Extracto
Las epotilonas son una nueva clase de microtúbulos agentes con actividad preclínica y clínica prometedora estabilización. Su diana celular es β-tubulina y factores que influyen en la sensibilidad intrínseca a epotilonas no se conocen bien. En este estudio, la importancia funcional de isotipos específicos beta-tubulina en la sensibilidad intrínseca a la epotilona B se investigó mediante siRNA desmontables gen contra βII-, βIII- o βIVb-tubulinas en dos líneas de células independientes del cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC), NCI-H460 y Calu-6. ensayos clonogénicos tratados con fármaco-mostraron que la sensibilidad a la epotilona B no se alteró siguiente desmontables de βII-tubulina en ambas líneas celulares de NSCLC. Por el contrario, desmontables de βIII-tubulina se incrementó significativamente la sensibilidad a la epotilona B. Curiosamente, caídas βIVb-tubulina fueron significativamente menos sensibles a la epotilona B, en comparación con las células control maqueta y siRNA. Análisis del ciclo celular de las células desmontables βIII-tubulina mostró un mayor porcentaje de muerte celular con concentraciones de epotilona B tan bajas como 0,5 nM. En contraste, las células desmontables βIVb-tubulina muestran una disminución en G inducida por B epotilona
2-M acumulación del ciclo celular en comparación con las células control siRNA. Es importante destacar que, caídas βIII-tubulina muestran un aumento significativo dependiente de la dosis en el porcentaje de células apoptóticas después del tratamiento con epotilona B, tal como se detecta usando la caspasa 3/7 actividad y la tinción con anexina-V. Se requieren concentraciones más altas de la epotilona B para inducir la apoptosis en las caídas βIVb-tubulina comparación con el control siRNA, destacando un mecanismo potencial subyacente disminución de la sensibilidad a este agente. Este estudio demuestra que los isotipos específicos beta-tubulina pueden influir en la sensibilidad a la epotilona B y pueden influir en la sensibilidad diferencial a este nuevo agente prometedor
Visto:. Gan PP, Mccarroll JA, FL Byrne, Garner J, M Kavallaris (2011 específicos) ß-tubulina isotipos Puede Funcionalmente aumentar o disminuir la sensibilidad epotilona B en células no pequeñas células del cáncer de pulmón. PLoS ONE 6 (6): e21717. doi: 10.1371 /journal.pone.0021717
Editor: Paraskevi Giannakakou, Weill Cornell Medical College de la Universidad de Cornell, Estados Unidos de América
Recibido: 13 Octubre, 2010; Aceptado: June 9, 2011; Publicado: 29 Junio 2011
Derechos de Autor © 2011 Gan et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. El cáncer infantil Australia Instituto para la Investigación médica, que está afiliada a la Universidad de Nueva Gales del Sur y el hospital Infantil de Sydney y subvenciones del Consejo de cáncer de Nueva Gales del Sur (MK). Endeavour Internacional de Becas de Investigación de posgrado (PPG), Universidad de Nueva Gales del Sur Facultad de Medicina de la Beca (JAM), Universidad de Nueva Gales del Sur Facultad de Premio de Medicina Investigación de Carrera Temprana (JAM), Premio Balnaves (JAM), Premio Anthony Rothe Postgrado (JLB ), y por un NHMRC superiores de becas (MK). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. MK, PPG y mermelada, solicitud de patente 20100159030 métodos para detectar y modulando la sensibilidad de las células tumorales a los agentes anti-mitótico y para la modulación de la tumorigenicidad 06/24/2010. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE en los datos y materiales de uso compartido.
