Extracto
metástasis peritoneal es el tipo más frecuente de recurrencia en pacientes con cáncer gástrico (CG) y se asocia con mal pronóstico. citología lavado peritoneal, que se utiliza para evaluar el riesgo de metástasis peritoneal, tiene una baja sensibilidad. A continuación, se evaluó el potencial diagnóstico de los perfiles de miARN exosomal en el líquido peritoneal para la predicción de diseminación peritoneal en GC. ARN total fue extraído de exosomas aisladas de seis ascitis malignas gástricas muestras (MA), 24 el líquido de lavado peritoneal (PLF) muestras, y los sobrenadantes de cultivo (CM) de dos líneas celulares de carcinoma gástrico humano que difieren en su potencial para la metástasis peritoneal. La expresión de miRNAs exosomal se evaluó con microarrays Agilent miARN humano y reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa cuantitativa (QRT-PCR). El análisis de microarrays indicó una baja variabilidad en el número y la intensidad de la señal de miRNAs detectado entre las muestras. En los seis fluidos MA, miR-21 mostró la intensidad de señal más alta. Se identificaron cinco miRNAs (miR-1225-5p, miR-320C, MIR-1202, miR-1207-5p, y MIR-4270) con una alta expresión en las muestras MA, el PLF de GC serosa invasiva, y el CM de un GC línea celular altamente metastásica; estas especies miARN candidatos parecen estar relacionados con la diseminación peritoneal. Expresión diferencial de miR-21, miR-320c, y miR-1225-5p fue validado en el PLF de serosa invasiva y no invasiva GC de QRT-PCR y miR-21 y miR-1225-5p se confirmó que se asocia con la invasión serosa en GC. PLF se puede utilizar para el perfil de expresión de miRNAs exosomal. Nuestros hallazgos sugieren que el miR-21 y miR-1225-5p pueden servir como biomarcadores de recidiva peritoneal después de la resección curativa GC, proporcionando así un nuevo enfoque para el diagnóstico precoz de la diseminación peritoneal de GC
Visto:. Tokuhisa M, Ichikawa Y, Kosaka N, Ochiya T, Yashiro M, Hirakawa K, et al. (2015) exosomal miRNAs del peritoneo lavado de fluidos como potenciales biomarcadores pronósticos de metástasis peritoneal en el cáncer gástrico. PLoS ONE 10 (7): e0130472. doi: 10.1371 /journal.pone.0130472
Editor: Soheil S. Dadras, Universidad de Connecticut Health Center, Estados Unidos |
Recibido: 1 de Febrero, 2015; Aceptado: 20-may de 2015; Publicado: 24 Julio 2015
Derechos de Autor © 2015 Tokuhisa et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
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financiación:.. los autores no tienen ningún soporte o financiación reportar
Conflicto de intereses:. los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
los microARN (miRNA) son pequeñas (19-23 nucleótidos) no codificante del ARN que funcionan como reguladores post-transcripcional de la expresión génica y juegan un papel importante en el control de muchos procesos biológicos, incluyendo la diferenciación celular, la proliferación y apoptosis [1]. MiRNAs han demostrado tener actividad oncogénica o supresor de tumores, y desregulado expresión de muchas especies miARN se ha detectado en varios tipos de cáncer, lo que sugiere aplicación potencial de miRNAs como biomarcadores de la progresión del cáncer y la metástasis [2-5].
miRNAs están envueltos en microvesículas secretoras (por ejemplo, los exosomas, cuerpos apoptóticos, y microvesículas vertimiento), que miRNAs escudo de la degradación por ARNasa y sirven como vehículos para la secreción de miARN en el espacio y los fluidos corporales extracelulares. Los exosomas son pequeñas vesículas membranosas que han sido implicados en la respuesta inmune celular; Sin embargo, recientemente se ha hecho evidente que los exosomas contienen cantidades sustanciales de ARN y pueden estar implicados en los mecanismos de regulación inmune-independiente. Ahora se ha establecido que los exosomas pueden realizar la transferencia intercelular de miRNAs, participando así en mecanismos de señalización basados en los genes miARN [6]. Niveles más altos de exosomas que contiene los genes miARN-también se han detectado en el plasma de los pacientes de cáncer que en la de los individuos sanos [7], lo que sugiere que la secreción de miRNA basado en exosoma está involucrado en el desarrollo del cáncer. Análisis de la expresión aberrante de los genes miARN en el suero, saliva, heces, orina y se ha empleado para la detección precoz de linfoma de células B, y oral, intestinal y el cáncer de vejiga [8-11]
.
