifica su mayor optimización y los ensayos clínicos
Visto:. Lange CPE, Campan M, Hinoue T, Schmitz RF, van der Meulen de Jong-AE, Slingerland H , et al. (2012) a escala del genoma Descubrimiento de la metilación del ADN biomarcadores para basada en la sangre de detección de cáncer colorrectal. PLoS ONE 7 (11): e50266. doi: 10.1371 /journal.pone.0050266
Editor: J. Carmen Marsit, Escuela de Medicina de Dartmouth, Estados Unidos de América
Recibido: 8 Agosto, 2012; Aceptado: 17 de octubre de 2012; Publicado: 28 Noviembre 2012
Derechos de Autor © 2012 Lange et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Estos autores no tienen el apoyo o la financiación para reportar
Conflicto de intereses:. Los autores desean declarar que PW Laird tiene las siguientes patentes emitidas en la tecnología MethyLight ( "Proceso para el análisis de metilación del ADN de alto rendimiento"; US Patent#6,331,393; Fecha de presentación: 14 de mayo de 1999; Fecha de emisión: 18 de diciembre de 2001. "Proceso de Alto Rendimiento de la metilación del ADN análisis ", US Patente#7,112,404; Fecha de presentación: December 10, 2001; Fecha de emisión: 26 de septiembre de 2006." Proceso de Alto rendimiento de ADN análisis de metilación "; Fecha de presentación: December 10, 2001; Fecha de emisión: 30 de junio 2009), que han sido autorizadas para Epigenómica AG. Además, P.W. Laird, D. J. Weisenberger, y M. Campan se nombran como inventores en la siguiente solicitud de patente pendiente de la tecnología digital MethyLight ( "ADN Análisis de metilación con el bisulfito digital genómica y secuenciación MethyLight Digital"; Pub App No: 20080254474; Fecha de presentación: 14 de abril de 2008) . DJ. Weisenberger es un consultor para Zymo Investigación. No hay más patentes, productos en desarrollo o los productos comercializados para declarar. Esto no altera los autores, la adhesión a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales.
Introducción
El cáncer colorrectal (CCR) es una enfermedad común con un estimado de 143,460 nuevos casos en el EE.UU. en 2012 [1]. CRC es el tercer cáncer más frecuentemente diagnosticado en hombres y mujeres en el mundo occidental y un porcentaje significativo de pacientes que se presentan con CRC tendrán metástasis a distancia (estadio IV) al momento del diagnóstico, que a menudo es incurable. Está claro que el cáncer localizado (estadio I /II) se detecta a tiempo es más susceptible a la terapia curativa, que ofrece el pronóstico superiores [2], [3]. En consecuencia, los métodos de diagnóstico que resultan en la detección temprana de la enfermedad maligna o premaligna incluso podrían tener beneficios clínicos considerables, reducir la mortalidad y la morbilidad de los pacientes con cáncer colorrectal. Disponibles las técnicas de detección de potenciales CRC incluyen examen de sangre oculta, enema de bario de doble contraste, la endoscopia, con preferencia por pancolonoscopy, y la colonoscopia virtual [4], [5]. La medición de antígeno carcinoembrionario suero (CEA) también se ha sugerido como una posible modalidad de detección pero carece de suficiente sensibilidad para detectar CRC en una etapa temprana, y su nivel también es elevada en enfermedades no malignas (por ejemplo, diverticulitis, gastritis, diabetes) [6].
se espera que una prueba de detección óptima
para ser altamente sensible y específico, no representan ningún riesgo para los pacientes, y tienen una alta aceptación del paciente. También debe ser rentable y fácil de realizar. Como procedimientos de cribado actuales carecen de suficiente valor predictivo positivo, requieren una preparación desagradable o causan molestias, hay una necesidad de desarrollar nuevas pruebas no invasivas para la detección de CRC en una etapa temprana suficiente para que el tratamiento tenga éxito. marcadores de metilación del ADN son prometedoras herramientas que podrían ser útiles para la detección temprana del cáncer. En la última década se ha hecho evidente que las células cancerosas tienen patrones aberrantes de la metilación del ADN y que estas alteraciones se pueden detectar en el ADN derivado de tumor que se encuentra en el plasma o suero de pacientes con cáncer [7], [8]. Varios estudios han documentado la presencia de ADN libre derivada de tumores sólidos en el torrente sanguíneo de los pacientes con cáncer, lo que plantea la posibilidad de detectar estas moléculas específicas del cáncer en sujetos con enfermedad existente [9] - [22].
