Extracto
Antecedentes
La esfingosina quinasa-1 (SphK1) es una quinasa oncogénica de lípidos en particular involucrado en respuesta a las terapias contra el cáncer en el cáncer de próstata. Los andrógenos regulan la proliferación de células de cáncer de próstata, y la terapia de privación de andrógenos es el estándar de cuidado en el manejo de pacientes con enfermedad avanzada. Aquí, hemos explorado el papel de SphK1 en la regulación del crecimiento celular del cáncer de próstata dependiente de andrógenos y la supervivencia.
Metodología /Principales conclusiones
eliminación de andrógenos a corto plazo indujo inhibición rápida y transitoria SphK1 asociado con una reducción del crecimiento celular in vitro e in vivo, un evento que no se observó en las células PC-3 hormono-sensible. Apoyar el papel crítico de la inhibición SphK1 en el rápido efecto del agotamiento de andrógenos, su sobreexpresión podría poner en peligro la disminución del crecimiento celular. Del mismo modo, la adición de la dihidrotestosterona (DHT) a las células LNCaP andrógeno-privado restableció la proliferación celular, a través de un receptor de PI3K estimulación androgénica //Akt dependiente de SphK1, y la inhibición de SphK1 marcadamente podría impedir los efectos de la DHT. A la inversa, la eliminación a largo plazo en apoyo de andrógenos en células LNCaP y C4-2B resultó en un aumento progresivo de la expresión y la actividad SphK1 largo de la progresión a estado de andrógenos a la independencia, que se caracteriza por la adquisición de una neuroendocrino (NE) -como célula fenotipo. Es importante destacar que la inhibición de la vía PI3K /Akt-impactando negativamente SphK1 actividad podría evitar la diferenciación NE en ambos modelos celulares, un evento que podría ser imitado por los inhibidores de la SphK1. Es fascinante, la reversibilidad del fenotipo NE por la exposición al medio normal estaba vinculado con una marcada inhibición de la actividad SphK1.
Conclusiones /Importancia
Se presenta la primera evidencia de que la privación de andrógenos induce un efecto diferencial sobre la actividad SphK1 en modelos celulares de cáncer de próstata hormono-sensible. Estos resultados también sugieren que la activación SphK1 a privación de andrógenos crónica puede servir como un mecanismo de compensación permitiendo que las células de cáncer de próstata para sobrevivir en el ambiente de andrógenos-agotado, dando soporte a su inhibición como una estrategia terapéutica potencial para retrasar /prevenir la transición a la próstata independiente de andrógenos cáncer
Visto:. Dayon A, L Brizuela, Martin C, C Mazerolles, Pirot N, N Doumerc, et al. (2009) esfingosina quinasa-1 es fundamental para el crecimiento del cáncer de próstata andrógeno-regulado y supervivencia. PLoS ONE 4 (11): e8048. doi: 10.1371 /journal.pone.0008048
Editor: Joseph Alan Bauer, Fundación de Investigación Bauer, Estados Unidos de América
Recibido: 23 de julio de 2009; Aceptado: 2 de noviembre de 2009; Publicado: 26 Noviembre 2009
Derechos de Autor © 2009 Dayon et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el INSERM, CNRS, Fondation pour la Recherche Médicale, Asociación para la Investigación sobre les Tumeurs de la próstata, y el Institut National du Cancer (OC). AD es destinatario del Ministerio de la Enseñanza Superior y de la Investigación y La Liga Nacional Contra el Cáncer. CM es destinatario del Ministère de l'Enseignement Supérieur et de la Recherche. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de próstata es el tumor maligno más frecuente que representan el 25% de todos los cánceres recién diagnosticados en hombres y es la segunda causa principal de muerte por cáncer [1]. El tratamiento primario con cirugía o radioterapia en pacientes con cáncer de próstata confinado al órgano demuestra las tasas de supervivencia a 10 años totales de más del 75% [2], [3]. A pesar de que, se estima que aproximativamente 15% de los pacientes se presentan localmente avanzado o enfermedad metastásica, y alrededor de 40% de los pacientes recaída después de la terapia local [4].
