Extracto
Una serie de informes indica que Aurora-A o la sobreexpresión de Aurora-B representan un factor pronóstico negativo en varios tumores malignos humanos. En el cáncer de tiroides tejidos una expresión desregulada de Aurora quinasas se ha demostrado también, butno información con respecto a su posible papel pronóstico en el cáncer diferenciado de tiroides está disponible. Aquí, weevaluated Aurora-A y la expresión del ARNm de Aurora-B y su relevancia pronóstica en una serie de 87 cánceres papilares de tiroides (PTC), con una mediana de seguimiento de 63 meses. El análisis de Aurora-A y los niveles de Aurora B-ARNm en tejidos de PTC, en comparación con los tejidos normales emparejados, reveló que su expresión era ya sea ascendente o descendente regulatedin la mayoría de los tejidos de cáncer. En particular, se alteraron Aurora-A y los niveles de Aurora B-ARNm, respectivamente, en 55 (63,2%) y 79 (90,8%) de la correlación positiva significativa 87 PTC analyzed.A entre mRNAswas Aurora-A y Aurora-B observado (p = 0,001). La expresión de ambos genes Aurora no se vio afectada por el BRAF
mutación V600E. Univariante, multivariante y Kaplan-Mayer análisis documentado la falta de asociación entre Aurora-A o la expresión de Aurora-B y parameterssuch clínico-patológico como el género, la edad, el tamaño del tumor, histología, estadio TNM, metástasis de ganglios linfáticos y el estado de BRAF, así asdisease recurrencias o enfermedad intervalo exento. Sólo Aurora-B mRNA fue significativamente mayor en T (3-4), los tejidos con respecto a T (1-2) tejidos de PTC. Los datos aquí presentados demuestran que la expresión de Aurora quinasas está desregulado en la mayoría de los tejidos de PTC, probablemente contribuye a la progresión de PTC. Sin embargo, a diferencia de otros cánceres sólidos humanos, la detección de Aurora-A o B Aurora-ARNm no es un biomarcador pronóstico inPTC pacientes
Visto:. Baldini E, C Tuccilli, Prinzi N, S Sorrenti, Falvo L, de Vito C, et al. (2015) La expresión desregulada de Aurora quinasas no es un biomarcador pronóstico en pacientes con cáncer de tiroides papilar. PLoS ONE 10 (3): e0121514. doi: 10.1371 /journal.pone.0121514
Editor Académico: Adriano Angelucci, Universidad de L'Aquila, Italia
Recibido: 9 de diciembre de 2014; Aceptado: February 2, 2015; Publicado: 25 Marzo 2015
Derechos de Autor © 2015 Baldini et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del papel
Financiación:. Este trabajo fue el apoyo de una beca (PRIN 2010BX2SNA_007) del Ministero dell'Istruzione, dell'Università e della Ricerca. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
la incidencia de los cánceres de tiroides diferenciados (DTC) ha aumentado en las últimas décadas, debido principalmente a la creciente capacidad de diagnosticar la transformación maligna en pequeños nódulos no palpables [1-4]. DTC comprenden dos principales entidades histológicas, el carcinoma folicular de tiroides rara (FTC) y themore carcinoma papilar de tiroides común (PTC). Después de desdiferenciación DTCare supone para generar mal DTC (PDTC) y los carcinomas de tiroides anaplásico altamente agresivas (ATC) [5-6]. alteraciones moleculares relevantes encontradas en la progresión del cáncer de tiroides comprenden reordenamientos de los genes de receptores de tirosina quinasa, tales como la RET /PTC y NTRK1, la activación de mutaciones puntuales de los genes RAS y BRAF, y la proteína de fusión oncogénica PAX8-PPAR? [7].