Un número de estudios ya han informado de la utilización de marcadores de metilación del ADN para la detección basada en la sangre de CRC con resultados variables [9] - [22]. Sin embargo, la mayoría de estos estudios se han basado en la prueba de un número limitado de genes preseleccionados y en el uso de métodos de detección no cuantitativos, tales como PCR específica de metilación basado en gel. El objetivo de este estudio es identificar biomarcadores de metilación del ADN basados en la sangre de CRC utilizando un enfoque de la metilación del ADN del genoma a gran escala para el descubrimiento de marcador y poner a prueba los marcadores en especímenes clínicos de sangre pre-operatorio de pacientes sometidos a cirugía curativa para el CRC.
Métodos
muestras Humanos y Ética Declaración
Las juntas de revisión institucional local y regional aprobado este estudio. Se obtuvo consentimiento informado de todos los pacientes y controles participantes. Pre-terapéuticos muestras de plasma y suero se obtuvieron de pacientes con CRC en la consulta externa a través de la flebotomía de la vena cubital media a partir de abril de 2008 a diciembre de 2011. plasma y suero fueron aislados dentro de los 30 minutos de venopunción como se describe anteriormente [22]. Cada muestra de plasma o suero se dividió en dos tubos separados y se almacenó a -80 ° C hasta su procesamiento. El CEA en suero se midió en cada una venopunción en pacientes con CRC
.
Los controles se definen como sujetos sin CCR o cualquier malignidad en los últimos cinco años y se incluyeron en este estudio en el departamento de endoscopia. Los individuos sometidos a una colonoscopia, que no presentaron ningún signo de un tumor maligno colorrectal, fueron elegibles para participar. Las indicaciones de la colonoscopia para estos pacientes eran colonoscopias de vigilancia a causa de la enfermedad inflamatoria intestinal (EII, enfermedad de Crohn o colitis ulcerosa), antecedentes familiares de CCR, trastornos gastrointestinales o pérdida de sangre rectal. Un gastroenterólogo con experiencia lleva a cabo todas las colonoscopias. Los pacientes con insuficiencia renal leve EII, controlado fueron incluidos siempre que era posible inspeccionar de forma fiable la mucosa del colon en la colonoscopia
y
si las biopsias de vigilancia que se toman habitualmente a lo largo de todo el tracto colorrectal patológicamente eran normales (no muestran signos de displasia). Las muestras de plasma y suero fueron aisladas de estos individuos utilizando el mismo protocolo que para los pacientes con CRC. se obtuvo
CRC tejido durante la resección quirúrgica del tumor e inmediatamente envía al patólogo. El patólogo diseccionó una parte representativa del tumor y se almacena la muestra fresco congelado a -80 ° C dentro de una hora después de la resección quirúrgica. Además, una muestra patológicamente colon normal se tomó al menos 10 cm de distancia del borde del tumor y se almacena en la misma forma
Marcador: Descubrimiento. Tecnologías y conjuntos de datos
En el descubrimiento marcador fase de este estudio se utilizaron los datos de metilación del ADN generados por Illumina Infinium HumanMethylation27 BeadChip® (HM27) y las plataformas HumanMethylation450 BeadChip® (HM450). El ensayo Infinium cuantifica los niveles de metilación de ADN en los residuos de citosina específicas adyacentes a los residuos de guanina (CpG loci), mediante el cálculo de la relación (β-valor) de intensidades entre las sondas de talón unida metilados y no metilados específicos de locus. El β-valor es una variable continua, que van desde 0 (no metilado) a 1 (totalmente metilado) [23]. El HM27 BeadChip® evalúa el nivel de metilación del ADN de 27.578 sitios CpG localizadas en las regiones promotoras de los 14.495 genes codificadores de proteínas. El HM450 BeadChip® evalúa el estado de metilación del ADN de CpG 482.421 loci y cubre el 99% de los genes RefSeq y el 96% de las islas CpG UCSC (www.ncbi.nlm.nih.gov/RefSeq, www.illumina.com).