El cáncer gástrico (GC) es la segunda causa más común de muerte por cáncer en todo el mundo [12]. El peritoneo es el sitio más frecuente de metástasis y la recurrencia de GC, y ascitis maligna (MA), causada por la diseminación peritoneal de células de cáncer, se han asociado con un mal pronóstico. Actualmente, no hay predictores fiables para el desarrollo de ascitis peritoneal malignas en los pacientes GC. exosomas que contiene los genes miARN representan un nuevo mecanismo de señalización intercelular y pueden ayudar a comprender el medio ambiente que permite la difusión del cáncer en el peritoneo [13].
En este estudio, se aislaron exosomas de MA y el fluido de lavado peritoneal intraoperatorio muestras (PLF) obtenidos de pacientes de GC, y el medio de cultivo (CM) de líneas de células peritoneales altamente invasivas, y miRNAs se extrajeron a partir de estas muestras. Se verificaron la calidad de los miRNAs exosomal extraídos y la consistencia de los patrones de expresión de genes miARN. perfiles de expresión de miARN en MA, PLF, y las muestras de CM se compararon y se identificaron candidato miRNAs relacionados con diseminación peritoneal de GC.
Materiales y Métodos
Los pacientes
A todos los pacientes o sus tutores dieron su consentimiento informado por escrito. El estudio fue aprobado por el Comité de Ética del Hospital Universitario de la ciudad de Yokohama (Aprobación No. A110127001).
PLF muestras intraoperatorias MA y se recogieron de pacientes con GC las características clínico-patológicos que se presentan en la Tabla 1. Todos los pacientes habían sido previamente diagnosticado con GC por análisis histopatológico de muestras de biopsia tomadas de las lesiones primarias, y seis pacientes habían sido diagnosticados MA por la presencia de ascitis mediante tomografía computarizada abdominal (TC). La ascitis también se analizaron mediante citología y todos fueron confirmados como positivos para malignidad por los patólogos; las muestras MA restantes se utilizaron para el aislamiento de los genes miARN. PLF se recogió durante la operación de 24 pacientes de GC (Tabla 1). Después de la laparotomía, 100 ml de solución salina normal se vierte en el fondo de saco de Douglas y se recogió el agua de lavado peritoneal antes de la resección quirúrgica del tumor. PLF se analizó por citología y se utiliza para el aislamiento de los genes miARN. Entre las 24 muestras PLF, seis se analizaron utilizando miARN microarrays y 18 fueron analizados por qPCR
adenocarcinoma bien diferenciado (bueno).; adenocarcinoma moderadamente diferenciado (MOD); pobremente diferenciadas adenocarcinoma (mala). ascitis maligna (MA); el líquido de lavado peritoneal (PLF); etapa RGT (UICC 7ª edición); Presente (P) Ausente (A); Peritoneal lavado citología (CY);
Cultivo de células
La línea celular OCUM-2M se estableció a partir de un tumor primario de carcinoma gástrico escirrosa y la línea celular OCUM-2MD3 se deriva de células OCUM-2M con un alto potencial de diseminación peritoneal en ratones nude [14]. Las células se cultivaron en medio de Dulbecco modificado de Eagle (DMEM; Life Technologies, Grand Island, NY) suplementado con 10% de suero inactivado por calor bovino fetal (FBS) y antibióticos antimicótico a 37 ° C en un CO 5%
2 incubadora. Para obtener CM de células, las células OCUM-2M y OCUM-2MD3 se lavaron tres veces con DMEM libre de suero suplementado con antibióticos antimicóticos y se incubaron en el mismo medio durante 48 h.