proliferación de células de cáncer de próstata está regulada por andrógenos y privación de andrógenos terapia (ADT) es el estándar de cuidado en el manejo de pacientes con enfermedad avanzada. ADT es inicialmente eficaz, reduciendo tanto el tamaño de la próstata y los niveles de antígeno prostático específico (PSA), pero al final todos los pacientes se vuelven resistentes a la manipulación hormonal [4]. ADT induce cambios en la biología del cáncer de próstata que promueven su progresión al fenotipo de andrógenos refractario estado o el cáncer de próstata refractario a hormonas (CPRH), con una esperanza de vida asociada de sólo de 15 a 20 meses. No está claro cómo las células de cáncer de próstata en la transición de andrógeno-dependiente al estado independiente de andrógenos después de ADT. Entre los múltiples mecanismos implicados en eludir los efectos de la ablación de andrógenos, la activación de la señalización de la fosfatidilinositol-3-quinasa /Akt (PI3K /Akt) ha sido descrito como una vía central [5], [6], [7], [ ,,,0],8], [9]. Es importante destacar que los estudios clínicos han confirmado la importancia de la activación de Akt en la progresión del cáncer de próstata a la independencia de andrógenos y los pobres resultados clínicos [10], [11], [12], [13], [14].
Numerosos estudios han demostrado que, después de largo plazo ADT, las células del cáncer de próstata adquirir una neuroendocrino (NE) -al igual fenotipo que conduce a las poblaciones enriquecidas en células tumorales NE. células NE constituyen un componente menor de la glándula de la próstata normal y secretan varios neuropéptidos que pueden inducir efectos mitogénicos en las células cancerosas adyacentes en condiciones de andrógenos empobrecido en [15]. Aunque las células NE han sido descritos hace décadas, sus roles funcionales en la progresión del cáncer de próstata han recibido recientemente una atención considerable. biomarcadores tumorales séricos neuroendocrino y están regulados hasta después de ADT en pacientes con cáncer de próstata que indican un mal pronóstico [16], [17], [18], [19]. En consonancia con las observaciones clínicas, andrógenos diferenciación NE retirada inducida también se observa en los modelos de cultivo de células y animales [20], [21], [22], [23], [24], y el adenocarcinoma transgénico de la próstata modelo de ratón de próstata (TRAMP) cáncer muestra un marcado aumento de la población de células de próstata neuroendocrino con progresión de la enfermedad [25].
esfingosina 1-fosfato (S1P) es un mediador de lípidos que desempeña un papel regulador importante en el crecimiento de células tumorales, la supervivencia , la invasión y la angiogénesis [26]. El equilibrio entre los niveles celulares de S1P y sus precursores metabólicos ceramida y la esfingosina es considerado como un interruptor que podría determinar si una célula prolifera o sufre apoptosis o la detención del crecimiento [27]. Un regulador clave de este equilibrio es la esfingosina quinasa-1 (SphK1), la enzima de conversión de esfingosina en S1P. SphK1 cumple la doble función de producir el pro-crecimiento, S1P anti-apoptótica, y la disminución de los niveles intracelulares de ceramida pro-apoptóticos. Más apoyo a un papel para SphK1 en la promoción de cáncer, SphK1 se ha encontrado para actuar como un oncogén [28], su ARNm se sobreexpresa y se encontró inmunotinción positiva para SphK1 en diversos tumores [29], [30], [31], [ ,,,0],32], [33], y el aumento de la expresión SphK1 en biopsias de tumores se correlacionó con la tasa de supervivencia a corto en pacientes con glioblastoma y de mama [30], [34]. Además, SphK1 actividad enzimática y la expresión se incrementan notablemente en muestras de tumores de pacientes con cáncer de próstata (en comparación con sus homólogos normales) correlacionar con otros marcadores, tales como el nivel de PSA, el grado del tumor, así como con el resultado clínico después de la prostatectomía (Malavaud y Cuvillier, presentada). Mientras que la actividad SphK1 puede ser estimulada por una amplia gama de factores de crecimiento [26], hemos demostrado previamente en modelos celulares de cáncer de próstata y animales que Anticancer tratamientos (agentes quimioterapéuticos o radiaciones ionizantes) conducir a su inhibición lo que sugiere que SphK1 podría actuar un sensor para terapias contra el cáncer [35], [36], [37], [38].
en este estudio, hemos explorado el papel potencial de SphK1 en la regulación del crecimiento celular dependiente de andrógenos y la supervivencia de la hormona modelo de células de cáncer de próstata LNCaP sensible. Por primera vez, se muestra que la privación de andrógenos ejerce un efecto de contraste en SphK1. Si bien la eliminación de andrógenos corto plazo indujo una inhibición temporal de la SphK1, el agotamiento de andrógenos crónica activa una regulación de SphK1 se correlaciona con la diferenciación de las células LNCaP NE y C4-2B que apoyan la participación de SphK1 en la progresión hacia la independencia androgénica.