Hemos utilizado los datos Infinium HM27 y HM450 disponibles a partir de 711 tumores colorrectales, 53 emparejados adyacentes normales muestras de tejido del colon y 10 muestras de linfocitos de sangre periférica (PBL) de individuos sanos para identificar y verificar los marcadores tumorales metilación del ADN candidato. Además, se utilizaron los datos de Infinium conjuntos de datos disponibles públicamente (GEO y TCGA) que representan 274 muestras sanas PBL y 4.201 muestras de tejidos malignos de 15 tipos diferentes de cáncer de maximizar CRC especificidad (ver Tabla 1). Los valores de beta de 611 CRC tumores y 24 emparejados muestras de tejido de colon normal adyacentes fueron recuperados de la base de datos de la metilación del ADN CRC incluidos en The Atlas del Genoma del Cáncer (TCGA) Portal de Datos (http: //tcga-data.nci.nih. gov /TCGA /tcgaHome2.jsp). Los datos de los otros tumores CRC 100 y 29 muestras de tejido del colon adyacentes normales emparejados se generaron en el Centro USC Epigenoma en un estudio anterior [24]. Infinium datos de 274 muestras de PBL fueron descargados de la base de datos de la Expresión Génica Omnibus (GEO) en el Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/, número de acceso 19711 GSE). Los datos para los 10 restantes muestras de PBL se generaron utilizando la plataforma HM27 para un estudio de descubrimiento marcador anterior de la USC Epigenome Center [25]. Documento S1 resume los números de archivo de todos los GEO y TCGA conjuntos de datos disponibles públicamente utilizados en este estudio. estado de metilación del ADN se evaluó mediante la BeadChip HM27 para 336 muestras de CRC, 29 muestras de colon normales y 274 muestras de PBL (Tabla 1). Para los 375 CRC tumores restantes y 24 muestras de colon normales, el estado de metilación de ADN se evaluó con el BeadChip HM450 (Tabla 1). También generó datos HM450 en dos muestras de PBL de la colección de 10 estudiado en la plataforma HM27. De los 375 CRC, los datos de sólo 40 muestras estaban disponibles en el momento en que realizó el descubrimiento marcador. datos de metilación del ADN de los otros 335 CRC tumores no fueron utilizados en el algoritmo de selección de marcadores. Lo hicimos, sin embargo, utilizamos estos datos para verificar las últimas dos marcadores seleccionados
Marcador Descubrimiento:. Criterios de filtro
Hemos empleado un proceso de filtración de múltiples etapas en la fase de descubrimiento de este estudio. datos de metilación del ADN generadas por los dos BeadChips diferentes (HM27 y HM450) se analizaron por separado, pero utilizando los mismos pasos de filtrado (Figura 1 y 2). Empezamos mediante la exclusión de todas las sondas Infinium que fallaron en ninguna de las muestras. sondas HM27 que no estaban alineados de forma única con el genoma humano (hg19, GRCh37), o que se asociaron con los polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) dentro de los 10 pares de bases de la GPC objetivo (identificada mediante el NCBI dbSNP construye 126 y 128), o sondas que también se excluyeron los elementos repetitivos cubiertos (identificados por RepeatMasker). Se determinó la más alta β-valor para cada sonda en 10 muestras de PBL sanos (β-PBL
H) y la 10
percentil de los ß-valores tumorales CRC (β-CRC
10) (figura 2A). Se excluyeron todas las sondas con una β-PBL
H mayor que 0,2 o mayor que la asociada β-CRC
10. A continuación, filtraron los restantes sondas contra el tejido normal del colon y otros 15 tipos de cáncer. En detalle, se determinó la media β-valor de cada sonda en el tejido de colon normal (β-NC
M) y se eliminan todas las sondas que tenían una β-NC
valor M mayor que 0,2 o mayor que la β asociado -CRc
10 valor (Figura 2B). Se seleccionaron los 25 mejores marcadores en ambos conjuntos de datos después de la clasificación de las sondas basadas en la diferencia entre β-CRC
10 y β-PBL
H (Figura 2C). Para el filtrado frente a otros tipos de cáncer, se determinó la media β-valor (β-OC
M) para las sondas restantes de cada tipo de cáncer y eliminamos todas las sondas que tenían una β-OC
M más alto que la media CRC β-valor (β-CRC
M). Se seleccionaron las sondas restantes para el diseño de reacción MethyLight y posterior evaluación.