Aislamiento de exosomas
muestras para el aislamiento exosoma se prepararon como se describe anteriormente [15]. Para eliminar las partículas grandes de células y restos de células, MA, PLF, y CM se centrifugaron a 2000 ×
g
durante 15 min a 4 ° C y se filtró a través de un filtro de 0,22 mm (Millipore, Billerica, MA). El sobrenadante se almacenó a -80 ° C hasta que sea necesario para la extracción de miARN.
Para precipitar los exosomas, las muestras se centrifugaron a 110.000 x
g
durante 70 min a 4 ° C. El sedimento de exosoma se lavó con 11 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se centrifugó de nuevo como se ha descrito. El sedimento se utiliza para la extracción de RNA.
Total de la extracción de ARN y análisis
ARN total fue extraído de exosomas usando un kit miRNeasy mini (Qiagen, Hilden, Alemania) de acuerdo con las instrucciones del fabricante y fue después se almacenaron a -80 ° C hasta su análisis adicional requerida.
La calidad, concentración y tamaño de RNA total exosomal se evaluaron utilizando un Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Foster City, CA). Antes del análisis, se preparó RNA total utilizando un kit de ARN Agilent 6000 Pico (Agilent Technologies) de acuerdo con el protocolo del fabricante.
Mirna microarrays
MiRNAs extraídos de los seis MA, seis PLF, y dos muestras de CM fueron analizados utilizando Agilent humanos miARN microarrays (Agilent Technologies), que contiene 1.226 miRNAs humanos y 146 miRNAs virales humanas. Para la detección de los genes miARN, 100 ng de ARN se marcó y se hibridó usando el kit humano miARN microarrays (Rel 16,0; Agilent Technologies) de acuerdo con el protocolo del fabricante (miARN etiquetado completo y un kit para Hyb Sistema de microarrays miARN). señales de hibridación se detectaron con un escáner de microarrays de ADN G2505C (Agilent Technologies) y las imágenes escaneadas fueron analizados utilizando el software de extracción de características de Agilent (v. 10.7.3.1). El análisis de datos se realizó mediante el software Agilent GeneSpring GX v. 11.0.2. (Log
2 transformación). No se realizó la transformación de línea de base.
La calidad de la extracción de miARN se analizó de acuerdo a la variación en el número de especies miARN microarrays detectado, intensidad de la señal, y la correlación de la expresión de los genes miARN entre las muestras de acuerdo con media ± DE, coeficiente de variación (CV), y coeficiente de correlación (CC).
Selección de miRNAs-metástasis peritoneales específica
se analizaron los perfiles de expresión de miRNAs exosomal para seleccionar miRNAs que son específicos para peritoneal GC difusión utilizando el siguiente enfoque paso a paso. Paso 1: perfiles de miARN en el CM de las células OCUM-2MD3 peritoneales altamente metastásicas se compararon con los de las células no metastásico OCUM-2M de los padres, y miRNAs expresados diferencialmente (media de veces de cambio, & gt; 2) se seleccionaron
Paso 2: seis muestras PLF se clasificaron en dos grupos: T4 (n = 4) y T1-T3 (n = 2), de acuerdo con la etapa del cáncer por el tamaño del tumor y la extensión (UICC-AJCC, 7
ª edición). Etapa T4 GC se caracteriza por la frecuencia más alta de las metástasis peritoneales en comparación con otras etapas [16]. Los perfiles de expresión de los genes miARN de grupo T4 fueron comparados con los del grupo T1-T3 y miRNAs expresados diferencialmente (media de veces de cambio, & gt; 2) fueron seleccionados
Paso 3:. MiRNAs los seleccionados que eran comunes a ambos pasos y que se expresaron en MA se filtraron adicional de acuerdo con la intensidad de la señal. Aquellos con valores de intensidad de más de log
2 10 en MA y PLF fueron seleccionados como candidatos miRNAs en relación con metástasis peritoneales; miR-21 mostró la intensidad de la señal promedio más alto entre las muestras MA. La expresión diferencial de los genes miARN especies seleccionadas en el paso 3 se validó en las 18 muestras restantes PLF por QRT-PCR.