Introducción
Los taxanos (incluyendo paclitaxel y docetaxel) son establecidos fármacos ampliamente utilizados en el tratamiento de varios tipos de tumores sólidos, incluidos los de ovario, de mama, de pulmón y cáncer de cabeza y cuello, de forma individual o en combinación con otros agentes quimioterapéuticos. El éxito clínico de los taxanos ha proporcionado el impulso para buscar otros nuevos agentes con propiedades similares pero con una eficacia mejorada. Las epotilonas son una nueva clase de agentes estabilizadores de microtúbulos sin taxanos que han mostrado actividad contra el cáncer prometedor. Entre ellos, el análogo de la epotilona B, ixabepilona (BMS-247550, aza-EPOb) fue aprobada en 2007 por la Administración de Alimentos y Medicamentos para el tratamiento del cáncer de mama metastásico o localmente avanzado resistentes a las antraciclinas, taxanos y capecitabina, ya sea solos o en combinación con estos agentes [1]. La epotilona B de origen natural (patupilone, EPO906), también ha mostrado actividad prometedora en varios modelos preclínicos que son resistentes a la quimioterapia basada en taxanos y actualmente está en fase II /III de ensayos clínicos [2], [3], [4], [5]. A pesar de poca similitud estructural entre las epotilonas y los taxanos, ambos agentes comparten el mismo o un sitio de unión de solapamiento de β-tubulina [6], [7]. Similar a los taxanos, las epotilonas inducen microtúbulos agrupación [6], suprimir la dinámica de microtúbulos; conduce a la inhibición de la proliferación celular y el bloque mitótico [8]. Aunque epotilonas y taxanos estabilizan los microtúbulos contra la despolimerización, presentan claras diferencias en la actividad y la eficacia (revisado en [9], [10]).
Ambos epotilonas y taxanos pueden estabilizar los microtúbulos contra la despolimerización, sin embargo, presentan claras diferencias en la actividad y la eficacia (revisado en [9], [10]). Las razones de las diferencias en la actividad, son poco conocidos. Hasta la fecha, los estudios se han centrado en la resistencia adquirida a epotilonas usando poblaciones seleccionadas de drogas que exhiben múltiples mecanismos de resistencia que incluyen cambios en la expresión isotipo tubulina y mutaciones en β-tubulina [11], [12], [13], [14]. Hemos descrito previamente células epotilona B analógicas resistentes leucemia que exhiben múltiples alteraciones microtúbulos incluyendo aumento de la expresión de βIII-tubulina, una mayor expresión de MAP4, y las mutaciones en βI-tubulina [13]. Mientras que la resistencia adquirida a epotilonas se ha descrito, la investigación sobre los factores intrínsecos que median la sensibilidad a las epotilonas y relacionados con la diana celular de la droga, la tubulina, han sido escasos. A medida que progresan estos agentes a la clínica, es importante entender cómo esta clase de compuesto interactúa con diferentes isotipos de tubulina y cómo los niveles de estas proteínas intrínseca influir en la eficacia
.
El uso de la tecnología del RNAi, hemos demostrado previamente que βIII-tubulina media la sensibilidad a paclitaxel y
Vinca
alcaloides en las células NSCLC [15]. Silenciamiento de la expresión de βII- y isotipos βIVb-tubulina, por otra parte, mejorar la sensibilidad de estas células a
vinca alcaloides
pero no paclitaxel [16]. evidencia correlativa que la regulación positiva de βIII-tubulina no media la resistencia a la epotilona B También se ha informado [12]. Sin embargo, la sobreexpresión de βIII-tubulina en las células HeLa hace que las células menos sensibles a epotilona B [17]. No se sabe si la expresión diferencial de la β-tubulina isotipos respuesta influencia para epotilonas. La comprensión de esta interacción es muy deseada para el desarrollo de marcadores predictivos para proporcionar una terapia más personalizada para los pacientes con CPNM y otros pacientes que están siendo tratados con epotilonas.
Para investigar la importancia funcional de estos isotipos de beta-tubulina en respuesta a la epotilona B en NSCLC, se empleó la tecnología del RNAi desmontables específicamente la expresión de estos isotipos en dos líneas celulares de NSCLC independientes y caracterizar los efectos sobre la morfología celular, sensibilidad a la epotilona B y la apoptosis inducida por fármacos.
Materiales y Métodos
cultivo celular, transfección siRNA y citotóxica de drogas
H460 y se obtuvieron Calu-6 de la ATCC (Manasés, VA, EE.UU.) y se mantuvieron como se ha descrito anteriormente [15]. Las líneas celulares son rutinariamente y libres de micoplasma. Todos los procedimientos de transfección se realizaron como se informó anteriormente [15]. La potencia y especificidad de los siRNAs dirigidos cada isotipo β-tubulina se han validado anteriormente [15], [16]. Epotilona B (Calbiochem, Merck Biosciences) se preparó a una concentración de stock de 100 mM en DMSO.