Hemos utilizado los datos de metilación del ADN de la Infinium HumanMethylation27 BeadChip (HM27) y HumanMethylation450 BeadChip plataformas (HM450) Infinium para detectar 27.578 (HM27) y 482.421 (HM450 ) loci CpG por su estado de metilación en muestras de CRC, muestras de PBL de sujetos sanos, muestras pareadas normales de tejido colorrectal (NC) y otros 15 tipos de cáncer (OC). Se utilizó un enfoque gradual eliminación de las sondas que han fallado en ninguna de las muestras, sondas que contenían SNPs o repiten secuencias, sondas con un alto PBL β-valor (β-PBL
H) o una media de tejido normal del colon β-valor ( β-NC
H) mayor que el percentil 10 asociados de ß-tumorales valores CRC (β-CRC
10) o superior a 0,2 en ninguna de las muestras de PBL o NC (panel Infinium). Las sondas restantes se clasifican en base a la diferencia entre β-CRC
10 y β-PBL
H y el top 25 fueron seleccionados de ambos conjuntos de datos (HM27 y HM450) para el filtrado frente a muestras de OC. Sondas con una media OC β-valor más alto que la media CRC β-valor asociado (β-CRC
M) fueron eliminados. Un total de 15 reacciones MethyLight (marcadores) fueron diseñados para 10 sondas y probado en una secuencia de pasos de verificación (panel MethyLight). Los marcadores fueron eliminados si su rendimiento no fue óptima en los controles, tales como
in vitro
metilado
Sss
1 de ADN, ABP y las muestras de plasma de los controles sanos y tejidos tumorales CRC. Los marcadores también fueron eliminados si no pudieron detectar el ADN metilado CRC en una mezcla de plasma y suero de pacientes con CRC. Dos marcadores cumplen todos los criterios de selección y se avanzó en la tubería para su posterior verificación en muestras de pacientes individuales. (* Las sondas que han fallado en ninguna de las muestras, así como aquellas que incluyen los SNP y repetir secuencias; ** Otros tipos de cáncer que se usan en este estudio se resumen en la Tabla 1, M. ***
Sss
ADN tratado) guía empresas
A (figura superior:. HM27, cifra inferior: HM450), diagramas de dispersión de la más alta PBL β-valor (β-PBL
H) de 10 (HM27) y 2 (HM450) muestras de control sanos (eje X) contra el percentil 10 asociados de ß-tumorales valores CRC (β-CRC
10) en el eje de ordenadas. Los puntos azules representan las sondas eliminadas (HM27: n = 23.049; HM450: n = 367,833) y los puntos rojos (HM27: n = 695; HM450: n = 30.207) representan las sondas retenidas con una β-CRC
10 & gt ; ß-PBL
H o un β-PBL
H & lt; 0,2. B, los diagramas de dispersión de la media β-valor tejido de colon normal (β-NC
M) para las sondas retenidos desde el panel A (eje X) contra el asociado β-CRC
10 (eje Y). Los puntos rojos (HM27: n = 512; HM450: n = 28,428) representan las sondas eliminados, los puntos verdes representan las sondas acumuladas (HM27: n = 183; HM450: n = 1779) con una β-CRC
10 & gt ; ß-NC
M o una β-NC
M & lt; 0,2. C, diagramas de dispersión de las sondas retenidos desde el panel B (verde) que aparecen por la diferencia entre β-CRC
10 y β-PBL
H (eje X) contra el asociado β-CRC
10 (Y -eje). Los puntos dentro del cuadrado amarillo son las sondas seleccionadas para el filtrado adicional contra otros tipos de cáncer. Las flechas blancas señalan las sondas de los dos marcadores candidatos. D, las curvas de ROC para las sondas utilizadas en la reacción multiplex sobre la base de ß-valores de metilación de 335 muestras de cáncer colorrectal independientes y 23 normales muestras de tejido colorrectal coincidentes independientes (los datos de metilación del ADN de estas muestras se no se utiliza en el descubrimiento de tuberías marcador). El color gris oscuro es el área bajo la curva.