El análisis cuantitativo de la expresión de los genes miARN-metástasis peritoneal específica por QRT-PCR
TaqMan microARN ensayos (Life Technologies) fueron utilizados para cuantificar los niveles relativos de expresión de miR-21 (ID ensayo. 000397), el miR-320c (ensayo ID. 241053_mat), miR-1225-5p (ID ensayo. 002764), y miR-16 (ID ensayo. 000391). La transcripción inversa se realizó usando el Kit TaqMan miARN RT (Life Technologies) en las condiciones siguientes: 30 min a 16 ° C, 30 min a 42 ° C, y 5 min a 85 ° C. PCR se llevó a cabo en placas de 96 pocillos utilizando el sistema de PCR en tiempo real 7500 (Life Technologies); todas las reacciones se realizaron por triplicado. Los niveles de expresión de miRNAs diana se normalizaron a la de miR-16, que se utilizó como control expresado de forma estable [17]. Al analizar los datos de microarrays de exosomal miARN en muestras de ascitis maligna, miR-16 presentó el menor coeficiente de variación (CV = 4%) entre las normas internas de candidatos, incluyendo el miR-638 (CV = 8%), let-7a (CV = 8%), y 142-3p (CV = 23%).
El análisis estadístico
Las variables continuas se compararon mediante
t de Student
. Cuando sea necesario, el
t-test
se modificó para comparar varianzas desiguales. La diferencia entre las variables categóricas se evaluó mediante la prueba exacta de Fisher. La correlación entre dos variables se evaluó mediante el coeficiente de correlación de Pearson. Las diferencias se consideraron estadísticamente significativas a P & lt; 0.05. Los análisis estadísticos se realizaron utilizando el software SPSS 21.0 para Windows (IBM, Armonk, Nueva York).
Resultados
Análisis cuantitativo de ARN extraído exosomal
El ARN total fue extraído a partir exosomas aislados de MA, PLF intraoperatoria, y CM celular. La mediana de la concentración del ARN extraído exosomal fue de 4,4 ng /l (entre 1,2 y 6.1 ng /l) para MA y 6,4 ng /l (1,7 a 16,4 ng /l) para PLF. Electroferogramas reveló una gran proporción de especies pequeñas de ARN presente en todos los CM y muestras clínicas, mientras que ninguna o muy poca contaminación con 18S y 28S ARN ribosomal (no hay picos distintos en el peso molecular correspondiente) se observó (Figura 1).
Variación y coincidencia entre las muestras se examinaron. Evaluación de RNA total exosomal utiliza un Bioanalyzer 2100. Los electroferogramas muestran la distribución del tamaño (nucleótidos, nt) y la intensidad de fluorescencia (FU) de RNA total aislado de exosomal CM, MA, y PLF. El pico más bajo (alrededor de 25 nt) de cada muestra es el marcador del kit Pico ARN Agilent 6000.
Rendimiento de los microarrays de genes miARN
Para probar la expresión de microarrays miARN en exosomal cada grupo de muestras, se examinó el número de miRNAs detectado, percentil de la intensidad de la señal, el número de miRNAs comúnmente capturadas, y la correlación de la expresión de los genes miARN entre los grupos. El número de especies miARN detectadas en cada grupo por microarray se muestra en la figura 2. En los seis MA y seis muestras PLF, éstos significan números fueron 490,1 (SD = 42,3; CV = 8,6%) y 367,5 (SD = 13,4; CV = 3,6%), respectivamente. En cada grupo, la variabilidad en el número de miRNAs detectado entre las muestras fue baja
distribución de la intensidad de la señal para cada grupo se presenta en la Fig. 3; esto muestra las señales procesadas normalizado a la 25, 50, 75, y 90
percentil en cada grupo. En la 50
percentil, el registro
2 intensidades de señal relativas de MA (Figuras 3-1) y PLF (figuras 3 y 2) marcas y entre los tres grupos (MA, PLF, y CM, figuras 3 y 4) fueron 5,53 ± 0,19 (CV = 3,49%), 6,14 ± 0,24 (CV = 3,87%), y 4,97 ± SD (CV = 5,24%), respectivamente. La variabilidad de la intensidad de la señal entre las muestras en cada grupo, así como entre los grupos fue baja.