El pronóstico de los pacientes con CDT suele ser favorable, con una tasa de 10 años de supervivencia de aproximadamente el 90% de ellos. Sin embargo, alrededor del 20% de los pacientes se enfrentan a la recurrencia de enfermedades y muertes relacionadas con el DTC [8]. La estratificación y el pronóstico de los pacientes con CDT dependen de las variables clínico-patológicas tales como la edad del paciente, tamaño del tumor, histología, linfático ganglionar o metástasis distante [8-11]. Estos parámetros, sin embargo, son capaces de proporcionar solamente una predicción aproximada de la evolución de la enfermedad, la colocación de los pacientes con tiempos muy diferentes de progresión y supervivencia específica de la enfermedad dentro del mismo grupo de riesgo. Del mismo modo, fallan para predecir el riesgo de recurrencia del cáncer. Por lo tanto, se requiere la identificación de nuevos biomarcadores moleculares de pronóstico capaz de declarar la agresividad del tumor [11-17].
La inestabilidad genética que conduce a la celda aneuploidía y la transición a fenotipos más agresivos representa un sello de cánceres sólidos, incluyendo los carcinomas de tiroides [18-22] hecho .En, el número y la frecuencia de las anomalías cromosómicas observadas en los cánceres de tiroides aumente de DTC para PDTC y ATC [5, 20]. Diferentes mitótico quinasas, cuya expresión o función se ha encontrado alterada en las células cancerosas, son responsables de la inestabilidad genética del tumor. Estos incluyen los tres miembros de la familia quinasa Aurora, Aurora-A, -B y -C, implicados en la regulación de los múltiples aspectos de la segregación cromosómica y la citocinesis [23]. Durante el ciclo de la célula, su expresión está estrechamente regulada, siendo máxima en la fase G2 /M, mientras que se requiere su rápida degradación al final de la mitosis por la vía ubiquitina-proteasoma para permitir a la célula a entrar en un nuevo ciclo celular [23 ]. Aurora-A se localiza en los centrosomas duplicados y está involucrada en la entrada en mitosis, la maduración del centrosoma y el husillo, mientras que los asociados Aurora-B con la cromatina donde forma el complejo denominado de pasajeros cromosómica (CPC) con otras proteínas tales como INCENP, survivina y Borealin , participando en el cromosoma condensación [23]. Por otra parte, durante la transición de la anafase a telofase, Aurora-B juega un papel en la dinámica del huso mitótico, las conexiones de los cromosomas al husillo microtúbulos, y surco de segmentación. Aurora-C se expresa principalmente en los testículos y, de manera similar a Aurora-B, se ha demostrado para unirse a la CPC en células mitóticas [23]. Teniendo en cuenta las tareas cruciales de las quinasas Aurora en todas las fases de la mitosis, su disfunción y /o desregulación se hace responsable, al menos en parte, por las divisiones celulares anormales y aneuploidía observados en las células malignas. De acuerdo con esto, la sobreexpresión de Aurora-A y /o Aurora-B se ha demostrado asociarse con un mal pronóstico en varios tumores malignos humanos, incluyendo cáncer de mama, gástrico, de próstata, cabeza y cuello, vejiga, ovario, colon, adrenocortical y pulmón cáncer [24-31].
los datos de nuestros grupos de investigación propia y otra previamente mostraron una expresión alterada de las quinasas Aurora en diferentes líneas celulares derivadas de cáncer de tiroides y tejidos [32-35]. A pesar de estas quinasas están surgiendo nuevas dianas terapéuticas prometedoras para el tratamiento del cáncer de tiroides, no se ha intentado madeso lejos para evaluar el posible valor pronóstico de Aurora quinasas en pacientes con CPT [23, 36-39]. En el presente studywe evaluado, mediante RT-PCR cuantitativa, el nivel de expresión de Aurora-A y Aurora-B en un estudio de caso de 87 tejidos PTC emparejados contra los tejidos normales. Los datos fueron correlacionados con los parámetros clínico-patológicos y con el intervalo libre de enfermedad de los pacientes. Además, ya que el BRAF