Extracción de ADN y bisulfito Modificación
ADN a partir de dos muestras sanas PBL y 25 muestras de tumor de CRC se extrajeron de acuerdo con el protocolo descrito previamente [25]. ADN de muestras de plasma y suero fue extraído utilizando el QIAamp® circulante Nucleic Acid Kit (Qiagen), especialmente diseñado para recuperar una cantidad máxima de ADN circulante libre de células a partir de suero o sangre. El kit de la metilación del ADN Zymo® EZ (Zymo Research) se utilizó para convertir bisulfito del ADN extraído. Todas las extracciones y las conversiones se realizaron de acuerdo a las instrucciones del fabricante. La calidad y cantidad del ADN con bisulfito convertidos, así como la integridad de la conversión de bisulfito, se evaluaron utilizando un panel de reacciones de control de calidad como se describe anteriormente [26].
Análisis MethyLight
El ensayo MethyLight se realizó como se describe anteriormente [27]. La secuencia de los cebadores MethyLight y sondas utilizados en estos análisis se describen en la Tabla S1. Las reacciones MethyLight se evaluaron en cuatro pasos. En primer lugar, M.
Sss
I (New England Biolabs) tratados con ADN de PBL (Promega) se utilizó para determinar si la reacción amplificada
in vitro
metiladas ADN de control [28]. Las reacciones con un umbral de ciclo [C (t)] fueron excluidos mayor que 35. En segundo lugar, las reacciones fueron seleccionadas contra el ADN PBL 50 ng de dos individuos sanos. Las reacciones con C (t) valores inferiores a 40 fueron excluidos. Las reacciones restantes se probaron en 25 muestras de ADN CRC, utilizando una reacción MethyLight basado en ALU y un M.
Sss
1 curva estándar de ADN para calcular el porcentaje de metilado de referencia (PMR) como se describe anteriormente [27], [29]. Se eliminaron 10 en más de un CRC tumores; reacciones con un PMR & lt. Finalmente, las reacciones se ensayaron en 10 muestras de plasma de donantes sanos (equivalente de 100 l de plasma) y los valores clasificados en función de su C (t). Las reacciones con C (t) valores de menos de 50 en una o más de estas muestras fueron eliminados.
MethyLight Digital Análisis
muestras clínicas agrupadas.
Digital MethyLight es una cuantitativa técnica de PCR en el que se analizó el ADN con bisulfito convertido usando el ensayo de MethyLight PCR de una manera distributiva más de 96 cámaras de reacción para cada muestra. Esta técnica es un método eficiente y eficaz de obtención de información de metilación del ADN en las muestras con pequeñas cantidades de ADN y se realizó tal como se describe anteriormente [25], [30]. Preparamos cuatro piscinas separadas de plasma y cuatro piscinas de ADN en suero para probar marcadores candidatos (Grupo 1 = 16 controles (sin EII), piscina 2 = 16 pacientes con insuficiencia renal leve EII, piscina 3 = 16 pacientes con estadios I /II CRC y piscina 4 = 16 pacientes con estadios III /IV CRC). Cada una de estas piscinas contenían ADN de 190 l de plasma o suero de cada uno de los 16 individuos en la piscina. Para cada reacción primero a prueba de ADN a partir de plasma o suero 50 l de cada piscina. Para las reacciones que no dio lugar a ningún amplificaciones de PCR (resultados) con 50 l, el volumen se incrementó hasta un 150 l equivalente. Por último, se excluyeron las reacciones que no dio lugar a ninguna pega en las piscinas o CRC dieron golpes en los controles con o sin EII
.