Los números de miRNAs comunes entre las muestras en el MA, PLF, y los grupos CM se 327, 263, y 354, respectivamente, mientras que esta fue de 194 para los tres grupos (figura 4).
la Tabla 2 muestra la correlación de la expresión de los genes miARN entre cada dos muestras. Los valores más altos y más bajos de la CC fueron de 0,94 y 0,68, respectivamente; el CC promedio de todas las muestras fue de 0,79 (CV = 8,86%). En MA, PLF, y los grupos CM, los valores medios de CC fueron 0,85, 0,88, y 0,90, respectivamente, y la variabilidad en los perfiles de expresión de cada grupo fue baja.
Selección de miRNAs candidatos relacionados de diseminación peritoneal
hasta la fecha, no hay datos han estado disponibles en los perfiles de expresión de miRNAs exosomal asociados con diseminación peritoneal, debido a la falta de disponibilidad de los fluidos ascíticos normales contra la cual comparar los perfiles de expresión MA. Hemos seleccionado miRNAs relacionados con diseminación peritoneal utilizando un enfoque paso a paso. El número de miRNAs comúnmente capturadas en las seis muestras MA era 327. En los pasos 1 y 2, 140 y 118 miRNAs específicos de metástasis fueron seleccionados en los grupos CM y PLF, respectivamente. De estos 327, 140 y 118 miRNAs, se seleccionaron cinco miRNAs como candidatos relacionados con la diseminación peritoneal (Fig 5). Dos de ellos (miR-1225-5p y miR-320c) y miR-21 con la intensidad de la señal más alta entre los miRNAs-MA específica se ha demostrado que son expresados diferencialmente en 18 muestras PLF, mediante qPCR (Tabla 3).
representación esquemática del enfoque paso a paso para la detección de miRNAs relacionado con diseminación peritoneal. Paso 1: selección de miRNAs expresados diferencialmente (sofá-cambio, & gt; 2) en medio de cultivo (CM) de la línea celular altamente metastásica peritoneal OCUM-2MD3 (línea celular de sus padres OCUM-2M se utilizó como control). Paso 2: seis muestras (PLF) fluido de lavado peritoneal se dividieron en T4 (n = 4) y los grupos T1-T3 de acuerdo con la etapa del cáncer gastrointestinal; miRNAs expresados diferencialmente (factor de cambio, & gt; 2) en el grupo T4 fueron seleccionados. Paso 3: las especies seleccionadas miARN comunes para los Pasos 1 y 2, expresados por la ascitis maligna (MA) con una intensidad de señal & gt; log
2 10 en MA y PLF se consideraron como candidato miRNAs en relación con metástasis peritoneales
ascitis maligna (MA).; el líquido de lavado peritoneal (PLF); medio Condición (CM), el estadio T UICC 7
ª edición (T4, T1-3); OCUM-2M (2M); OCUM-2MD3 (D3).
Validación del candidato miARN expresión por qPCR
Dieciocho muestras PLF se dividieron en dos grupos de acuerdo a la etapa metastásica, T4 (serosa perforado, n = 9) y T1-T3 (subserosa o menos, n = 9), y la expresión de miR-21, miR-320c, y miR-1225-5p se analizaron mediante qRT-PCR. La figura 5 muestra que los niveles de miR-21 y miR-1225-5p en pacientes con cáncer gástrico T4 etapa significativa se aumentaron en comparación con las de los pacientes T1-T3 (miR-21, P = 0,027, y miR-1225-5p, P = 0,008; Fig 5). . La diferencia en la expresión de miR-320c entre los dos grupos de pacientes no fue significativa (p = 0,928, figura 6)
Un asterisco indica P & lt; 0.05.