Inmunofluorescencia tinción
fueron tratados brevemente, transfectadas con siRNA Calu-6 células que crecen en portaobjetos de cámara de vidrio con epotilona B en las concentraciones indicadas de 1 h. Después se realizó la tinción de inmunofluorescencia de las células siRNA-transfectadas como se ha descrito anteriormente [15], [16].
ensayos por clonación tratados con las drogas
ensayos por clonación tratados con las drogas se realizaron como se describe anteriormente [15 ], [dieciséis]. Los resultados se expresaron como una fracción de supervivencia y la dosis inhibidora (ID
50) se extrapoló a partir de la curva dosis-respuesta utilizando el programa GraphPad Prism [15], [16].
análisis del ciclo celular
Para el análisis del contenido de ADN mediante tinción con yoduro de propidio, H460 y Calu-6 células fueron sembradas en placas de 6 pocillos que contienen 6 × 10
4 células por pocillo y se transfectaron con ARNsi. Después de 72 h de transfección, las células fueron expuestas a la epotilona B en las concentraciones indicadas durante 24 h. En el día del análisis, se recogieron las células tanto adherentes y flotantes, se lavaron con PBS y se fijaron con etanol al 80% durante al menos 24 horas a 4 ° C. Las células fijadas fueron teñidas con una solución que contiene /yoduro de propidio 50 mg ml y 2 mg /ml de RNasa libre de DNasa durante 30 minutos a 37 ° C en la oscuridad. contenido de ADN se midió por un citómetro de flujo FACSCalibur (BD). Se utilizó el programa CellQuest para cuantificar la distribución de células en cada fase del ciclo celular: sub-G
1 (muertos o fragmentada), G
1, S y G
2-M [15], [ ,,,0],16].
ensayos de apoptosis
apoptosis celular se determinó por medición de la caspasa 3/7 actividad utilizando el ensayo de la caspasa 3/7-Glo como se ha descrito previamente con ligeras modificaciones [18], [19 ]. Brevemente, las células fueron transfectadas con siRNA durante 24 h y se volvieron a sembrar en placas de 96 pocillos (5 x 10
3 células /pocillo) y se dejaron adherir durante 24 h más. Las células se trataron entonces con diferentes concentraciones de epotilona para 24 h. Después del tratamiento, las células se incubaron con la caspasa-Glo 3/7 reactivo durante 2 h a temperatura ambiente, y la luminiscencia se midió con un luminómetro (Victor PerkinElmer 3). Además, la apoptosis también se determinó mediante tinción con anexina V kit-FITC (Becton Dickinson) como se describe anteriormente [15], [19].
El análisis estadístico
Los datos se expresan como la media ± SEM y se analizaron mediante ANOVA o
t de Student
seguido de Dunnett o no paramétrico de Mann-Whitney pruebas utilizando el programa GraphPad Prism. Un valor de p menor de 0,05 fue considerado estadísticamente significativo.
Resultados
sensibilidad diferencial a la epotilona B siguiendo βII-, βIII- o desmontables βIVb-tubulina
La especificidad de cada de la β-tubulina siRNA se confirmó a nivel de proteínas (Figura S1). De acuerdo con nuestros estudios anteriores, βII-, βIII-, y siRNA inhibió la expresión de proteínas βIVb-tubulina de cada uno de estos objetivos, respectivamente, sin afectar a la expresión de otros isotipos principales beta-tubulina en las líneas celulares de NSCLC (Figura S1) [15] , [dieciséis]. Para investigar los efectos de estos isotipos de beta-tubulina en respuesta a la epotilona B en células de NSCLC y para cuantificar los cambios en la sensibilidad al fármaco, se realizaron ensayos clonogénicos tratados con el fármaco. Desmontables expresión βII-tubulina, tanto en H460 y Calu-6 células no afectó la sensibilidad a la epotilona B (fig. 1A). Por el contrario, desmontables de βIII-tubulina sensibilizado significativamente ambas líneas celulares de cáncer a la epotilona B (fig. 1B). Recientemente, hemos descrito el desarrollo y caracterización de H460 células seleccionadas para la expresión estable de shRNA contra βIII-tubulina, y el aumento de la sensibilidad de estas células a paclitaxel, cisplatino y carboplatino su análogo [19]. Es importante destacar que el aumento de la sensibilidad a la epotilona B usando caída transitoria de βIII-tubulina también se confirmó usando las células estables H460 βIII-tubulina shRNA desmontables (Figura S2), fortaleciendo aún más nuestros resultados con este isotipo. Curiosamente, desmontables de βIVb-tubulina redujo significativamente la sensibilidad a la epotilona B en ambas líneas celulares, en comparación con las células control y maqueta siRNA-transfectadas (Fig. 1C), lo que sugiere que los tumores que expresan altos niveles de este isotipo pueden ser más sensibles a epotilona B que los tumores con niveles bajos de este isotipo.