resultados
corto Plazo privación de andrógenos disminuye la proliferación celular en LNCaP - pero no en las células PC-3 - y se asocia con disminución
SphK1 Actividad
la proliferación celular se reduce notablemente en tiempo extra CSS (medio libre de andrógeno) tratados con células LNCaP en comparación con FBS (que contiene bajos niveles de andrógenos) células tratadas (Fig. 1A, panel izquierdo). Para apoyar los resultados de MTT, el recuento de células (Fig. 1A, panel central) y [
3H] timidina (Fig. 1A, panel derecho) mediciones confirmaron que las condiciones CSS tenían unos efectos dramáticos en el número de células y la síntesis de ADN que establecen que MTT podría ser utilizado como un índice de sustituto de la proliferación celular en nuestro modelo celular. Esto también se correlacionó con la secreción de PSA cuyo nivel se redujo fuertemente tanto en las células CSS-tratado en comparación con las células tratadas con FBS (Fig. 1B). Por el contrario, la privación de andrógenos no alteró el crecimiento de células hormono-refractario PC-3 (HR) cuyo crecimiento solamente fue alterada por la privación de suero (Fig. 1C) .Cuando comparación con las condiciones de FBS, el agotamiento de andrógenos en LNCaP inducida por una notable disminución en la actividad SphK1 dentro de las primeras 24 h (Fig. 1D, panel izquierdo). Más tarde, se observó un repunte de la actividad SphK1, que se convirtió significativa más allá de 4 días de tratamiento (Fig. 1D, panel izquierdo). En las células PC-3, una disminución significativa y duradera en la actividad SphK1 sólo se observó en condiciones de privación de suero (Fig. 1D, panel derecho). reflejando el impacto sobre la proliferación celular (Fig. 1C). Como se preveía en las células PC-3 que no son afectados por las condiciones de CSS, no hay cambios significativos SphK1 podrían ser evidenciadas (Fig. 1C, D).
Durante la noche el suero privados LNCaP (
Un
,
D
) y PC-3 (
C
,
D
) las células se incubaron en presencia de FBS al 5%, 5% CSS o sin suero (SFM) durante los tiempos indicados . La proliferación celular en LNCaP (
Un
,
panel de la izquierda
) y células PC-3 (
C
) se determinó mediante el ensayo de MTT y se expresaron como porcentaje de control al inicio del experimento (Día 0). El número de células (
Un
,
panel del medio
) y la síntesis de ADN (
Un
,
panel de la derecha
) se midieron como se describe en Materiales y Métodos.
Columnas
ha, con una media de al menos veinticuatro experimentos independientes para el ensayo de MTT y seis experimentos para el recuento celular y la síntesis de ADN;
bares, Dakota del Sur. Los valores de
P
entre los medios son los siguientes: ***,
P Hotel & lt; 0,001. nivel de PSA secretado se midió en medios de cultivo de las células LNCaP (
B Opiniones).
Columnas
ha, con una media de al menos seis experimentos independientes;
bares, Dakota del Sur. Los valores de
P
entre los medios son los siguientes: ***,
P Hotel & lt; 0,001.
D
, se determinó la actividad SphK1 tanto en células LNCaP y PC-3 y se expresó como por ciento de las células tratadas con FBS.
Columnas
ha, con una media de al menos doce y seis experimentos independientes para LNCaP y células PC-3, respectivamente;
bares, Dakota del Sur. El
Los valores P
entre los medios son los siguientes: ***,
P Hotel & lt; 0,001; **,
P Hotel & lt; 0,01; *,
P Hotel & lt; 0,05; ns, no significativa.
