Extracto
En un esfuerzo por evitar la resistencia a la rapamicina - un inhibidor de mTOR - se realizaron búsquedas para nuevos rapamicina-abajo-objetivos que pueden ser actores clave en la respuesta de las células cancerosas a la terapia. Hemos encontrado que la rapamicina, a concentraciones nM, aumento de la fosforilación del factor de iniciación eucariótico 2α (eIF) en las células MCF-7 rapamicina-sensibles y dependientes de los estrógenos, pero tuvo sólo un efecto mínimo sobre la fosforilación eIF2α en el MDA triple negativo rapamicina insensible células -MB-231. La adición de salubrinal - un inhibidor de la eIF2α desfosforilación - disminución de la expresión de un marcador de superficie asociado con capacidad de auto renovación, el aumento de la senescencia y muerte celular inducida clonogénico, lo que sugiere que la fosforilación de excesiva eIF2α es perjudicial para la supervivencia de las células. El tratamiento de células con aumento inducido por la radiación mejorada salubrinal en la fosforilación y la muerte eIF2α clonogénico y mostraron que las células irradiadas son más sensibles a aumento de la fosforilación eIF2α que los no irradiados. Similar a salubrinal - la variante eIF2α phosphomimetic - S51D - aumento de la sensibilidad a la radiación, y ambos incremento inducido por la radiación abrogada en el tipo de cáncer de mama 1 gen de susceptibilidad, implicando así una mayor fosforilación de eIF2α en la modulación de la reparación del ADN. De hecho, de extremos no homólogos inhibido salubrinal unirse, así como la reparación de recombinación homóloga de doble filamento se rompe que fueron inducidos por I-II CPE en plásmidos indicadores verdes fluorescentes de proteínas. Además de su efecto sobre la radiación, salubrinal la fosforilación potenciada eIF2α y la muerte clonogénico en respuesta al inhibidor de la histona deacetilasa - vorinostat. Por último, el inhibidor competitivo catalítica de mTOR - Ku-0063794 - aumento de la fosforilación de eIF2α que demuestra aún más la participación de la actividad de mTOR en la modulación de la fosforilación eIF2α. Estos experimentos sugieren que el exceso de la fosforilación de eIF2α disminuye la supervivencia de las células cancerosas; haciendo eIF2α un objetivo digno para el desarrollo de fármacos, con el potencial de mejorar los efectos citotóxicos de las terapias establecidas antineoplásicos y evitar la resistencia a rapalogues y posiblemente a otros fármacos que inhiben componentes aguas arriba de la vía mTOR
Cita.: Tuval-Kochen L, Paglin S, Keshet G, Lerenthal Y, Nakar C, Golani T, et al. (2013) factor de iniciación eucariótico 2α - un efector de la diana de mamífero de rapamicina - Modula la reparación del ADN y la respuesta al tratamiento del cáncer. PLoS ONE 8 (10): e77260. doi: 10.1371 /journal.pone.0077260
Editor: Vladislav V. Glinskii, Universidad de Missouri-Columbia, Estados Unidos de América
Recibido: Abril 29, 2013; Aceptado: 30 Agosto 2013; Publicado: 25 Octubre 2013
Derechos de Autor © 2013 Tuval-Kochen et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. La investigación el apoyo de una generosa donación de la finca de la señorita HARAN ESTER de bendita memoria a través de Keren Izvonot, Israel, Ministerio de salud (SP) y por el Fondo de Desarrollo de la Infraestructura de Investigación médica - Sheba Medical Center (YL). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
El fosfatidilinositol 3-quinasa - proteína quinasa B - objetivo mamífero de la rapamicina (PI3K-Akt-mTOR) y la vía regula el crecimiento y la proliferación celular. La desregulación de la vía subyace transformaciones oncogénicas y su modulación por los tratamientos antineoplásicos afecta a su resultado. inhibidores de la mTOR - rapamicina y sus derivados - disminuyen la proliferación de células cancerosas y se han probado como agentes anti-cáncer en ensayos clínicos [1-3]. La rapamicina se ha utilizado para el recubrimiento de stents para prevenir [4] angiográfico-restenosis, y ha ganado aprobación de la FDA como un inmunosupresor. Sus derivados - temsirolimous y everolimous han sido aprobados para el tratamiento de diversos tipos de cáncer [5,6]
Rapalogues se unen a su receptor intracelular de proteínas de unión a FK506 12 (FKBP12), formando un complejo que inhibe complejo mTOR 1. (mTORC1) mediante la unión de dominio de unión a rapamicina-FKBP12 de mTOR [7]. Por otra parte, la incubación prolongada con rapalogues puede inhibir la formación de mTOR complejo 2 (mTORC2) [8]. Sin embargo, el efecto de rapalogues en mTORC1 y mTORC2 es tipo específico de célula y puede depender de la abundancia relativa de moléculas que participan en la composición de complejos macromoleculares de mTORC [8,9]. En consecuencia, el resultado inhibidora de rapalogues sobre el crecimiento del tumor no es universal [7].