A continuación, la correlación entre los niveles de miRNA y antecedentes clínicos de los pacientes fue examinado GC (Tabla 4). MiR-21 y miR-1225-5p expresión fue significativamente mayor en los pacientes con cáncer de T4 etapas que en los pacientes T1-T3-etapa (P = 0,015). No se encontró correlación significativa entre la expresión de los genes miARN y otros parámetros clínicos.
Discusión
En este estudio, se determinó, por primera vez, el contenido de miARN exosomas aislado de MA y PLF de pacientes con cáncer gástrico. Nuestro estudio muestra que los miRNAs exosomal se pueden extraer constantemente de MA y PLF y que los perfiles de expresión de los genes miARN puede indicar el estado del peritoneo en pacientes con cáncer gástrico.
El pronóstico de GC con la invasión serosa sigue siendo pobre, incluso después de la resección R0, porque de la alta tasa de recurrencia, especialmente las metástasis peritoneales (PM) [18]. PM en GC es el tipo más complicado de recurrencia, porque es difícil de predecir, así como para diagnosticar. A pesar de la ascitis es el síntoma más común de la tarde, muchos pacientes con GC PM no se desarrollan ascitis. Entre los métodos de diagnóstico basados en la imagen, la TC helicoidal de alta velocidad es ampliamente utilizado para la evaluación de estadificación preoperatoria del GC y post-terapéutica de seguimiento; Sin embargo, en el caso de PM su precisión diagnóstica es insuficiente, sobre todo debido a la baja sensibilidad [19]. El uso de PET-TAC para el diagnóstico de la tarde en GC también es objeto de controversia, ya que se ha reportado que la FDG-PET tiene baja sensibilidad para la detección de PM en GC [20]. PLF se ha convertido en el próximo objetivo para el diagnóstico y la predicción de la tarde en GC. El examen citológico de PLF intraoperatoriamente recogida se utiliza para la predicción de la recidiva peritoneal [21] y se utiliza para la estadificación GC en Japón [22]. Sin embargo, algunos investigadores han informado de que PLF citología no presenta la sensibilidad requerida para la predicción y la detección de PM [21], y han propuesto el uso de los métodos de diagnóstico molecular, tales como RT-PCR, para la detección de micrometástasis en PLF. En un estudio prospectivo, multicéntrico, la expresión de ARNm de los genes que codifican el antígeno carcinoembrionario (CEA) y citoqueratina 20 (CK-20), evaluada por RT-PCR, ha demostrado ser útil para la predicción de la supervivencia global y PM en GC [23] . Sin embargo, la desventaja de los métodos de diagnóstico basados en mRNA es la alta degradabilidad de mRNA en el curso de procedimientos quirúrgicos.
En contraste, miRNAs encerrados en exosomas se mantienen estables y pueden circular en los fluidos corporales, tales como suero, plasma , saliva, orina, leche materna, y las lágrimas, durante largos periodos de tiempo [24, 25]; exosomas también se han aislado de MA en el cáncer de ovario [26].
A lo mejor de nuestro conocimiento, no ha habido ningún informe sobre miRNAs exosomal aislados del PLF de pacientes con cáncer gástrico. Levänen et al. exosomas recogida de líquido de lavado broncoalveolar y analizado exosomal miARN expresión para detectar especies miARN relacionadas con la alergia [27]. Liu et al. informaron que los exosomas aisladas de líquido de lavado cervicovaginal contenían altos niveles de miR-21, que podrían ser utilizados como un biomarcador de cáncer de cuello uterino [28]. A continuación, se analizaron los perfiles de expresión de miRNAs exosomal en el PLF de pacientes con cáncer gástrico por la tecnología de microarrays miARN con el fin de identificar los biomarcadores candidatos miARN de diagnóstico para la predicción de metástasis en el GC.