Los dos marcadores candidatos que sobrevivieron a este proceso de eliminación fueron marcadas con diferentes fluoróforos. Esta reacción de PCR permitido a los resultados de colores específicos que nos permitió distinguir los éxitos de cada uno de estos marcadores cuando se corrieron juntos (múltiplex). Todas las sondas y cebadores fueron sintetizados por Biosearch Technology, Inc, Novota, California, EE.UU..
muestras clínicas individuales.
El múltiplex de dos marcador fue probado en muestras de plasma y suero de 75 CRC independiente pacientes y 70 controles con un volumen de ensayo de 1 ml. La Tabla 2 proporciona una visión general de las características clínicas de los pacientes con CRC y los sujetos de control utilizado para la prueba marcador clínico en este estudio.
Análisis estadístico
El cálculo de intervalos de confianza sobre las superficies la curva (AUC) y las pruebas estadísticas se llevaron a cabo en R (versión 2.14.0), con el paquete de R Proc [31]. El método propuesto por DeLong et al [32] se utilizó para la prueba.
Resultados
Marcador Discovery en el genoma escala de metilación del ADN de conjuntos de datos
Se realizó un escalonado análisis descubrimiento marcador utilizando conjuntos de datos de metilación del ADN disponibles de un gran número de tumores de CRC, 15 otros tipos de cáncer diferentes, y muestras de control de plasma, PBL y tejidos del colon adyacente normal correspondiente (figuras 1 y 2, Tabla 1) para identificar ADN CRC marcadores de metilación. Hemos utilizado los datos generados utilizando dos plataformas diferentes Illumina Infinium HumanMethylation BeadChip, HM27 y HM450 (véase la sección Métodos). Después de retirar las sondas potencialmente problemáticas, secuencias de la sonda que se superponen SNPs o elementos repetitivos, y sondas que no pudo realizar en todas las muestras, había 23.049 sondas HM27 y 367,254 sondas HM450. De estas sondas, 695 permanecieron en el grupo HM27 y 29.640 en el grupo HM450, después de eliminar aquellos que tenían niveles más altos de metilación del ADN en las muestras de PBL sanos que en los tumores de CRC. Además, se excluyeron todas las sondas con mayor metilación del ADN en el tejido de colon normal que en CRC y calificadas las sondas restantes en base a la diferencia entre PBL saludable y CRC metilación del ADN tumoral. El estado de metilación del ADN de las 50 sondas combinadas (calificados por la mayor diferencia entre PBL saludable y la metilación del ADN CRC) se compararon entre CRC y otros 15 tipos de cáncer. Se excluyeron las sondas con un nivel de metilación del ADN media superior de cualquier otro tipo de cáncer que en CRC. Diez sondas candidatos CRC-específicos (asociado con diez promotores de genes únicos) se mantuvo, que mostraron mayor media de valores de metilación del ADN en CRC que el valor medio de la metilación del ADN de todos los otros tipos de cáncer correspondiente.
Candidato marcador MethyLight Ensayo Desarrollo y Verificación
Hemos diseñado y puesto a prueba un total de 15 ensayos MethyLight en tiempo real basados en la PCR (marcadores) para los diez restantes sondas. técnicas basadas en MethyLight son métodos muy sensibles para la detección de moléculas de ADN metilado [27]. Las secuencias de cebador y sonda para estas reacciones se describen en la Tabla S1. El desarrollo de las pruebas de verificación realizadas en estos marcadores se ilustra en el panel derecho de la Figura 1. Tres reacciones MethyLight no amplificaron
in vitro
metilado (M.
Sss
I-tratado) ADN de control en y por lo tanto fueron eliminados. También se eliminaron 10 en más de uno de los 25 tumores de CRC probados por MethyLight, cinco marcadores que fueron positivos en muestras de PBL sanos y tres marcadores que tenían un PMR & lt. Los cuatro marcadores restantes se probaron en muestras de plasma de diez donantes sanos y no se detectaron ninguno de ellos en estas muestras (datos no mostrados). Todos los cuatro marcadores fueron analizados por Digital próxima MethyLight en muestras de suero y plasma agrupados de controles con o sin los pacientes con EII y CRC. Dos marcadores que no se pudo detectar en las muestras de CRC combinados fueron eliminados (datos no mostrados). Las últimas dos biomarcadores de metilación del ADN candidato que cumplieron con todos nuestros estrictos criterios de selección fueron:.