ensayos clonogénicos se realizaron en (cuadrados cerrados, línea continua) simuladas, controlar siRNA (cuadrados abiertos, línea continua) y células transfectadas siRNA-isotipo beta-tubulina específicos (cerrado diamantes, línea discontinua) en dos líneas celulares de cáncer, H460 (panel izquierdo) y Calu-6 (panel derecho). Los gráficos muestran la supervivencia clonogénica de (A) βII-tubulina; las células (B) βIII-tubulina y (C) desmontables βIVb-tubulina expuestos a epotilona expresan como fracción de supervivencia. Bares, media ± SEM de al menos cuatro ensayos individuales. Las estadísticas se calcularon mediante la comparación de la fracción superviviente de las células desmontables con las células transfectadas de manera simulada en cada concentración de fármaco. *
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También examinamos los efectos diferenciales de la epotilona B en microtúbulos y la morfología celular en βII -, βIII- y desmontables células βIVb-tubulina. Como se muestra en la figura S3, todas las células siRNA transfectadas no tratadas no mostraron cambios evidentes en las estructuras de microtúbulos, en concordancia con nuestros estudios anteriores [15], [16]. Sin embargo, la epotilona B (5 nM) tuvo un efecto marcado en las células con los microtúbulos empobrecido βIII-tubulina. haces de microtúbulos fueron más prominentes en las células desmontables βIII-tubulina. Por el contrario, las redes de microtúbulos permanecieron en gran parte intacta organizados y en el control de siRNA, βII- y desmontables células βIVb-tubulina tratado a la misma concentración. A los 20 epotilona B nM, tanto desmontables células βII-tubulina control y comienzan a exhibir haces de microtúbulos en comparación con las caídas βIVb-tubulina. Estos resultados complementan los datos clonogénico y sugieren que las células responden de manera diferente a la epotilona B después de caída específica de cada isotipo individuo β-tubulina.
Desmontables de βIII-tubulina reduce la detención del ciclo celular inducida epotilona B y aumenta la muerte celular
análisis del ciclo celular se realizó siguiente para determinar si desmontables de cada uno de los perfiles del ciclo celular influencias isotipo beta-tubulina en la presencia de la epotilona B para 24 h. Cuando se trata con concentraciones tan bajas como 0,5 nM epotilona B, las células desmontables βIII-tubulina mostraron un aumento significativo en sub-G
1 contenido, indicativo de la muerte celular (Fig. 2). Una mayor diferencia se observó con 20 epotilona B nM, con el control siRNA- y las células tratadas con siRNA βII-tubulina que muestran una marcada G
bloque 2-M mientras que las células desmontables βIII-tubulina muestran un aumento en el sub-G
1 población (Fig. 2). desmontables células βIII-tubulina tuvieron menos células que se acumulan en G2-M en comparación con los controles, lo que sugiere que la muerte celular puede estar ocurriendo independiente de la detención mitótica. Es evidente que desmontables de βIII-tubulina aumenta fuertemente la sensibilidad a la epotilona B a través de aumento de muerte celular debido a que el sub-G
1 población se incrementó en todas las concentraciones ensayadas. En desmontables células βIVb-tubulina, por otra parte, se observó un menor contenido de G
2-M en comparación con las células tratadas con ARNsi de control en 20 epotilona B nM (Fig. 2). El sub-G
1 contenido no difirió entre desmontables βIVb-tubulina y las células tratadas con siRNA control a 20 nM. Por el contrario, desmontables de βIVb-tubulina, mostró un menor número de células bloqueadas en G
2-M, confirmando de este modo la disminución de la sensibilidad de estas células a la epotilona B.