En nuestra investigación, el primer desafío laico en el aislamiento cuantitativo de exosomal miARN de PLF. Weber et al. evaluado la expresión de los genes miARN en 12 fluidos corporales e informó de que la concentración de ARN total en el líquido peritoneal fue 775 g /L [25], que fue menor que el que obtuvimos de MA y PLF-4400 y 6400 mg /L, respectivamente La razón de la diferencia puede ser la metodología utilizada para el aislamiento de ARN total, debido a Weber et al. directamente extraído el ARN de líquido peritoneal, mientras que aislamos primera exosomas y luego utilizamos estos para la extracción de RNA. Análisis de la calidad de ARN aislado de PLF demostró una gran cantidad de pequeñas (& lt; 200 nt) especies de ARN en CM y MA. No hubo distintas 18S y 28S picos de ARN ribosómico en la preparación, lo que indica la ausencia de contaminación con ARN intracelular.
El segundo problema encontrado en el presente estudio consistencia involucrado en la calidad de los miRNAs exosomal aislado. En nuestro estudio, se observó una baja variabilidad en el número de especies detectadas miARN y miARN intensidad de la señal, y una alta correlación entre la expresión de los genes miARN entre las muestras en cada grupo. Los números medios de miRNAs detectables en MA y PLF fueron 490 y 367, que estaba de acuerdo con el número de miRNAs (397) previamente detectado en el líquido peritoneal [25].
PLF y las muestras MA mostraron una baja variabilidad en intensidad de la señal (CV = 3,87% para el 50
percentil). Además, los patrones de expresión de genes miARN fueron altamente correlacionados entre muestras dentro de cada grupo (CC & gt; 0,850), así como entre los grupos (0,8 & gt; CC & gt; 0,7). Estos resultados indicaron que PLF podría ser una fuente de alto rendimiento de miRNAs de buena calidad, que muestran patrones de expresión consistentes en el ensayo de microarrays.
Los perfiles de expresión de genes miARN se analizaron para seleccionar miRNAs específicos para la metástasis peritoneal. MiR-21 mostró una expresión más alta en pacientes con carcinoma T4-etapa que en los del grupo T1-T3. Fabbri et al. informó de que miR-21 y miR-29a en exosomas cáncer-lanzado afectado el crecimiento del tumor y se extendió mediante la unión a y la activación de los TLR en las células inmunes de los alrededores y la inducción de una respuesta inflamatoria prometastatic [29]; esto apoya la noción de que los exosomas derivados del tumor contribuyen al microambiente premetastatic [30, 31]. Esto puede indicar que los exosomas T4 derivadas de carcinoma crear el nicho premetastatic en el peritoneo, que a su vez apoya la invasión peritoneal después de la resección curativa del GC.
El uso de un enfoque paso a paso, se seleccionaron cinco miRNAs exosomal (miR-320c , MIR-1202, miR-1225-5p, miR-1207-5p, y MIR-7270) y validado la expresión de miR-320 y miR1225-5p en el PLF de 18 pacientes del GC mediante qRT-PCR. Mir-1225-5p mostró una mayor expresión en T4 que en los pacientes etapa CG T1-T3, lo que confirma los resultados obtenidos por microarray, mientras que no hubo diferencias en los niveles de miR-320 entre los grupos de pacientes. Mir-1225 objetivos del gen de la enfermedad renal poliquística,
PKD1
, que es frecuentemente mutado en la enfermedad renal poliquística autosómica dominante; Por lo tanto, miR1225 puede afectar a la progresión de esta enfermedad [31]. Sin embargo, la relación entre el miR-1225 y el cáncer sigue siendo poco clara. MiR-21 y miR-1225-5p pueden preparar un nicho premetastatic en el peritoneo para la difusión y la liquidación de las células cancerosas metastasising y por lo tanto puede indicar la predisposición a la recurrencia peritoneal después de la resección curativa GC.
PLF produce información sobre el estado del peritoneo, tales como cambios en la población de células inmunes y la secreción de factores de crecimiento y citoquinas [32, 33]. Citología y moleculares ensayos de diagnóstico se basan en la detección de células cancerosas, mientras que los perfiles de miRNAs en PLF puede ser utilizado para la predicción de un fenotipo premetastatic peritoneal en GC, asegurando medidas preventivas y curativas más eficaces.