La eficacia de la castración en forma ortotópica xwnotransplantado SCID Los ratones se asocia con la inhibición SphK1
El efecto de la privación de andrógenos se examinó a continuación
in vivo
utilizando una implantación ortotópica quirúrgico (SOI) de LNCaP y PC-3 que sobreexpresan GFP células [36]. Nueve y tres semanas después de SOI LNCaP /GFP y PC-3 células /GFP, respectivamente, los ratones SCID fueron distribuidos aleatoriamente en dos grupos y sometidos a la castración o tratamiento simulado. Como se muestra por microscopía de gran aumento de un tumor LNCaP /GFP principal representante, la castración induce una disminución dramática en el volumen del tumor y la masa (Fig. 2A y B) dentro de los 7 días de tratamiento en comparación con los animales tratados con placebo. La eficacia de la castración se asoció con una disminución significativa en la actividad SphK1 en extractos de tejido (Fig. 2B, panel derecho). Además, el efecto sobre el tumor primario fue acompañado de una marcada reducción en la difusión de la metástasis en el grupo tratado con la castración (Tabla S1). Como era de esperar, la castración no afectó el desarrollo de tumores en ratones SCID xenotransplantados con células PC-3 /GFP (Fig. 2C). Las masas tumorales y los volúmenes fueron similares en ambos animales recibieron tratamiento simulado y castrados (Fig. 2D), y la actividad SphK1 (Fig. 2D, panel derecho) así como la difusión de metástasis (Tabla S1) fueron comparables en ambos grupos.
Nueve y tres semanas después de SOI LNCaP /GFP y células PC-3 /GFP, respectivamente, los ratones SCID fueron asignados al azar en dos grupos. Estos animales se sometieron entonces a la castración o tratamiento simulado. Representante LNCaP primaria fluorescente (
Un
) y PC-3 (
C
) tumores de los animales tratados sham- y la castración en el momento de (7 días después del tratamiento) autopsia. masa tumoral de LNCaP primaria extirpado (
B Opiniones,
panel de la izquierda
) y PC-3 (
D
,
panel izquierdo
) tumor de GFP-etiquetados .
Columnas
, significa de 8 animales;
bares, SE. SphK1 actividad se midió en extractos de tejidos obtenidos a partir de sham-, y la castración tratados LNCaP (
B Opiniones,
panel de la derecha
) y PC-3 (
D
,
panel de la derecha
) animales que portaban tumores.
Columnas
, significa de 8 animales;
bares, SE. El dos colas
Los valores P
entre los medios son los siguientes: ***,
P Hotel & lt; 0,001; o ns: no significativo.
SphK1 sobreexpresión hace que las células LNCaP menos sensibles a los andrógenos agotamiento
Debido a que se observó una inhibición de SphK1 durante la privación de andrógenos a corto plazo
in vitro
(Fig. 1D) y
in vivo gratis (Fig. 2B), se verificó si la transfección de células LNCaP con SphK1 podría hacer que estas células sean más resistentes a la depleción de andrógenos. La eficacia de transfección fue verificada mediante inmunotransferencia (Fig. 3A, panel izquierdo). Se aumentó la actividad de SphK1 SphK1 sobreexpresan (3A Fig., panel derecho) LNCaP a ~1100 pmol /min /mg de proteína (es decir, ~ 30 veces mayor en comparación con la de las células transfectadas vacío en vectores). El papel fundamental de la inhibición en el crecimiento celular SphK1 reducida se confirmó mediante ensayos de viabilidad celular, que mostró que LNCaP que sobreexpresan SphK1 fueron marcadamente menos sensible a los efectos del agotamiento de andrógeno (Fig. 3B). expresión concomitante, SphK1 cumplir se asoció con una mayor secreción de PSA en células LNCaP tratadas con CSS que reflejan sus efectos sobre la proliferación celular (Fig. 3C).
SphK1 expresión en células LNCaP se analizó mediante transferencia Western utilizando anti- FLAG (
Un
,
panel izquierdo
). Descansando actividad SphK1 se midió en LNCaP /neo y las células LNCaP /SphK1 (
Un
,
panel de la derecha
).
B Opiniones, se incubaron células LNCaP privadas de suero durante la noche en presencia de FBS al 5% o el 5% de CSS durante 6 días. A continuación se determinó la proliferación de la célula y se expresa como porcentaje de las células tratadas con FBS al 5%.
Columnas
ha, con una media de al menos doce experimentos independientes;
bares, Dakota del Sur. Los valores de
P
entre los medios son los siguientes: ***,
P Hotel & lt; 0,001.
C
, el nivel de PSA secretado se midió en medio de cultivo de LNCaP /Neo y células LNCaP /SphK1 después de 24 h de incubación en medio CSS 5%.