Las concentraciones de fármaco se indicaron en la parte superior de la figura. Las células se recogieron después de tratamiento de drogas 24 h y posteriormente se analizaron para su contenido de ADN por citometría de flujo como se describe en Materiales y Métodos. se dan cifras representativas de cuatro experimentos independientes. *
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Para determinar si G inducida por B epotilona
2-ciclo celular M retraso se produce en los puntos de tiempo anteriores, el análisis del ciclo celular usando H460 y Calu-6 células se realizó a 4, 8 y 12 h en presencia o ausencia de la epotilona B (20 nM). En presencia del fármaco, se observó G
detención del ciclo celular 2-M ya en 4 h para células H460 (Tabla S1) y 8 h para Calu-6 células (Tabla S2) tanto en knockdown βIII-tubulina y Control de siRNA-transfectadas las células. A las 8 y 12 h el porcentaje de células H460 bloqueados en G
2-M fue menor que en el control (Tabla S1), aunque una tendencia similar no se observó en las células Calu-6 (Tabla S2).
sensibilidad a la epotilona B se correlaciona con el nivel de inducción de la apoptosis
para determinar si el aumento o disminución de la sensibilidad a la epotilona B específica para cada isotipo β-tubulina estaba relacionado con la inducción de apoptosis, se midió la actividad de la caspasa 3/7 en estas células después de tratamiento de drogas 24 h. Caspasa 3/7 actividad en las células desmontables βIII-tubulina se aumentó al menos 2 veces más que en las células siRNA transfectadas de control en todas las concentraciones ensayadas (Fig. 3). La actividad de la caspasa aumentado en los desmontables células βIII-tubulina correlacionados con el aumento de la muerte celular observada en estas células por tratamiento de drogas. Por el contrario, la caspasa 3/7 actividad se mantuvo en niveles de fondo en βII- y desmontables células βIVb-tubulina, de forma similar a las células de control de siRNA en ≤1 nM epotilona B. Es importante destacar que hubo una disminución significativa en la actividad de caspasas en las células βIVb desmontables en ≥2 nM, lo que sugiere las caídas βIVb-tubulina fueron menos sensibles a la apoptosis inducida por la epotilona.
siRNA-transfectadas se cosecharon células H460 después de 24 h de incubación en presencia o ausencia de epotilona B y, posteriormente, se ensayó la apoptosis inducción por ensayo de actividad caspasa. Las barras abiertas: células siRNA transfectadas de control; ligeras barras sólidas grises: desmontables células βII-tubulina; sólidas barras negras: desmontables células βIII-tubulina; bares oscuros sólidos grises: desmontables células βIVb-tubulina. Los datos representan medias ± SEM de al menos tres experimentos independientes. *
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Para definir mejor el papel de los isotipos de beta-tubulina de epotilona B inducida por la apoptosis, también se llevó a cabo con anexina V-FITC tinción tras 48 h tratamiento con epotilona B. Como se muestra en la Fig. 4A, el tratamiento de βIII-tubulina desmontables células H460 inducen apoptosis de una concentración tan baja como 320 pM de epotilona B. El porcentaje de células apoptóticas fue significativamente mayor en las células tratadas con siRNA βIII-tubulina que en el control, o βII- βIVb- células tubulina siRNA-tratado en todas las concentraciones ensayadas (Fig. 4A). Por el contrario, se necesita una mayor concentración de epotilona B para inducir la apoptosis en las células desmontables βIVb-tubulina en comparación con cualquiera de las células siRNA transfectadas βII-tubulina (Fig. 4B) de control o. Tomados en conjunto, estos datos muestran que el aumento de la inducción de apoptosis podría ser uno de los mecanismos que subyacen a la hipersensibilidad a la epotilona B tras caída βIII-tubulina. Desmontables de βIVb-tubulina, por el contrario, disminuye la sensibilidad a la epotilona B inducida por la inducción de apoptosis en el CPNM
Las barras abiertas: el control de las células transfectadas con siRNA-;. ligeras barras sólidas grises: desmontables células βII-tubulina; sólidas barras negras: desmontables células βIII-tubulina; bares oscuros sólidos grises: desmontables células βIVb-tubulina. Nota epotilona B fue capaz de inducir apoptosis en las células knockodown βIII-tubulina a concentraciones tan bajas como 24:32 (A), mientras que las concentraciones más altas de epotilona B inducen apoptosis significativamente menor en las células desmontables βIVb-tubulina (B). Los datos representan medias ± SEM de al menos tres experimentos independientes. *
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Discusión
Las epotilonas representan una nueva clase de agentes estabilizantes de microtúbulos que potencialmente podrían proporcionar otro enfoque para superar la resistencia a paclitaxel. Epotilonas han mostrado prometedora actividad clínica en un ensayo de fase II en pacientes con NSCLC [20] y han sido recientemente aprobado para su uso en el cáncer de mama metastásico. No se sabe cómo esta clase de compuesto interactúa con diferentes isotipos de tubulina y cómo éstos sensibilidad influencia epotilona B. Aquí en, mostramos que los isotipos específicos beta-tubulina afectan de forma diferente a la sensibilidad de las células NSCLC epotilonas (Tabla 1).