Por lo tanto, en células de cáncer de rapamicina sensible, delineando rapamicina efectores que modulan el crecimiento y la respuesta del tumor al tratamiento antineoplásico es probable que conduzca para el descubrimiento de nuevos compuestos que inhiben el crecimiento del tumor y /o mejorar su sensibilidad a las terapias establecidas. Se espera que tales moléculas para eludir la resistencia de las células cancerosas a los fármacos que se dirigen a componentes de aguas arriba de la vía PI3K-Akt-mTOR mientras que tener sólo un efecto parcial sobre sus actividades globales.
En el presente estudio se reporta que la inhibición de mTOR lleva a un aumento de la fosforilación de eIF2α - una subunidad de eIF2. Hasta la fecha, informes de contraste se han publicado en relación con la participación de mTOR en eIF2α fosforilación [10-16]. Sin embargo, el presente estudio demuestra que en las células dependientes de estrógenos de rapamicina sensible de cáncer de mama MCF-7, así como en las células triples negativos rapamicina insensible MDA-MB-231, la inhibición de mTOR por rapamicina y por el inhibidor catalítico específico (Ku-0063794 ), respectivamente, conduce a un aumento de la fosforilación de eIF2α. Cuando se une a GTP, eIF2 reclutas Met · ARNt
MET a los ribosomas, que comenzará a buscar el ARNm tapado. Tras el reconocimiento del codón de iniciación y la hidrólisis de GTP, la inactiva eIF2 · PIB se libera y se recicla en un eIF2 activo · GTP complejo a través de la interacción con el factor de intercambio de nucleótidos de guanina eIF2B [17]. En condiciones fisiológicas normales, eIF2α facilita la interacción de eIF2 con eIF2B [18]. Sin embargo, la fosforilación de eIF2α en su Ser
51 vueltas eIF2 partir de un sustrato de eIF2B en su inhibidor competitivo, que conduce a una reducción en el nivel de eIF2 · GTP · Met · tRNA
MET complejo y a la atenuación de la proteína mundial traducción. Es importante destacar que, debido a que el nivel celular de eIF2 es de más de eIF2B, un ligero aumento en la fosforilación eIF2α pueden secuestrar una fracción importante de eIF2B [17]. En células de mamíferos eIF2α es fosforilada por cuatro quinasas diferentes que responden diferencialmente a varias señales de estrés [17], y su desfosforilación se lleva a cabo por la subunidad catalítica de la fosfatasa fosfo-proteína 1 (PP1) en complejo con subunidades reguladoras específicas por ejemplo, el represor constitutivo de la fosforilación eIF2α (CREP) o la detención del crecimiento inducida por el estrés y la proteína de ADN daños inducible (GADD34) [19]. Salubrinal - un inhibidor de la desfosforilación eIF2α - interfiere con la asociación de PP1c y sus subunidades reguladoras, lo que conduce a un aumento de la fosforilación eIF2α. Su aplicación a diferentes sistemas de células in vitro se ha empleado para dilucidar la relevancia fisiológica de aumento de la fosforilación eIF2α a la supervivencia celular [20,21].