mutación V600E, la alteración más frecuente en PTC, fue demostrado recientemente para inducir la expresión de Aurora-B en células de melanoma, los efectos de la mutación BRAF en la expresión de Aurora quinasas en los tejidos de PTC también se evaluó [40]
Materiales y Métodos
Las muestras de tejido, la histología y la estadificación del paciente
El caso de estudio incluyó 87 pacientes consecutivos.; tejidos normales y tumorales de tiroides emparejados se obtuvieron a partir de muestras quirúrgicas de 19 hombres y 68 mujeres (rango de edad 11-83 años, 44.21yrs mediana) que fueron sometidos a tiroidectomía total de PTC en el Departamento de Ciencias Quirúrgicas, Universidad "Sapienza" de Roma (n = 31), o en el Departamento de Ciencias Médicas y quirúrgicas de la Universidad de Padua, Italia (n = 56) haciendo de los pacientes dieron su consentimiento informado por escrito. Durante tres pacientes menores de edad se obtuvo el consentimiento informado por escrito de sus padres. El estudio fue aprobado por el comité de ética del hospital Policlinico Umberto I (Ref. 2615). Se recogieron muestras de tejido, se congelaron en nitrógeno líquido y se almacenan a -80 ° C. De los 87 pacientes con CPT, 76 mostraron la clásica, el 10 folicular, y el 1 de la variante de células altas. Dos histopathologists diferentes hicieron los diagnósticos histológicos de forma independiente de acuerdo con la clasificación de la Organización Mundial de la Salud y de la misma manera a ciegas con respecto a la expresión de quinasa Aurora [41]. En el momento de la cirugía, se encontraron metástasis en los ganglios linfáticos en 38 pacientes. Siguiendo la clasificación TNM, 54 pacientes fueron identificados como estando en la etapa I, 1 en la fase II, 25 en estadio III y IV 7 en la etapa. Cuarenta a cincuenta días después de la cirugía, todos los pacientes fueron sometidos a terapia con yodo radiactivo y la exploración de todo el cuerpo posterior (PEP) mostraron la ausencia de metástasis. Los pacientes entonces comenzaron la terapia de reemplazo de hormona tiroidea. Para determinar su condición de libre de la enfermedad, de 4 a 5 meses más tarde todos los pacientes se les realizó ecografía del cuello y la medición de tiroglobulina (Tg) sérica. Las recurrencias fueron diagnosticadas por citología por aspiración con aguja fina (FNA),
131I PEP o el análisis histológico después de la resección quirúrgica de la lesión. De los 87 pacientes, el seguimiento (mediana de 63 meses, rango 8-133months) estaba disponible para 78 (18 varones y 60 mujeres, con una edad media de 44yr), 52of los que estaban en el estadio TNM I-II y el 26 restante en estadio III-IV. El límite inferior de veces hasta la recidiva comenzó a los 6 meses. Durante los 21 recurrencias de seguimiento se registraron, 17 siendo los ganglios linfáticos cervicales, diagnosticadas por citología FNA, y 4 metástasis pulmonares, diagnosticados por PEP.
Determinación de BRAF
mutación V600E
ADN genómico fue extraído de los tejidos congelados utilizando el kit DNeasy sangre y los tejidos de acuerdo con el protocolo del fabricante. El estado BRAF del exón 15 se evaluó tanto por la secuenciación directa y la amplificación por PCR específica de alelo mutante para la T a realizar una sustitución en el nucleótido 1799 (V600E), utilizando el procedimiento anteriormente describedand de manera a ciegas con respecto a la expresión de quinasa Aurora [42].
PCCL3 cultivo celular
La rata línea de células epiteliales de tiroides bien diferenciado, no transformada PCCL3 fue un regalo del Dr. JA Fagin (Memorial Sloan-Kettering Cancer Center, Nueva York). Las células se propagaron en medio completo H4 consiste en medio /F12 alta de zinc de Coon complementado con suero de 5% fetal bovino, 0,3 mg /ml de L-glutamina, 1 mUI /ml TSH, 10 mg /ml de insulina, 5 mg /ml apo- transferrina, 10 nM de hidrocortisona, y penicilina /estreptomicina. Estas células expresan condicionalmente BRAF
V600E de una manera dependiente de doxiciclina-[43]. El BRAF
inducción V600E se obtuvo mediante la adición de doxiciclina H4 medio completo 1 g /ml, y se incubaron las células durante 48 h.