THBD gratis (THBD-M) y
C9orf50 gratis (C9orf50-M)
rendimiento preliminar evaluación de
THBD
y
C9orf50
Se evaluó el rendimiento de
THBD gratis (Infinium número de sonda cg24562819) y
C9orf50 gratis ( Infinium número de sonda cg14015706) para discriminar el tejido CRC y el tejido adyacente colorrectal normal en un conjunto de datos independientes de 335 CRC tumores (Tabla 1).
THBD
y
C9orf50
Had β-valores & gt; 0,4 en el 95% y el 100% de todos los tumores analizados CRC, respectivamente. La figura 2 muestra la curva característica de funcionamiento del receptor (ROC) para
THBD
y
C9orf50
en la discriminación de las muestras tumorales frente CRC tejido colónico normal. Las AUC para
THBD
y
C9orf50
era 0.97 y 1.0, respectivamente. Es importante destacar que ambos marcadores revelaron bajos niveles de metilación de ADN en todos los demás tipos de cáncer incluyendo cáncer de mama, pulmón, próstata, tiroides, útero, riñón, de ovario, gástrico, cánceres de páncreas y de vejiga, así como melanoma, leucemia mieloide aguda, glioblastoma multiforme y de cabeza y El carcinoma de células escamosas del cuello (Figura 3).
parcelas de fluctuación que representan los valores de ß-metilación del ADN basada en Infinium de
THBD gratis (panel izquierdo) y
C9orf50 gratis (panel derecho) en 335 CRC tumores independientes, emparejado tejidos de colon normales, una variedad de otros tipos de cáncer y PBL de individuos sanos. El número concreto de muestras para cada tipo de tejido se describe en la Tabla 1.
Prueba el rendimiento de THBD-M y C9orf50-M en muestras clínicas individuales
Hemos desarrollado una reacción multiplex para los dos marcadores utilizando diferentes colorantes indicadores para cada una de las reacciones. La sonda THBD-M se marcó con un fluoróforo QUASAR que resulta en una señal fluorescente de color rojo y la sonda C9orf50-M se marcó con el fluoróforo FAM azul. Los cebadores y sondas de los dos marcadores fueron probados para la interferencia mediante la combinación de ellos en una solución a diferentes concentraciones mediante M.
Sss
tratado ADN de control para los ensayos de MethyLight y MethyLight digital (datos no mostrados). Puesto que la reacción multiplex de los dos marcadores prestados, así como las reacciones individuales se utilizó el primero para pruebas clínicas adicionales.
Un total de 106 pacientes con CCR y 98 controles sin CCR, verificado por la colonoscopia, se incluyeron en este estudio prospectivo. Las muestras de suero y plasma apareadas estaban disponibles de todos los controles y 103 pacientes con CRC, mientras que sólo se obtuvo el plasma de tres pacientes con CCR. Aunque el estadio IV CRC fue un criterio de exclusión en este estudio, las alteraciones no específicas fueron vistos en el diagnóstico por imágenes preoperatorios durante tres pacientes (por ejemplo, pequeños nódulos pulmonares en la TC-tórax) que más tarde, pero antes de la cirugía, resultaron ser metástasis a distancia. Estos pacientes fueron eclipsados posteriormente a la etapa IV CRC. Treinta y dos muestras de plasma y suero de los controles y pacientes con CRC se utilizaron previamente en el análisis de la muestra agrupada como se mencionó anteriormente.