El resultado molecular y la relevancia fisiológica de aumento de la fosforilación eIF2α ha sido ampliamente estudiado durante retículo endoplasmático (ER) de sobrecarga, donde por lo general se cree que ejercen un papel protector. En respuesta al aumento de carga ER PKR-como ER-localizada eIF2α quinasa (PERK) se activa y un aumento transitorio de la fosforilación eIF2α sobreviene [22]. Esto conduce a una atenuación global de la traducción de proteínas que pueden ir de la mano con el aumento de la traducción de ARNm específicos que poseen ya sea un elemento-ribosoma-entry-sitio interno [23] o tramas cortas de lectura abierta en su líder 5 '[17]. La atenuación global de la traducción de proteínas disminuye la carga ER, mientras que las proteínas específicas cuya traducción se incrementa la transcripción de activación de genes que modulan la respuesta celular al estrés. Se requiere que el alivio de la fosforilación eIF2α el fin de permitir la traducción de la nueva transcriptoma [24]
La exposición de fibroblastos de embriones de ratón (MEF) a agentes contra el cáncer - tales como inhibidores de la histona deacetilasa doxorrubicina o - también llevó a un aumento de la fosforilación de eIF2α, aunque un sostenido en lugar de una transitoria [25,26]. En estos estudios modificados MEF llevar el modificador /a mutaciones no phosphorylatable eIF2α A mostró una mayor sensibilidad a los medicamentos que sus contrapartes S /S de tipo salvaje que llevan a la conclusión de que el aumento inducido por fármacos en la fosforilación eIF2α tiene un efecto protector contra la muerte celular. Sin embargo, mientras que la fosforilación estrictamente regulados de eIF2α puede ser protectora, una fosforilación excesiva y sostenida eIF2α puede ser tan perjudicial como la abrogación total. De hecho, se ha observado que mientras que se requiere la fosforilación estrechamente regulado de eIF2α para el desarrollo embrionario adecuado, una deficiencia en eIF2α fosforilados de señalización, debido a la homocigosis para eIF2α A /A, así como la fosforilación excesiva que resulta de un knockout de CREP, una mutación que conduce a la inhibición de eIF2α desfosforilación, están asociados con anemia fetal y retraso del crecimiento [22]. Además, la mutación en PERK y la inhibición de eIF2α resultado la fosforilación en las células beta de la muerte y el síndrome de Wolcott-Rallison, y la fosforilación de manera similar excesiva eIF2α en las células TSC mutados después de la exposición al factor de estrés ER inhibe la expresión del transcriptoma inducida por el estrés que conduce a la muerte celular [24] .
Nuestros estudios implican sostenidos y fosforilación excesiva eIF2α en la inhibición de la reparación del ADN, el desarrollo de la senescencia y la disminución de expresión de un marcador de superficie asociado con capacidad de auto renovación, proporcionando con ello una razón para la asociación con una mayor sensibilidad a anti- tratamientos neoplásicas tales como los inhibidores de histona deacetilasa radiaciones ionizantes y (HDACI). Nuestros resultados sugieren que el desarrollo de fármacos que aumentan la fosforilación eIF2α puede proporcionar medios adicionales para mejorar la sensibilidad a las terapias establecidas antineoplásicos y /o eludir la resistencia a fármacos que se dirigen los componentes aguas arriba de la vía PI3K-Akt-mTOR.
Materiales y Métodos
cultivo de células
MCF-7 y MDA-MB-231 líneas celulares de cáncer de mama, de la American Type Culture Collection (Manassas, VA), se sembraron a una densidad de 4 · 10
3 por cm
2 y mantenido como se ha descrito antes [27]. Las células se irradiaron 48 horas después de la galvanoplastia en un Cs
137 irradiador (Gammacell 1000 Elite /3000 Elan) a una dosis de 475 cGy /minuto o en irradiador de rayos X (Polaris sc-500 serie II) a una dosis velocidad de 100 cGy /minuto. La rapamicina, vorinostat (LC laboratorios, Boston, MA), se añadieron Ku-0063794 (Selleck, Houston, TX) y salubrinal (Calbiochem-Merck4Biosciences, Alemania) a los cultivos de soluciones madre en dimetilsulfóxido (DMSO). Los cultivos control recibieron cantidades iguales de vehículo. concentración de DMSO en el medio no superó 0,08%. Los fármacos se añaden al cultivo inmediatamente después de la radiación.