A pesar de que la expresión alterada de los isotipos de beta-tubulina se ha asociado ampliamente con la resistencia taxano, información limitada está disponible en el papel de los isotipos de beta-tubulina en la sensibilidad a las epotilonas. En este estudio, βII-tubulina no afectó a la sensibilidad a la epotilona B en cualquiera de las dos líneas independientes de las células de NSCLC examinadas, las células H460 y Calu-6. Curiosamente, no parece estar influenciada por la sobreexpresión o supresión de la expresión βII-tubulina [16], [21] sensibilidad a los microtúbulos agente estabilizante paclitaxel. Este resultado contrasta con nuestro estudio previo examen de
vinca alcaloides, donde
supresión de βII-tubulina aumenta la sensibilidad a estos agentes [16].
preclínicos y estudios clínicos han demostrado previamente que la resistencia a los medicamentos a las PT a menudo se asocia con la regulación positiva βIII-tubulina (revisado en [10], [22]). Se ha especulado y pruebas correlativas que los efectos citotóxicos de epotilonas son independientes de expresión βIII-tubulina debido a su actividad en βIII-tubulina células que sobreexpresan
in vitro Opiniones y en modelos de xenoinjertos humanos [9], [12] . Sin embargo, la evidencia definitiva no se ha demostrado que la actividad de epotilona es realmente independiente de la expresión βIII-tubulina. Utilizando la tecnología de ARNi, se muestra que desmontables de βIII-tubulina conduce a un aumento significativo en la sensibilidad a la epotilona B. De acuerdo, se encontró que la sobreexpresión estable de βIII-tubulina en las células HeLa para conferir resistencia a una amplia gama de las PT incluyendo epotilona B [17 ]. Un informe describió líneas celulares de cáncer de ovario resistente epotilona con una disminución de la expresión βIII-tubulina [12]. La resistencia a fármacos son los modelos de líneas celulares diferentes multifactoriales y podría ser responsable de las diferencias. Es importante destacar que también se observaron otros cambios en los isotipos de beta-tubulina y mutaciones puntuales βI-tubulina en las líneas de células B resistentes a epotilona [12], lo que sugiere que estos factores también podrían haber contribuido al fenotipo resistente. Hemos descrito previamente células de leucemia resistentes epotilona B analógicos que muestran múltiples alteraciones microtúbulos incluyendo aumento de la expresión de expresión βIII-tubulina y mutaciones βI-tubulina [13]. Hasta la fecha, las contribuciones de los mecanismos de resistencia de epotilona B adquirida no han sido bien correlacionada con la sensibilidad intrínseca a epotilonas. Cabe destacar que las dos células de NSCLC independientes utilizadas en el estudio actual ni han sido sometidas a la selección de medicamentos antes ni expresar P-glicoproteína (datos no mostrados) y por lo tanto proporcionar una oportunidad para evaluar la sensibilidad a la epotilona B conferida por cada uno de los β isotipos de tubulina examinado.