Extracción y análisis de ARNm
Los tejidos de la tiroides eran homogeneizada con el ultra-Turrax y ARN total fue extraído de los tejidos o células PCCL3 que aplican el método de guanidinio ácido tiocianato-fenol-cloroformo [44]. La primera hebra de ADNc se sintetizó a partir 5 g de ARN con M-MLV transcriptasa inversa y oligo anclado (dT) 23 primers (Sigma Chemicals Co.). controles paralelos para la contaminación de ADN se llevaron a cabo la omisión de la transcriptasa inversa. Las plantillas obtenidas se utilizan para amplificaciones de PCR cuantitativos de las quinasas Aurora y genes de limpieza que emplean el instrumento LightCycler (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania), el SYBR Premezcla Ex Taq II (TliRNase H Plus) (Takara, Otsu, Shiga, Japón) y cebadores específicos enumerados en la Tabla 1. especificidades amplicón fueron verificados por secuenciación automática de ADN (Primm, San Raffaele Biomedical Science Park, Milano, Italia), la evaluación de las temperaturas de fusión, y /o electroforesis en gel de agarosa al 2% que contiene bromuro de etidio. Las curvas de calibración para todos los genes se lograron con cinco diluciones de células PCCL3 o ADNc tejido tiroideo humano mixta. Cálculo de los datos para los tejidos de la tiroides humanos se llevó a cabo por la herramienta de software de expresión relativa (REST 2009), utilizando un factor de normalización (NF) calculado como la media geométrica de 3 genes de referencia (GAPDH, RPL13A y SDHA), como se describe anteriormente [45, 46 ]. El factor de cambio de la expresión de Aurora quinasa para cada muestra de tumor se refirió a su contraparte normal. Este análisis se performedin forma ciega con respecto a los datos histológicos y clínicos de los pacientes. Fold variaciones entre 0,8 y 1,2 se consideraron sin cambio. Los cálculos de los datos de los experimentos en células PCCL3 se llevaron a cabo utilizando el software de cuantificación relativa LightCycler 1.0 (Roche Diagnostics), y la expresión pliegue de Aurora quinasas para las células tratadas con doxiciclina PCCL3 se normalizaron frente a las células no tratadas. Todos los resultados se presentan como media ± SEM y valores de la mediana.
El análisis estadístico
Se utilizó la prueba de Mann-Whitney no paramétrico para calcular la significación estadística de las diferencias en los niveles de expresión de Aurora quinasas en PTC con expresión desregulada en comparación con los niveles de mRNA de PTC sin cambios, y en el tipo salvaje en comparación con muestras de BRAF mutado. Además, la asociación de la expresión de Aurora quinasas con el sexo, la histología, la metástasis en los ganglios linfáticos, el estadio TNM o recurrencias se evaluó mediante la prueba de Mann Whitney. Los análisis de la correlación entre Aurora-A y los niveles de Aurora-B ARNm, así como entre éstas y la edad se realizaron utilizando la prueba de Rho de Spearman. Para evaluar la asociación independiente de quinasas Aurora con DFI, se aplicó el texto de regresión de Cox. El impacto de la expresión de la quinasa Aurora en el intervalo libre de enfermedad (DFI) se evaluó mediante el análisis de Kaplan-Meier se combina con Mantel-Cox log-rank. Para el análisis de Kaplan-Meier, los valores de la quinasa Aurora se dividieron en tres grupos en función de aumento, sin cambios o disminución de la expresión de quinasa. Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando la versión 8.0 del software Stata (Stata Corporation 2003, College Station, TX). Los resultados se consideraron significativamente diferentes valores de p inferiores a 0,05.
Resultados
La expresión de Aurora quinasas en el cáncer papilar de tiroides (PTC) tejidos
Los análisis de Aurora-A y los niveles de Aurora B-mRNA en tejidos de PTC, en comparación con sus tejidos emparejados normales, revelaron que Aurora-a mRNA levelswere desregulado en 55 (63,2%) de 87 muestras de PTC, con un aumento de 30 y una disminución en 25 (Fig. 1A). los niveles de Aurora B-mRNA se alteran en 79 (90,8%) de 87 muestras, siendo regulado hasta en el 57 y las reguladas en 22 (fig. 1B) de los casos. Como se informó en la Fig. 1C, los niveles de mRNA de Aurora-A y Aurora-B se correlacionaron positivamente entre sí (p = 0,001).