Hemos probado los ensayos MethyLight digitales multiplexados para THBD-M y C9orf50-M marcadores en muestras de plasma individuales 75 de CRC y 66 controles y en las muestras de suero individuales de 72 CRC y 66 controles. La Figura 4 muestra el número de moléculas (suma de los dos marcadores) detectada en 1 ml de plasma (panel A) y suero (panel D) para diferentes etapas del CRC en comparación con los controles. Las curvas ROC ilustran el rendimiento de la prueba para la reacción multiplex por estadio de la enfermedad (panel B) y para ambos marcadores por separado en plasma (panel C) y suero (panel E y F). Los valores de AUC por estadio de la enfermedad se describen en la figura 4. En todas las fases, no estaba en el límite de rendimiento de ensayo mejorado de manera significativa para el suero en comparación con el plasma como medio de ensayo (p = 0,06 para todas las etapas de CRC). THBD-M realiza significativamente mejor en comparación con C9orf50-M en plasma y suero (p & lt; 0,001). La adición de C9orf50-M a THBD-M para la detección de CRC no mejoró el rendimiento de ensayo. Los valores de AUC por etapa, para cada marcador por separado y la reacción multiplex, se resumen en la Tabla S2.
Digital MethyLight se realizó en 1 ml de plasma (A) y suero (D) para detectar THBD-M y C9orf50- M en muestras de CRC y de control. El número absoluto de moléculas detectadas por el multiplex (suma de los dos marcadores) reacción se registra en el eje y. Las muestras de CRC se organizan por escenario. Asteriscos (*) indican muestras con más de 25 moléculas detectadas (hasta 153 moléculas en el plasma y 157 moléculas en suero). curvas ROC y AUC (95% intervalo de confianza) de las diferentes etapas de CRC en el plasma (B) y suero (E) basados en el número de moléculas detectadas. ROC análisis y la AUC (95% intervalo de confianza) para THBD-M, M-C9orf50 como reacciones individuales y como una reacción multiplex en el plasma (C) y suero (F).
También determinaron la los niveles de CEA en muestras de suero preoperatorio de 107 pacientes con CCR. Se observó un CEA en suero elevada (≥5.0 ng /ml) en 35/107 (33%) pacientes. Para la etapa I CRC CEA sérico aumentó en un 14%, para la etapa II en el 33%, para la fase III en el 39% y para la fase IV en el 67%. Tabla S3 resume los niveles séricos preoperatorios de CEA de todos los pacientes con el número asociado de moléculas THBD-M y M-C9orf50 detectados por 1 ml de plasma y suero.
Discusión
Una de las importantes deficiencias en los estudios de biomarcadores CRC publicados es la dependencia de un enfoque de genes candidatos para el descubrimiento marcador. Este enfoque se basa a menudo en una selección no sistemática de genes marcadores candidatos, que son probados en los tejidos sanos y cancerosos y validado en una población de pacientes [9] - [22]. Aunque algunos de estos estudios han dado como resultado prometedores biomarcadores para la detección temprana de CRC, la falta de una estrategia exhaustiva descubrimiento de biomarcadores plantea la cuestión de si los marcadores superiores pueden haber sido pasados por alto. Con las tecnologías más avanzadas disponibles actualmente, es posible obtener el genoma escala los datos de metilación del ADN que puede ser útil para el descubrimiento de biomarcadores. Se realizó un descubrimiento de varios pasos marcador escala del genoma para identificar biomarcadores CRC utilizando la plataforma HM27 y HM450 BeadChip; este último se evalúa el estado de metilación de ADN de más de 482.000 CpG loci y cubre el 96% de todas las islas CpG UCSC. Recientemente hemos llevado a cabo una estrategia de marca-ducto similar para el cáncer de ovario e identificamos el nuevo biomarcador sensible recurrencia IFFO1-M [25]. Para el presente estudio hemos mejorado nuestra estrategia de descubrimiento mediante el uso de datos de la metilación del ADN de 4.201 muestras de cáncer de diferentes orígenes para optimizar CRC especificidad. Nuestros resultados muestran que esta estrategia funciona con éxito en el descubrimiento de CRC, dando lugar a dos nuevos biomarcadores: THBD-M y C9orf50-M. Con AUCs de 0,97 y 1,0, respectivamente, en el ensayo de Infinium, estos dos marcadores tienen una excelente capacidad de distinguir entre los tumores CRC y tejido de colon normal correspondiente. A pesar de que la metilación del ADN de estos genes aún no ha sido reportado en asociación con la detección temprana de CRC, un estudio reciente mostró que el aberrante
THBD
metilación de ADN fue ligado a la carcinogénesis del cáncer gástrico [33], que es coherente con la ligeramente más alto