Columnas
ha, con una media de al menos seis experimentos independientes;
bares, Dakota del Sur. El
Los valores P
entre los medios son los siguientes: ***,
P Hotel & lt; 0,001
dihidrotestosterona rápida y transitoriamente Estimula SphK1 La actividad en un andrógeno. receptor /PI3 quinasa dependiente de Manner
Como la baja regulación de la actividad SphK1 se correlacionó con la eliminación de los andrógenos en células LNCaP (Fig. 1D), que era de interés para determinar si esto podría ser revertido por la Además de los andrógenos. En condiciones de CSS, la adición de la dihidrotestosterona (DHT) podría desencadenar una estimulación temprana y transitoria de SphK1 (tan pronto como 15 min) después de lo cual la actividad SphK1 volvió a los niveles basales (Fig. 4A). La rápida estimulación de SphK1 fue dependiente de la activación del /de señalización PI3K Akt, que se ha demostrado para mediar los efectos rápidos de andrógenos [39], [40]. De hecho, mientras que la wortmanina (WT) inhibió tanto la activación de Akt (Fig. 4B, parte superior) y SphK1 (Fig. 4B, parte inferior) inducida por la DHT, el inhibidor SphK1 SKI-2 no tuvo impacto en la fosforilación de Akt (Fig. 4B, la parte superior ). La estimulación de la vía PI3K /Akt /SphK1 vía era crítica para la transmisión de los efectos proliferativos de DHT en condiciones CSS. De hecho, similar a los WT inhibidores de PI3K y LY294002 (Fig. 4C), los inhibidores SphK1 SKI-2 y F-12509a podría impedir la proliferación celular inducida por DHT, la síntesis de ADN, así como la secreción de PSA (Fig. 4D).
Un
, las células LNCaP privadas de suero durante la noche se incubaron en condiciones CSS 5% y se trataron con 10 nM de DHT durante los tiempos indicados. actividad SphK1 se cuantificó y expresó como porcentaje de células no tratadas.
Columnas
ha, con una media de al menos seis experimentos independientes;
bares, Dakota del Sur. El
Los valores P
entre los medios son los siguientes: ***,
P Hotel & lt; 0,001; **,
P Hotel & lt; 0,01; ns, no significativo.
B
, las células LNCaP privadas de suero durante la noche se incubaron con 10 nM de DHT durante 45 minutos en presencia o no de 2,5 M SKI-2 o 200 nM wortmanina (WT). Los lisados celulares se analizaron para determinar fosfo-Akt y Akt expresión mediante análisis de transferencia Western. Se obtuvieron resultados similares en tres experimentos independientes (
Top of). privadas de suero durante la noche las células LNCaP fueron incubadas bajo condiciones CSS 5% y se trataron con o sin 10 nM de DHT y 200 nM wortmanina (WT) para los 45 min, y ensayaron para la actividad SphK1 (
inferior
).
Columnas
ha, con una media de al menos cinco experimentos independientes;
bares, Dakota del Sur. El
Los valores P
entre los medios son los siguientes: **,
P Hotel & lt; 0,01; ns, no significativo.
C
, las células LNCaP privadas de suero durante la noche se incubaron en FBS o en condiciones de CSS para 6 días con o sin 200 nM wortmanina (WT) o 1 M LY294002 en presencia o no de 10 nM DHT como se indica. La proliferación celular se determinó mediante el ensayo de MTT y se expresaron como porcentaje de control al comienzo del experimento (día 0).
Columnas
ha, con una media de al menos ocho experimentos independientes;
bares, Dakota del Sur. El
Los valores P
entre los medios son los siguientes: ***,
P Hotel & lt; 0,001; ns, no significativo.
D
, las células LNCaP privadas de suero durante la noche se incubaron en FBS o en condiciones de CSS con o sin 2,5 M de SKI-2 o F-12509a en presencia o no de 10 nM de DHT durante 24 h (
top
), 48 h (
medio) o 6 días (
parte inferior). nivel de PSA secretado se cuantificó 24 h después del tratamiento indicado (
Top of). la síntesis de ADN y la medición de la proliferación de células basado en MTT se expresaron como porcentaje de control al comienzo del tratamiento, 2 y 6 días, respectivamente.
Columnas
ha, con una media de al menos cinco experimentos independientes;
bares, Dakota del Sur. El
Los valores P
entre los medios son los siguientes: ***,
P Hotel & lt; 0,001; **,
P Hotel & lt; 0,01; o ns, no significativa.
El efecto del antagonista de los receptores de andrógenos se examinó junto con bicalutamida. Como se preveía, LNCaP respuesta de proliferación celular en 10 nM de DHT fue totalmente mitigado por 10 M bicalutamida (Fig. 5A). La estimulación DHT-disparado de la actividad SphK1 también se inhibió completamente en presencia de antagonista de los receptores de andrógenos (Fig. 5B).
privadas de suero durante la noche las células LNCaP fueron incubadas bajo condiciones CSS 5% y se trataron con o sin 10 mM bicalutamida en presencia o no de 10 nM de DHT para 2 (
Un
,
top of) o 6 días (
Un
,
parte inferior). mediciones de síntesis de ADN y el recuento de células se expresaron como porcentaje de control en el inicio del tratamiento.