Curiosamente, mientras derribando βIII-tubulina hypersensitizes las células de la epotilona B, desmontables de βIVb-tubulina se redujo la sensibilidad de las células de NSCLC de epotilona B. Recientemente, Cabral y compañeros de trabajo tienen informaron de que las células que sobreexpresan βIVb-tubulina exhibieron un aumento pequeño pero significativo en la sensibilidad a la epotilona a [23]. Tomados en conjunto con nuestro estudio, la expresión βIVb-tubulina puede ser un indicador terapéutico favorable para la terapia de la epotilona B. Hemos demostrado anteriormente que desmontables de βII- y βIVb-tubulinas en las células NSCLC utilizados en este estudio no afectó significativamente la sensibilidad paclitaxel, pero aumentó significativamente la sensibilidad a alcaloides de la vinca [16]. Por lo tanto, a pesar de paclitaxel y el intercambio de la epotilona B se solapan sitios de unión en β-tubulina, los niveles de expresión βIVb-tubulina provocan distintos efectos sobre la sensibilidad a paclitaxel y epotilona B. Hay una creciente evidencia que muestra que la unión de epotilonas y paclitaxel a tubulina puede no ser idéntica [13], [24]. Evidentemente, algunas mutaciones puntuales en la subunidad paclitaxel confieren β-tubulina pero no resistencia epotilona en modelos de cultivo celular [7], [25], lo que sugiere que las epotilonas y taxanos pueden tener interacciones distintas con isotipos de beta-tubulina. Una racionalización de las diferencias en la sensibilidad inducida por la expresión isotipo β-tubulina puede estar relacionada con las diferencias de amino ácido entre los isotipos. isotipos de beta-tubulina βI, βII, βIVa y βIVb, comparten al menos 95% de identidad y tienen un número limitado de sustituciones no conservativas de aminoácidos (Figura S4) [26]. Por el contrario, βIII-tubulina difiere ya que comparte solamente 92% de identidad con los isotipos de β-tubulina anteriores. Dentro del paclitaxel /unión epotilona bolsillo, en βII y βIVb isotipos, Ser275 se ha implicado como un mediador de la difusión de paclitaxel a través de nanoporos [27] y pueden formar enlaces de hidrógeno con Gln279 y Lys216, la estabilización de la M-bucle (Fig. 5). A su vez, esto puede mejorar los enlaces de hidrógeno que se observan entre Arg276 al carbonilo de la lactona y Thr274 al oxígeno cetona en C5 de la epotilona A (y, presumiblemente, la epotilona B). En βIII-tubulina, hay una mutación Ser275Ala que podría desestabilizar el M-bucle y con ello debilitar los enlaces de hidrógeno Arg226 y Thr274 con el ligando, lo que contribuye a su reducción de la sensibilidad. Sin embargo, esto no explica la sensibilidad diferencial observada entre βIII-tubulina y βIVb, como las secuencias de aminoácidos identificadas como importantes dentro del paclitaxel /epotilona bolsillo de unión, o el PIB sitio de unión no difieren entre estos dos isotipos [24]. El estudio actual no se puede excluir la posibilidad de que la expresión diferencial de isotipos específicos beta-tubulina afecta a la unión de epotilonas a la pared de microtúbulos, oa través de la estabilización de los contactos entre los dímeros en la formación de protofilamentos. Sin embargo, un estudio reciente con epotilona A mostró que se une igualmente bien a ambos βI- y βIII-tubulina [28]. Un estudio similar examinar la unión de epotilona B y isotipos específicos beta-tubulina sería importante para determinar cómo afectan estos isotipos de la interacción de esta droga con la tubulina.
La epotilona B se muestra como palos (carbonos de color gris claro). Los residuos del bolsillo de unión de 1TVK se muestran como palos (carbonos de color gris oscuro). hidrógenos no polares se omiten para mayor claridad. Los enlaces de hidrógeno se muestran como líneas discontinuas verdes. Ser275 puede formar enlaces de hidrógeno con 3 Gln292 y Lys216. Las imágenes generadas en DS 3.0 Modelado (Accelrys®).