supervivencia de la colonia de ensayo
Chapado de ensayo de colonias de supervivencia, el recuento de colonias, y el cálculo de fracciones supervivientes se realizó por triplicado como se ha descrito antes [28]. A menos que se indique lo contrario, las colonias se fijaron, se tiñeron y se contaron 8-10 días siguientes chapado, cuando el 90-95% de las colonias en el control posee más de 50 células. El efecto aditivo teórico, de los tratamientos antineoplásicos combinados, en células de supervivencia se calculó de acuerdo con la siguiente fórmula: 100 x SFa x SFb (SFA = fracción de supervivencia de las células tratadas con el agente 'a'; SFb = fracción de supervivencia de las células tratadas con el agente 'b'). Un determinado experimentalmente fracción de supervivencia que es menor que la calculada indica que los dos agentes han mejorado una vez de un efecto inhibidor aditivo sobre la supervivencia celular. El supuesto subyacente de esta ecuación es que los agentes actúan de forma independiente el uno del otro dentro de la misma población. La fracción celular en porcentaje que no sobrevive tratamiento (IF)% es igual a: [1-fracción de supervivencia] x100 y el efecto inhibidor aditivo teórico de los agentes A y B en el tamaño de la fracción celular muerto en porcentaje - (IFAB)% es igual a [29]: 100 x [1- (1-Ia /100) x (1-Ib /100)] = 100 x (1-x SFa SFB).
Western Blot análisis
Preparación de lisados y análisis de los cambios inducidos por el tratamiento en el nivel de proteína y la fosforilación de células se realizó como se describió anteriormente [27] con modificaciones menores. El contenido de proteína se determinó con un reactivo de ácido bicinconínico (Bio-Rad, Hercules, CA), y la igualdad de carga se verificó mediante la medición de la absorbancia a 520 nm de Ponceau S (Sigma, St-Louis, MO) se extrajo con PBS a partir de tiras individuales de una carrera doble. Las transferencias se expusieron a películas de rayos x para quimioluminiscencia después del tratamiento con reactivo ECL West Pico (Thermo Scientific Rockford, IL). Los valores de densidad de luz integrada de autorradiogramas se obtuvieron con el software Image J NIH y se emplearon para la determinación de los cambios inducidos por el tratamiento en los niveles de proteína y en la relación de eIF2α fosforilada (p-eIF2α) para el nivel total de la proteína. Conejos anticuerpos que reconocen ya sea p-eIF2α o ambos los eIF2α fosforilados y no fosforilados eran de Tecnologías de Señalización Celular (Boston, MA) y los anticuerpos de BRCA1 (D9 clon) y CD2 eran de Santa Cruz Biotechnology Inc. (Dallas, TX)
Caracterización de la expresión del antígeno específico epitelial (ESA) mediante análisis FACS
control y células tratadas salubrinal fueron separadas con solución de disociación celular no enzimática (Sigma, Israel), se incubaron con suero humano y FcR reactivo de bloqueo y, a continuación con isotiocianato fluorescente (FITC) -anti-ESA o con control de isotipo (Miltenyi Biotec, Alemania). 7-aminoactinomicina D (7AAD, eBiosciences, San Diego, CA) sirvió como colorante de viabilidad. La detección de la tinción de las células se realizó mediante FACSCalibur utilizando software Quest (BD Biosciences, San Jose, CA) como se describe por Keshet et al. para la tinción de la superficie de MDR1 [30].
La tinción de ácido β-Galacotosidase
kit de tinción de células de Señalización Celular Tecnologías se utilizó para la tinción celular y microfotografías de células teñidas se obtuvieron con Nikon Eclipse TS100 microscopio invertido y una cámara Nikon DS.
Los ensayos para la reparación del ADN
extremos no homólogos (NHEJ) la reparación se ensayó en células HeLa y recombinación homóloga reparación (HRR) se ensayó en células U2OS transfectadas de forma estable con pEJSSA y PDR-GFP respectivamente [31,32]. El HeLa [33,34] Las células fueron un regalo del Dr. Dahm-Daphi, Universidad de Hamburgo y los U2OS eran un regalo del doctor Scully, Escuela de Medicina de Harvard [32,34]. El ensayo se realizó esencialmente como se describe por Moyal et al. y Seluanov et al. [34,35] excepto que las células se trataron con 4,5 mM salubrinal 6 horas antes de la transfección con plásmidos que expresan I-SceI (o vector vacío en los controles). Para la medición de NHEJ, las células fueron co-transfectadas con I-SceI vector que expresa y pDsRed2-N1 en una proporción de 10: 1. La transfección se realizó con el reactivo de transfección de ADN LT1 (Mirus Bio LLC.) Según las instrucciones del fabricante. Paralelamente, GFP de tipo salvaje y las células que expresan DsRed, así como controles negativos se utilizaron para la calibración de FACS (ajuste de la tensión y la compensación de color). NHEJ actividad fue seguida en el momento observado después de la transfección con I-SCE mediante el control de la expresión de GFP en células que expresan DsRed. La detección se realizó por FACSCalibur en 50.000 eventos por muestra. Para la determinación de la actividad de HR la fracción de células que expresan GFP dependiente de I-SceI se dividió por la eficacia de transfección en estas células como se describe por Moyal et al. [34]. Bajo nuestras condiciones experimentales, el efecto de salubrinal en la intensidad media de fluorescencia en las células que expresan GFP fue siempre inferior al 10%, lo que indica que el efecto notable de salubrinal en la reparación del ADN no es resultado de la inhibición de la traducción. También, como se muestra en la Tabla S1 en File S1, salubrinal no alteró la distribución del ciclo celular de las células U2OS que indican que el efecto inhibidor de salubrinal sobre la actividad HRR después de la transfección con I-SceI resulta de la inhibición directa de la reparación y no de un efecto sobre la la fracción de células en fase S.