B
, las células LNCaP privadas de suero durante la noche se incubaron con 10 nM de DHT durante 30 minutos en presencia o no de 10 M bicalutamida, y la actividad SphK1 se cuantificó y expresó como porcentaje de control en el inicio del tratamiento.
Columnas
ha, con una media de al menos cinco experimentos independientes;
bares, Dakota del Sur. El
Los valores P
entre los medios son los siguientes: ***,
P Hotel & lt; 0,001; **,
P Hotel & lt; 0,01; o ns, no significativa.
SphK1 está involucrado en andrógenos agotamiento inducido por neuroendocrino transdiferenciación de células LNCaP y C4-2B
A continuación se investigó la posible participación de SphK1 en la transición hacia estado refractario de andrógenos después de la retirada de andrógenos crónica. Con este fin, las células LNCaP y C4-2B, que han sido reportados previamente para adquirir una neuroendocrino (NE) fenotipo [20], [21], [23], [41], [42], [43] se mantuvieron bajo condiciones CSS para un máximo de 42 días. células LNCaP expuestas a un medio de hormonas deficientes fueron sometidos neuroendocrino (NE) cambios morfológicos (aparente después de aproximativamente 7-10 días) según lo indicado por la compactación del soma y el desarrollo de la larga y ramificada extensiones neuríticas (Fig. 6A), mientras que las células parentales de control LNCaP retenidos una morfología fusiforme epitelial (Fig. 6A). Además de las características morfológicas, transdiferenciaran células de cáncer de próstata NE-como se definen por la expresión de un número de productos incluyendo neurosecretoras cromogranina A (CGA) y enolasa específica de neuronas (NSE). CGA se considera que es el indicador más fiable de diferenciación prostática NE.
Un
, imágenes de contraste de fase representativas de las células LNCaP al inicio del experimento (día 0) y después de 42 días de incubación en condiciones despojado de carbón (día 42). Cromogranina A contenidos (CGA) se evaluó por inmunotransferencia en los tiempos indicados (
inferior) .Secreted enolasa específica de neuronas nivel (NSE) se midió en medios de cultivo de células LNCaP en los tiempos indicados (
del panel de la derecha
).
Columnas
ha, con una media de cinco experimentos independientes;
bares, Dakota del Sur. Las dos colas
valores de P
entre los medios son los siguientes: ***,
P Hotel & lt; 0,001. actividad SphK1 (
B Opiniones,
panel izquierdo
) se determinó en los tiempos indicados en las células LNCaP incubadas en condiciones de CSS.
Puntos
, media de cinco experimentos independientes;
bares, Dakota del Sur. Los valores de
P
entre los medios son los siguientes: ***,
P Hotel & lt; 0,001.
El recuadro
, el contenido de S1P, como se muestra por TLC.
Panel derecho
, expresión de SphK1, fosfo-Akt, Akt y se analizaron por Western Blot en los tiempos indicados. Se obtuvieron resultados similares en cinco experimentos independientes.
C
, expresión de la CGA y fosfo-Akt (
panel de la izquierda
) y la actividad SphK1 (
panel de la derecha
) se analizaron 10 días después del tratamiento o no con 1 M LY294002 o 200 nM wortmanina (WT) bajo condiciones tratado con carbón vegetal.
Columnas
ha, con una media de cinco experimentos independientes;
bares, Dakota del Sur. Las dos colas
valores de P
entre los medios son los siguientes: ***,
P Hotel & lt; 0,001.
D
, nivel NSE secretada se midió en medios de cultivo de 10 días después del tratamiento o no con 5 M SKI-2 en condiciones tratado con carbón vegetal (
panel de la izquierda
). La expresión de la ANM y la fosfo-Akt se analizaron por Western Blot (
panel de la derecha
).