A y B) Las variaciones en la expresión de Aurora-A y Aurora-B en el cáncer papilar de tiroides tejidos. Los cambios veces se calcularon teniendo en cuenta la Aurora-A o los niveles de ARNm de Aurora-B observadas en el tejido tiroideo normal, emparejado igual a 1. La evaluación estadística de los datos se realizó usingthe prueba no paramétrica de Mann-Whitney. Las pequeñas barras del gráfico indican los valores de la mediana. C) Análisis de correlación de Aurora-A y Aurora-B ARNm en tejidos de PTC. Los datos fueron evaluados mediante la aplicación de la prueba de Spearman Rho.
BRAF
mutación V600E y expresión de quinasa Aurora en tejidos PTC
Para evaluar el efecto de BRAF
mutación V600E en la expresión de Aurora-a y Aurora-B se analizaron en primer lugar el nivel de mRNA de los genes en BRAF
tumores V600E PTC (n = 37), en comparación con aquellos que albergan la proteína de tipo salvaje (n = 38) (Fig. 2A). Los resultados mostraron que thepresence del BRAF
V600Emutation no afectó los niveles de expresión de Aurora-A o Aurora-B en los tejidos de PTC, en comparación con la de tipo salvaje tejidos BRAF PTC. Para corroborar estas
in vivo
observaciones, se realizó un
in vitro
experimentos en ratas línea bien diferenciado, no transformado células epiteliales PCCL3, caracterizado por un dependiente de doxiciclina BRAF
V600E sistema de expresión [50]. En estas células el BRAF
expresión V600E y la posterior inducción de la vía de fosforilación MEK /ERK apareció 12 horas después de la adición de doxiciclina y la expresión total de BRAF (endógeno de tipo salvaje + inducida mutante V600E) a las 48 h se estimó en ser 2 veces mayor que el control. Como se informó en la Fig. 2B, el tratamiento de PCCL3 con doxiciclina (1 mg /ml durante 48 h) no afectó los niveles de ARNm de Aurora quinasa.
A) Expresión de Aurora-A y Aurora-B en tejidos de cáncer de tiroides papilar con tipo salvaje (n = 38) o BRAF mutado (n = 37). Los cambios veces se calcularon teniendo en cuenta la Aurora-A o nivel de Aurora-B ARNm observado en el tejido tiroideo normal, emparejado igual a 1. La evaluación estadística de los datos se realizó mediante la aplicación de la prueba de Mann Withney no paramétrico. Las pequeñas barras del gráfico indican los valores de la mediana. B) Efecto de BRAF
V600E en Aurora quinasas ARNm en células PCCL3. Estos últimos fueron inducidos para expresar BRAF
V600E de una manera dependiente de doxiciclina. Los cambios veces de Aurora quinasa mRNA se normalizaron en contra de las células no tratadas.
relevancia pronóstica de la expresión de la quinasa Aurora en PTC pacientes
Las variaciones en la expresión de Aurora-A no hizo asociar con cualquiera de los parámetros clínico analizadas (Tabla 2), mientras que una correlación positiva (p & lt; 0,001) se encontró entre los niveles de Aurora B-mRNA y el tamaño del tumor (Tabla 2) análisis .El Kaplan-Meier demostrado ninguna correlación entre los pacientes sin enfermedad quinasa Aurora intervalo y altura o baja regulación (Fig. 3). El análisis multivariado mostró que el aumento o la reducción de la expresión de Aurora-A o Aurora-B, el estadio TNM, la edad o la BRAF
mutación V600E no para predecir la enfermedad resultados (Tabla 3). Sólo las hembras mostraron una reducción estadísticamente significativa de la tasa de riesgo (HR 0,286) para las recurrencias de la enfermedad (Tabla 3) guía.
El análisis de Kaplan-Meier se combina con Mantel-Cox prueba estadística log-rank realizado en 75 pacientes con CPT followed- desde 8 a 133 meses.