La transfección de células con plásmidos que codifican variantes eIF2α
heIF2α S51A y heIF2α S51D en pcDNA3.CD2 [36,37] fueron un regalo del laboratorio del Dr. Ron Nueva York, Nueva York. La transfección transitoria se realizó con jetPEI (Polyplus, Nueva York, NY) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Cuando la transfección se realizó en 10 cm placas de cultivo - 10 g plásmidos se incubaron en 6 ml de medio de crecimiento sin antibióticos durante 24 horas antes de añadir 4 ml de medio y de continuar con el protocolo experimental. Cuando la transfección se llevó a cabo en placas de 6 pocillos, las cantidades indicadas de plásmidos se incubaron en 2 ml de medio de crecimiento sin antibióticos durante 24 horas antes de añadir 0,5 ml de medio y de continuar con el protocolo experimental. Expresión de la proteína reportera se controló en transferencias de Western con anti-CD2.
El análisis estadístico
Student para datos independientes
t
prueba o una muestra de
t
prueba después se empleó la transformación logarítmica para el análisis estadístico.
p Hotel & lt; 0,05 fue considerado estadísticamente significativo
Resultados
Se ha demostrado previamente que los dependientes de células MCF-7 de cáncer de mama estrógeno son muy sensibles a la rapamicina (IC
50 - ~ 10 nM). . Por el contrario, la triple negativo MDA-MB-231 son insensibles a la droga (IC
50 -5900 nM) [38] debido a la relativamente alto nivel de ácido fosfatídico que compite con rapalogues por la unión al dominio FRB [9] . Nuestros resultados también muestran que mientras que en las células MCF-7 rapamicina induce la muerte clonogénico con una CI
50 de ~ 50 nM, en las concentraciones MDA-MB-231 células hasta 2 M no afectó significativamente la supervivencia celular (Tabla S2 en presentar S1).
eIF2α es un objetivo corriente abajo de la rapamicina y la irradiación
A concentraciones nM de rapamicina condujeron a aumento de la fosforilación de eIF2α que era mucho más pronunciada en las células MCF-7 que en MDA-MB-231 (Figura 1 ab). La radiación ionizante, por otro lado, el aumento de la fosforilación eIF2α tanto en las células MCF-7 y MDA-MB-231 (Figura 2 a-c). En MDA-MB-231 células aumento del nivel de p-eIF2α así como una mayor proporción de p-eIF2α a eIF2α se mantuvo durante 48 horas después de la irradiación. En algunos experimentos se observó una disminución en el nivel total de eIF2α en las células irradiadas, sin embargo esta diferencia no fue estadísticamente significativa. En células MCF-7 el nivel de p-eIF2α, así como la de el nivel total de eIF2α disminuyeron en gran medida por 48 horas después de la irradiación, pero la proporción elevada de p-eIF2α a eIF2α consiguen por 24 horas se mantuvo después de la irradiación.
a. Las células se incubaron durante 24 horas con 50 nM de rapamicina, se recogieron y se procesaron para la determinación de los cambios en la fosforilación eIF2α b. Media ± SEM cambio veces en relación con el control de eIF2α (e), p-eIF2α (p) y la relación de p-eIF2α /eIF2α (p /e) en las células tratadas con rapamicina. El análisis representa 6 determinaciones separadas para células MCF-7 y 3 para las células MDA-MB-231. * Indica un cambio significativo en relación con el control -
p Hotel & lt; 0.05.