Columnas
ha, con una media de cinco experimentos independientes;
bares, Dakota del Sur. El de dos colas
Los valores P
entre los medios son los siguientes:. **,
P Hotel & lt; 0,01
De acuerdo con observaciones anteriores [41], [44], inmunotransferencias mostraron que la expresión CgA fue muy baja en ambos LNCaP parental (Fig. 6A, panel inferior) y las células C4-2B (Figura S1), mientras que su nivel de expresión se mejora en gran medida con el tiempo en medio con hormonas deficiente. Además, en comparación con las células LNCaP no hormonas privado (D0), se encontró un aumento de 3 veces en la secreción de NSE para el medio después de 42 días en condiciones CSS indicativos de un fenotipo NE-como (Fig. 6A, panel derecho). Sobre la base de nuestras observaciones anteriores de que la actividad SphK1 sobre privación de andrógenos se inhibió sólo transitoriamente con un rebote significativo dentro de 4 días de incubación en medio de CSS (Fig. 1D), que a continuación analizamos la actividad SphK1 hasta 42 días durante el proceso de transdiferenciación NE. Sorprendentemente, la actividad SphK1 (Fig. 6B) aumentó progresivamente hasta un aumento de 4 veces después de 42 días de agotamiento de andrógenos. Esto se ilustra adicionalmente por un marcado aumento en el contenido de S1P (Fig. 6B, recuadro). En paralelo, la expresión de proteínas SphK1 se incrementó significativamente (Fig. 6B, panel derecho). La activación de SphK1 se correlacionó con la estimulación de Akt (Fig. 6B, panel derecho), una vía de señalización pro-supervivencia informado de que se regulado durante NE transdiferenciación de LNCaP inducida por el agotamiento de andrógenos [6], [7], [23 ], [45]. resultados comparables se observaron en el modelo celular C4-2B (Figura S1).
De acuerdo con estudios anteriores [6], la inhibición farmacológica de la vía PI3K /Akt podría impedir la transdiferenciación NE de ambos LNCaP (Fig. 6C ) y C4-2B (Figura S1) mantenida durante 10 días en condiciones de CSS. De nota, el bloqueo de la acumulación de CgA inducida por los inhibidores de PI3K WT y LY294002 se asoció significativamente con una disminución tanto en la fosforilación de Akt y la actividad SphK1 (Fig. 6C, panel de la derecha y la Figura S1).
Para investigar la papel funcional de SphK1 en el NE de la transdiferenciación, hemos examinado el efecto del inhibidor farmacológico SKI-2 en las células LNCaP y C4-2B. En presencia de SKI-2 (5 M), la distinta morfología NE-como observado fue abolida esencialmente con LNCaP que presenta una morfología redondeada con procesos celulares cortas rara vez ramificados (no mostrado). Además, tanto la secreción de NSE (Fig. 6D, panel izquierdo) y la acumulación de CgA (Fig. 6D, panel de la derecha y la Figura S1) se redujo marcadamente, mientras que la fosforilación de Akt se mantuvo sin cambios por lo tanto, lo que sugiere que la inhibición SphK1 puede en cierta medida bloquear la transdiferenciación NE .
agentes fisiológicos o farmacológicos que aumentan los niveles intracelulares de AMP cíclico (AMPc) pueden inducir el desarrollo de una morfología de NE en las células LNCaP o C4-2 en presencia de esteroides [41], [44], [46 ]. De nota, el aumento de cAMP se ha informado anteriormente que se asocia con la activación de SphK1 en osteoblastos [47]. Por lo tanto, hemos examinado el papel de cAMP como un potencial regulador de aguas arriba de SphK1 durante la NED. células LNCaP y C4-2B fueron estimuladas con forskolina el activador de la adenilato ciclasa (FSK) y el inhibidor de la fosfodiesterasa IBMX, o con epinefrina (Epi), un agonista del receptor β-adrenérgicos. El tratamiento con FSK /IBMX o Epi estimuló fuertemente la actividad SphK1 (Fig. 7A), y se correlacionó con el aumento de contenido de AMPc (Fig. 7B) y la adquisición de morfología NE (datos no mostrados) caracterizan bioquímicamente por la acumulación de CgA (Fig. 7C). Curiosamente, la inhibición de pharmacoligical SphK1 no tenía ningún efecto sobre los niveles de cAMP (Fig. 7B), mientras que se inhibe notablemente NED (Fig. 7C). Sorprendentemente, en las condiciones de privación de andrógenos, se observó un incremento similar en los niveles intracelulares de AMPc, que no pudo ser bloqueada por la inhibición farmacológica de SphK1 (Fig. 7D). Estos resultados evocan un papel de cAMP para la estimulación de la actividad SphK1 durante la NED.
Un
, se determinó la actividad SphK1 en las células LNCaP y C4-2B tratados durante 3 días en ausencia o en presencia de 10 M FSK /mM IBMX 10 o 10 mM Epi.