La actividad antitumoral de epotilonas está mediada por la supresión de la dinámica de los microtúbulos, detención de la mitosis en la fase G
2-M del ciclo celular seguido de la apoptosis. Para hacer frente a los posibles mecanismos que subyacen a la respuesta diferencial a la epotilona B siguiente desmontables de un isotipo específico β-tubulina, examinamos la propensión de las células a someterse a la detención del ciclo celular inducida por fármaco y la apoptosis. Después de la incubación con epotilona B, desmontables βIII-tubulina mostró un aumento en la sub-G
1 poblaciones (muerte celular), mientras que una disminución en G bloque
2-M en comparación con las células siRNA transfectadas de control. Desmontables de βIII-tubulina puede reducir significativamente la extensión de bloque mitótica inducida por incubación con paclitaxel o vincristina [15], mientras que el aumento del nivel de muerte celular. El efecto sobre la sensibilidad a la epotilona B no puede explicarse simplemente por un cambio en la dinámica de microtúbulos, como recientemente hemos demostrado que la dinámica de los microtúbulos no cambian en células H460 siguiente knockdown βIII-tubulina [29]. En conjunto, estos estudios demuestran que desmontables de βIII-tubulina puede aumentar la muerte celular apoptótica inducida por TBA través de una vía separada, que es independiente de la detención mitótica. Otro estudio ha demostrado que los efectos anti-tumorales de paclitaxel, correlacionados con la apoptosis paclitaxel inducida pero no con detención de la mitosis [30]. Epotilonas podrían tener un mecanismo de acción similar. Curiosamente, desmontables células βIVb-tubulina tuvieron una disminución en el número de células bloqueadas en G
2-M (epotilona B 20 nM) en comparación con el control y desmontables células βII-tubulina, aunque a un nivel más alto que el βIII- desmontables células tubulina. Sin embargo, a diferencia de las células desmontables βIII-tubulina, desmontables células βIVb-tubulina se someten a la muerte celular inducida por drogas en un nivel similar al del control y desmontables células βII-tubulina. Además, tanto la actividad de la caspasa 3/7 y Anexina V tinción mostró que desmontables células βIII-tubulina tenían un aumento significativo de la epotilona B inducida por la inducción de apoptosis en todas las concentraciones ensayadas. Por el contrario, desmontables de células protegidas βIVb-tubulina contra la epotilona B como se refleja en la disminución de la inducción de la apoptosis. Por lo tanto, la inducción de apoptosis puede servir como uno de los mecanismos subyacentes a la aumentada o disminución de la sensibilidad observada con estos isotipos específicos beta-tubulina en respuesta a la epotilona B.
El enlace molecular entre β-tubulina y epotilona B inducida por apoptosis aún no se ha establecido. Se ha demostrado recientemente que la apoptosis inducida por la epotilona B en células de neuroblastoma humano mediante el aumento de la generación de especies reactivas de oxígeno de las mitocondrias y posteriormente relocalización de la proteína proapoptótico Bim en el compartimiento de la mitocondria [31]. Futuras investigaciones determinarán si la generación y la mitocondria o la expresión de diferentes proteínas pro- y antiapoptóticas ROS son responsables de la capacidad de βIII-tubulina o βIVb-tubulina de afectar diferencialmente las señales de apoptosis epotilona B inducida, y si estas señales se producen independiente de detención mitótica .
la importancia de la diferencia de β-tubulina isotipos en la sensibilidad a la epotilona B requiere una validación adicional en el ámbito clínico para evaluar su aplicabilidad en la predicción de la eficacia de la epotilona B. también será de gran interés para determinar si la expresión de βIVb-tubulina se correlacionan con la respuesta clínica en los cánceres tratados con epotilona, como sobre la base de los resultados de este estudio, se espera que los tumores con altos niveles βIVb-tubulina a ser más sensibles a este agente.
Tomados en conjunto , estos resultados muestran que la composición de isotipo β-tubulina de una célula afecta a la sensibilidad a la epotilona B. los estudios clínicos están garantizados para evaluar el valor terapéutico de la expresión diferencial de los isotipos de beta-tubulina en NSCLC y su papel en la respuesta clínica al epotilonas.
Apoyo a la Información
Figura S1.
siRNA dirigidos βII, βIII o βIVb-tubulina silencia específicamente su expresión en H460 y Calu-6 células de NSCLC. transferencias de Western representativo que muestra siRNA dirigidos βII (A), βIII (B), o βIVb-tubulina (C) inhibe su expresión de la proteína en H460 y Calu-6 células de NSCLC en comparación con las células tratadas con ARNsi de control o Mock (lipofectamina 2000 solamente) . No se observaron cambios significativos en la expresión de otros isotipos de β-tubulina. Gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (
GAPDH
) expresión se utilizó como control de carga. geles representativos.