a. MCF-7 y b. MDA-MB-231 células fueron irradiados con la dosis de radiación se indica y se procesaron para el análisis de la fosforilación de eIF2α en el momento observado después de la irradiación. do. Media ± SEM de cambio veces en relación con el control de eIF2alfa (e), p-eIF2α (p) y la relación de p-eIF2α /eIF2α (p /e) en irradiado MCF-7 y las células MDA-MB-231. Análisis para MCF-7 a las 24 horas después de la irradiación con 1,5 y 9,5 Gy representa 2 y 3 determinaciones separadas, respectivamente, y a las 48 horas 3 determinaciones independientes para cada dosis. Análisis de las células MDA-MB-231 a las 24 horas representa 3 determinaciones para cada dosis y a las 48 horas 5 Determinación de 1,5 Gy y 6 de 9,5 Gy. * Indica un cambio significativo en relación con el control -
p Hotel & lt; 0,05
El aumento de la fosforilación de eIF2α es perjudicial para la supervivencia celular
Para determinar la relevancia del aumento de la fosforilación eIF2α a la supervivencia celular se trataron células MDA-MB-231 con salubrinal -. Un inhibidor eIF2α de desfosforilación. Salubrinal condujo a un aumento dependiente de la dosis de la fosforilación eIF2α que se asoció con un aumento de la muerte clonogénico (Figura 3 A, B, Tabla 1). La combinación de tratamiento de salubrinal - a una concentración que no afecta a la supervivencia celular (4,5 M) - y la radiación provocó un aumento de la fosforilación de eIF2α que se asoció con la muerte clonogénico mejorada (Figura 3 C, D, Tabla 2, Tabla S3 en S1 Archivo) . Curiosamente, en las células que recibieron el tratamiento combinado de 4,5 M salubrinal y 1,5 Gy, la fosforilación de eIF2α fue similar a la obtenida en células tratadas con salubrinal solo, lo que sugiere que las células irradiadas son más susceptibles a aumento de la fosforilación eIF2α que las células no irradiadas. aumento de la sensibilidad a la radiación también se observó en las células MCF-7 tratadas salubrinal (Tabla S4 en S1 Archivo).
a. Las células se procesaron para el análisis de la fosforilación eIF2α 48 horas post-adición de salubrinal (Sal). segundo. La media ± SEM factor de cambio en relación con el control de eIF2α (e), p-eIF2α (p) y de la p-eIF2α /eIF2α (p /e) Relación de salubrinal en las células tratadas (SAL). El experimento se reproduce 3 veces durante 4,5 M y dos veces durante 16 M. * Indica un cambio significativo con respecto al control - P. & Lt; 0,05
c. Las células se irradiaron con la dosis de radiación se señaló antes de la adición de 4,5 M salubrinal (Sal). re. La media de cambio veces en relación con el control de eIF2α (e), p-eIF2α (p) y la relación p eIF2α /eIF2α (p /e) .El experimento se reproduce una vez con resultados similares (valores de e, p, y p /e de ambos experimentos se presentan en la Tabla S3 en S1 File).
salubrinal (M)
SI (%)
00 ± 0.64.50 ± 5938 ± 216.5100Table 1. salubrinal induce la muerte dependiente de la dosis clonogénico.
MDA-MB-231 células fueron chapados y procesados para su ensayo clonogénico. Los números son SI (%) ± SEM de muestras por triplicado. El efecto de salubrinal sobre la muerte celular a los 9 y 16,5 M fue significativa (
p Hotel & lt; 0,05). Descargar CSV CSV Gy
-sal SI (%)
+ Sal SI (%)
calculados aditivos
00 ± 10 ± 313 ± 0,38 ± 2.631.517 ± 0.630 ± 166 ± ± 1.6172.548 2. 2.648Table salubrinal aumenta la muerte celular en las células irradiadas clonogénico.