B Opiniones, las concentraciones intracelulares de cAMP fueron cuantificados en células LNCaP y C4-2B tratados durante 3 días con FBS al 5% o 10 mM FSK /mM IBMX 10 en ausencia o en presencia de 5 mM SKI-2.
C
, cromogranina A de contenido (CGA) se evalated por inmunotransferencia en extractos de células LNCaP y C4-2B incubadas durante 3 días con o sin 5 mM SKI-2 en presencia de FBS al 5%, 10 mM FSK /10 IBMX mM o 10 mM Epi. Resultados similares fueron obtenidos en tres experimentos independientes.
D
, las concentraciones intracelulares de cAMP fueron cuantificados en células LNCaP y C4-2B antes o 14 días después del tratamiento o no con 5 M SKI-2 en condiciones tratado con carbón vegetal.
Columnas
ha, con una media de tres experimentos independientes;
bares, Dakota del Sur. El dos colas
Los valores P
entre los medios son los siguientes: ***,
P Hotel & lt; 0,001; *,
P Hotel & lt; 0,05; o ns, no significativa.
Con el fin de determinar si el
in vitro
conclusiones de la posible participación de SphK1 en la diferenciación NE tenía alguna relevancia para la enfermedad humana, secciones de un representante paciente sometido a resección transuretral paliativos para la recurrencia local bajo bloqueo androgénico completo Inmunomarcamos CGA y expresión SphK1 (Fig. 8). tinción SphK1 se restringió a citoplasma con algunas células de ser más intensamente teñida que los otros (Fig. 8B, punta de flecha abierta). estroma fibromuscular no se tiñeron positivo para SphK1. Se observó tinción CgA en una minoría de las células de cáncer, aproximadamente el 10%, en forma de granuli secretoras (H, Fig. 8D). Co-expresión de CGA en azul con marrón SphK1 dio lugar a una intensa señal de color marrón oscuro (punta de flecha sólida). Nota en la Fig. 8A (parte inferior) y en la Fig. 8C, la apariencia similares a neuronas de la célula de doble etiquetado cáncer (flecha sólida).
inmunotinción doble con anti-SphK1 (marrón) y anti-EGI (azul) de un espécimen de resección cosechadas en un yo 84 hombre con cáncer de próstata T4NxM1 bajo bloqueo androgénico completo. PSA sérico bajo y NSE suero positivo sugirieron cáncer poco diferenciado con características neuroendocrinas, según lo confirmado por el examen patológico de la muestra resecada mostrando el cáncer de próstata de alto grado (Gleason 9) con tinción positiva para CGA. Azul característico secreción granular de la diferenciación neuroendocrina se colocalized con reactividad marrón SphK1 inmune en células similares a neuronas (punta de flecha sólida).
La transición al estado refractario de andrógenos durante el agotamiento de andrógenos crónica se caracteriza
In vitro
por una pérdida de respuesta de las células andrógeno-privada a cualquiera de FBS o DHT [20]. Tan pronto como 7 días y a los 14 días de la abstinencia de andrógenos, LNCaP fueron totalmente no responde después de la transferencia a las condiciones de FBS o cuando se tratan con DHT con respecto a la proliferación celular (Fig. 9A, panel izquierdo) o la secreción de PSA (Fig. 9A, derecha panel). Sin embargo, el fenotipo NE-como es reversible tras la reposición de los medios con suero completo durante varias semanas [20]. Cuando LNCaP andrógeno-agotado durante 42 días se cambió de nuevo a medio normal FBS, el crecimiento celular se reanudó durante el período de la semana siguiente y, dentro de los próximos 21 días en medio de FBS, la morfología celular volvió a la de las células LNCaP parentales (datos no mostrado). Como se demuestra en la Fig. 8B, estas células eran ahora no sólo capaz de crecer normalmente y secretar PSA en presencia de FBS como LNCaP parental (Fig. 1A), sino también para responder de nuevo a la adición de DHT en condiciones CSS similares a las células parentales (Fig. 4C y RE). Curiosamente, la reversibilidad inducida por la reposición de los medios de comunicación con suero completa durante 21 días se asoció con una profunda baja regulación de la actividad SphK1 (Fig. 9C), que volvió a los niveles encontrados en las células parentales. **,
P Hotel & lt; 0,01; bares, Dakota del Sur. bares, Dakota del Sur. bares, Dakota del Sur.