Discusión
en estudios previos, nuestra y de otros grupos de investigación demostraron una expresión desregulada de Aurora quinasas en diferenciado de tiroides anaplásico y tejidos de cáncer [23]. Esto fue confirmado en el presente estudio donde se encontró Aurora-A y la expresión del gen de Aurora-B, ya sea hasta reguladas o hacia abajo reguladas (63,2% y 90,8%, respectivamente) en la mayor parte del cáncer papilar de tiroides (PTC) los tejidos analizados, en comparación con sus tejidos de la tiroides normales emparejados. Vale la pena mencionar que, o bien la regulación al alza o la baja regulación de Aurora quinasas pueden resultar proliferatively ventajoso para las células del cáncer de tiroides. De hecho, diferentes informes demostraron que la cantidad de Aurora-A proteinin el centrosoma es crítica para sus funciones de replicación y de la mitosis, y que, o bien una falta o exceso de plomo Aurora-Acan a la mitosis anormal, así como a la segregación cromosómica y citocinesis defectos [ ,,,0],47].
recientemente se ha demostrado que en células de melanoma la expresión de Aurora-B y la proteína quinasa Wee1-como se induce por la presencia de BRAF
V600E [40]. Desde BRAF
mutación V600E se encuentra con frecuencia en el CPT, también tratamos de determinar si la mutación en las células del cáncer de tiroides se asoció a una mayor expresión de las quinasas Aurora. En nuestra serie, el estado de BRAF se evaluó en 75 tejidos PTC y BRAF
V600E se encontró en 37 (49,3%) de ellos. Sin embargo, no hubo diferencia en Aurora-A o Aurora-B expresión levelswas encuentra entre el tipo silvestre y BRAF
tejidos V600E PTC. Estas observaciones fueron confirmedby
in vitro
experimentos en células tiroideas PCCL3 rata, que expresan el BRAF V600E
en una forma dependiente de doxiciclina [43]. De hecho, el tratamiento de estas células con doxiciclina no afectó el nivel de expresión de cualquiera de Aurora-A o Aurora-B
.
Durante la última década, un número de informes indican que la sobreexpresión de Aurora-A o Aurora-B representa un factor pronóstico negativo en varios tumores malignos humanos, incluyendo cáncer de mama, gástrico, de próstata, cabeza y cuello, vejiga, ovario, colon, cánceres adrenocorticales y de pulmón [25-32]. Menos estudios, sin embargo, asocian la sobreexpresión de Aurora-A o Aurora-B con un pronóstico favorable en los colorrectal, gástrico y carcinomas de ovario [48-50]. Hasta la fecha, ninguna información sobre el posible papel pronóstico de Aurora quinasas en el cáncer diferenciado de tiroides ha sido reportado. En este contexto, estamos aquí evaluamos la importancia pronóstica de Aurora-A y los niveles de Aurora B-mRNA en una serie de 78 PTC, con una mediana de seguimiento de 63 meses. Los análisis univariados documentaron la falta de asociación entre Aurora-A expresión y clinicopathological parámetros, incluyendo la edad, el sexo, el tamaño del tumor, metástasis a los ganglios linfáticos, la histología, TNM, BRAF y recurrencias. Del mismo modo, la expresión de Aurora-B no se correlacionó con cualquiera de estos parámetros con la excepción del tamaño del tumor, en los que los niveles de mRNA fueron significativamente mayores en T (3-4) tejidos, con respecto a (1-2) tejidos T. Kaplan-Meyer y análisis multivariados confirmaron que la expresión desregulada de Aurora quinasas no es un biomarcador pronóstico de pacientes con cáncer de tiroides papilar. En el análisis multivariante sexo femenino mostró un efecto protector significativo (cociente de riesgos instantáneos 0,286, p = 0,021). Este último está de acuerdo con dos estudios recientes realizados en grandes series de casos que muestra el papel protector del género femenino en la supervivencia específica de la enfermedad [51, 52] .Se ha de mencionarse que un límite del presente estudio es la relativa baja número de pacientes analizados, que proporcionan una potencia estadística (1-β) de 0,63.
Conclusiones
En conclusión, aunque los datos reportados hereneed ser confirmadas por medio de grandes estudios de casos, se demostró que la expresión de Aurora quinasas está desregulado en la mayoría de los tejidos de PTC, y probablemente contribuye a la progresión PTC y aneuploidía de células de cáncer. Sin embargo, a diferencia de otros cánceres sólidos humanos, Aurora-A o la expresión de Aurora-B en el nivel de mRNA no es un biomarcador de pronóstico en el caso de pacientes con CPT.