células MDA-MB-231 se colocaron en placas para el ensayo clonogénico de supervivencia. Se añadió salubrinal (Sal) (4,5 M) a las células inmediatamente después de la irradiación. Los números son medios SI (%) ± SEM de muestras por triplicado de un experimento representativo que se reprodujo dos veces con resultados similares. efecto aditivo teórico de salubrinal y la radiación sobre el tamaño de la fracción celular muerto se presenta en "aditivo calculado '. El efecto del aumento de la muerte en salubrinal clonogénico menos de 1,5 Gy y 2,5 Gy de radiación grupos fue significativa (
p Hotel & lt; 0,05). CSV Descargar CSV
Al igual que el efecto de la transfección salubrinal, transitoria con la variante eIF2α S51D phosphomimetic disminuido - de una manera plásmido-dependiente de la dosis - supervivencia clonogénico con relación a la observada en las células transfectadas con la variante S51A no fosforilable. A altas concentraciones de plásmido (Figura 4 a) la supervivencia de células que expresan la variante phosphomimetic fue menor que la de células que expresan la variante no fosforilable. Sin embargo, a una concentración más baja plásmido eIF2α S51D no afectó la supervivencia relativa a eIF2α S51A (Figura 4 b), pero dio lugar a un aumento de muerte clonogénico en células irradiadas (Figura 4 C, cuadro 3). Bajo condiciones experimentales aumento inducido por la radiación en la fosforilación de endógena eIF2α fue similar en eIF2α S51A y eIF2α S51D células que expresan (Figura S1), lo que indica que al igual que salubrinal el efecto perjudicial provocado por la expresión de los resultados eIF2α S51D de un aumento en el nivel celular de inhibido eIF2α es decir eIF2α S51D y la proteína endógena fosforilada.
a. Las células transfectadas con 2 mg /2 ml eIF2α S51A (SA) o con eIF2α S51D (SD) se procesaron para el análisis 17 días después de la galvanoplastia. A esta concentración SD disminución de la supervivencia clonogénico. antes de Cristo. Las células transfectadas con 1.5μg /2 ml SA o con SD. Las células en b no se irradiaron mientras que las células en c se irradiaron con 1,5 Gy 24 horas después de la transfección. Las células en b y c se procesaron para el análisis de 10 días después de la irradiación. En este SD concentración por sí mismo no afectó la supervivencia clonogénico pero sí aumentar la sensibilidad a la radiación. El experimento se reproduce una vez con resultados similares.
SA SI (%)
SA + 1,5 Gy IF (%)
SD SI (%)
SD + 1,5 Gy IF (%)
0 ± 348 ± 0.50 ± 462 ± 1.5Table 3. El phosphomimetic variantes eIF2α muerte aumenta clonogénico en células irradiadas.
células fueron transfectadas con 1.5μg /2 ml eIF2α S51A o eIF2α S51D. La irradiación con 1,5 Gy se llevó a cabo 24 horas después. Las colonias fueron procesados para el análisis de 10 días después de la irradiación. Los números son los medios si (%) de muestras por triplicado ± SEM. El experimento se reproduce una vez con resultados similares. Las diferencias entre los grupos de control y irradiados, así como entre los dos grupos de variantes irradiados fueron significativas
p
& lt; 0,05. SA - no phosphorylatable eIF2α, S51A, SD - phosphomimetic eIF2α S51D. Descargar CSV CSV
salubrinal afecta a la expresión de la ESA superficie
Se ha informado de que las células madre del cáncer de mama tumorigénicos se enriquecen con una subpoblación de células que expresan CD
44 + /CD
24 - /baja /eSA
+ en su superficie [39], y que una sub-población que expresa una combinación similar de marcadores de la superficie celular se ha identificado en líneas celulares de cáncer de mama (por ejemplo, MDA-MB-231), y se ha demostrado que poseen alta capacidad de autorrenovación y la iniciación del tumor [40]. Debido a que más del 90% de las células MDA-MB-231 son CD
44 + /CD
24 /baja, la clasificación para la expresión ESA superficie celular en estas células puede servir como un indicador para cambios en el tamaño de la fracción celular con capacidad de auto renovación [40]. Como se ha indicado en la Figura 5, el tratamiento de las células con salubrinal disminución de la expresión de ESA en la superficie de células, lo que sugiere que el efecto nocivo de la fosforilación excesiva eIF2α puede disminuir su capacidad de auto renovación.
Las células se incubaron con 24 salubrinal mu M durante 96 horas antes de la recolección, se detectó la tinción de células con FITC-anti-ESA o con los controles de isotipo con FACSCalibur. El experimento se reproduce dos veces con resultados similares. 7AAD - tinte de viabilidad, FITC -. Anti-ESA
salubrinal induce la senescencia en células de cáncer de mama
Las colonias de células irradiadas y tratadas salubrinal contienen células que buscan agrandados y senescentes. Contamos estas células en colonias formadas después de la exposición a 1 Gy, a 4,5 M salubrinal a la combinación de radiación y salubrinal y en los controles no tratados. Curiosamente, a pesar de que el tratamiento combinado de 4,5 M salubrinal y 1 Gy no condujo a una mayor muerte clonogénico (Tabla 2) que dio lugar a una mayor aparición de células que buscan senescentes (Figura 6). La tinción de ácido β-Galacotosidase mostró que estas células expresan grandes la enzima lo que indica que en efecto salubrinal mejora la senescencia en células irradiadas (Figura 6).
Las células se sembraron para el ensayo de supervivencia de la colonia. Se añadieron salubrinal (4,5 M) o el vehículo inmediatamente después de la radiación con 1 Gy. la actividad β-galactosidasa ácida se refleja en la mancha azul. Los números son la media de los senescentes mirando células /colonia ± SD en placas por triplicado y las diferencias entre los tratamientos combinados y cada uno de los únicos tratamientos, así como entre cada tratamiento y control fueron estadísticamente significativas
p Hotel & lt; 0.05. Bar, 100 mM.
El aumento de la fosforilación eIF2α modula la reparación del ADN
La radiación condujeron a una mayor nivel de BRCA1, una proteína que participa en la reparación del ADN después del daño de radiación [41]. El aumento en los genes BRCA1 ha sido abrogada por salubrinal y por la expresión transitoria de la phosphomimetic eIF2α S51D lo que sugiere que la fosforilación excesiva eIF2α modula la reparación de daños en el ADN (Figura 7). De hecho experimentos con células HeLa y células U2OS reportero plásmidos que expresan de NHEJ y HRR mostraron, respectivamente, que inhibe la reparación de DSB salubrinal inducida por SCE-I a través de ambos mecanismos (Figura 8).
Panel superior: Control y células irradiadas (1,5 Gy) fueron tratados con 4,5 M salubrinal o el vehículo. Las células se recogieron 48 horas después de la irradiación y se procesaron para análisis de transferencia Western de los cambios en el nivel de BRCA1.
paneles inferiores: células transfectadas con 10 mg /ml de la S51A y S51D eIF2α variantes o con reactivos de transfección solos (SHAM). Las células se irradiaron con 9,5 Gy 24 horas después de la transfección y se procesaron para análisis de BRCA1 24 horas posteriores a la radiación. CD2 se expresó en células transfectadas que indican una transfección con éxito. Sal - 4,5 M salubrinal.
a. Medición de la actividad NHEJ se llevó a cabo 24 horas después de la transfección con I-SceI. El experimento se reproduce una vez con resultados similares es decir, actividad de reparación del 4% para el control y 3% para las células tratadas salubrinal. segundo. Medición de la actividad de recursos humanos se llevó a cabo 36 horas después de la transfección con I-SCE. El experimento se reproduce una vez con resultados similares es decir, actividad 2,35% para el control y la actividad del 1,6% para las células tratadas salubrinal a las 24 horas después de la transfección con I-SceI. Sal. - 4,5 M salubrinal
Aumento sostenido y la fosforilación afecta a la respuesta de las células de cáncer de mama al vorinostat
Al igual que en la radiación, la HDACi - vorinostat también conduce a un aumento de la fosforilación eIF2α. Este incremento ha sido pensado como un medio de protección contra el daño celular [26]. Sin embargo la combinación de bajas concentraciones de salubrinal y vorinostat, en concentraciones que afectan de forma individual apenas fosforilación eIF2α, traducido en un aumento de la fosforilación de eIF2α, que una vez más se asoció con un aumento de la muerte clonogénico (Figura 9, Tabla 4, Tabla S5 en S1 Archivo).
a. Las células se recogieron 48 horas después de la aplicación del vehículo (D), 4,5 M salubrinal (S), 0,75 M vorinostat (V) o ambos (V + S) y se procesaron para análisis de transferencia Western de la fosforilación eIF2α. segundo. La media veces el cambio con relación al control de eIF2α (e), peIF2α (p) y de la relación de peIF2α /eIF2α (P /E). segundo.