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PLOS ONE: expresión desregulada de SRC, Lyn y CKB quinasas mediante la metilación del ADN y su posible papel en el cáncer gástrico capacidad de invasión y Metastasis


Extracto

Las quinasas son moduladores de bajada y efectores de varias cascadas de señalización celular y juegan un papel clave en el desarrollo de la enfermedad neoplásica. En este estudio, el objetivo fue evaluar SRC, LYN y proteína CKB y la expresión de ARNm, así como su metilación promotor, en el cáncer gástrico. Encontramos elevada expresión de SRC y LYN cinasa ARNm y proteínas, pero disminución de los niveles de CKB quinasa, alteraciones que pueden tener un papel en la invasión y la metástasis de tumores gástricos. La expresión de las tres quinasas estudiadas también se asoció con la expresión de oncogenes MYC, un posible biomarcador para el cáncer gástrico. Para comprender los mecanismos que regulan la expresión de estos genes, se evaluó el promotor de la metilación del ADN de los tres quinasas. Hemos encontrado que reduce
SRC
y
LYN
metilación y el aumento de
CKB
metilación se asoció con el cáncer gástrico. El reducido
SRC
y
LYN
metilación se asoció con un aumento de los niveles de ARNm y la expresión de proteínas, lo que sugiere que la metilación del ADN está implicado en la regulación de la expresión de estas quinasas. Por el contrario, la reducción de
CKB
metilación se observó en las muestras con ARNm reducida y expresión de la proteína, se encontró que sugiere la expresión de CKB sólo para ser regulada en parte por la metilación del ADN. Además, se encontró que las alteraciones en el patrón de metilación de ADN de los tres quinasas estudiadas también se asociaron con la aparición cáncer gástrico, cáncer gástrico avanzado, más profunda la invasión tumoral y la presencia de metástasis. Por lo tanto, SRC, expresión y LYN CKB o la metilación del ADN podría ser un marcador útil para predecir la progresión del tumor y la focalización en las estrategias contra el cáncer

Visto:. Mello AA, Leal MF, Rey JA, Pinto GR, Lamarão LM, Montenegro RC, et al. (2015) La expresión desregulada de SRC, Lyn y CKB quinasas mediante la metilación del ADN y su posible papel en el cáncer gástrico capacidad de invasión y metástasis. PLoS ONE 10 (10): e0140492. doi: 10.1371 /journal.pone.0140492

Editor: José G. Treviño, Universidad de Florida, Estados Unidos |
Recibido: 27 de mayo de 2015; Aceptado: September 25, 2015; Publicado: 13 Octubre 2015

Derechos de Autor © 2015 Mello et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan

Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y

Financiación:. Este estudio fue apoyado por el Consejo Nacional de Desarrollo Científico y Tecnológico (CNPq; subvenciones#471072 /2012-5 y 402283 /2013-9; beca para MCS y RRB), Fundación de Amparo a Pesquisa do Pará (FAPESPA; conceder #ICAAF 123/2014 de la RRB) y la Fundación de Amparo a la Investigación del Estado de São Paulo (FAPESP; subvención#2009 /07145-9; beca para MFL) como subvenciones y becas. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito

Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia

Introducción

el cáncer gástrico (CG) es el cuarto tipo de cáncer más frecuente y la segunda causa de mortalidad por cáncer en todo el mundo [1]. El tratamiento de la GC en las etapas avanzadas sigue siendo difícil, y el pronóstico es aún pobre, en parte como resultado de la recurrencia local, la invasión tumoral y /o metástasis. La tasa de supervivencia relativa a 5 años en general es actualmente menos del 20% [2]. Una mejor comprensión de la biología de la progresión de esta neoplasia es crucial para la reducción de la tasa de mortalidad con el desarrollo de nuevos manejo del paciente y estrategias terapéuticas.

Fosfotransferasas, también conocida como quinasas, son moduladores de aguas abajo y efectores de varios cascadas de señalización celular y juegan un papel clave en el desarrollo de la enfermedad neoplásica [3]. Hasta la fecha, varios fármacos proteína quinasa interacción se han registrado para los ensayos clínicos [4]. Se realizó previamente cribado para identificar proteínas quinasa expresadas en GC usando espectrometría de masas de captura compuesto [5, 6] (S1 del archivo), y 22 proteínas quinasa, incluyendo SRC, Lyn y CKB, se detectaron (Tabla S1). Se seleccionaron estos tres quinasas para investigaciones posteriores (Fig S1).

SRC fue el primer proto-oncogén descubierto, y desempeña un papel central en vías de transducción de señales celulares. actividad aberrante SRC se observa en varios cánceres humanos, incluyendo GC [7-9], y puede ser importante durante el desarrollo y progresión del tumor [10, 11]. La función mitogénica de SRC es, al menos en parte, mediada por la inducción de MYC, un regulador del ciclo celular y el factor de transcripción [12, 13]. Nuestro grupo ha descrito previamente en la regulación positiva MYC GC humanos y en primates no humanos N-metil-nitrosourea tratados [14-19]. Debido a que la activación de SRC, así como la de otras quinasas, tiene efectos pleiotrópicos que dependen del tipo de célula y el contexto [20], todavía es importante entender la posible relación entre las quinasas y expresión MYC en la carcinogénesis gástrica y el mecanismo molecular implicados en su regulación.

LYN es otro miembro de la familia de quinasas SRC, y el
LYN
gen se localiza en el cromosoma 8q13. Nuestro grupo informó anteriormente la presencia de las ganancias del cromosoma 8 (en la que
MYC
gen está también situado el GC) en los casos de Brasil del Norte [16, 21-23] y en todas las líneas celulares establecidas a partir de GC en las neoplasias esta población [24, 25]. Por lo tanto, este cromosoma puede contener importantes genes implicados en la carcinogénesis gástrica. Hasta donde sabemos, ningún estudio previo ha investigado el papel de LYN y su regulación en GC. Sin embargo, la sobreexpresión LYN ha sido reportado en varios tipos de cáncer [26-32]. Además, la regulación de los
LYN fotos: por la metilación del ADN se demostró tanto en el cáncer colorrectal y el sarcoma de Ewing [33, 34], y
LYN
metilación se ha observado en algunos hematopoyético y no hematopoyético líneas celulares [35]. La metilación del ADN es una modificación molecular de ADN que está estrechamente asociado con la función del gen y específicos del tipo celular función del gen [36]. Por otra parte, la metilación del ADN puede ser un biomarcador robusto, ya que es mucho más estable que el ARN o la proteína y por lo tanto es un objetivo prometedor para el desarrollo de nuevos enfoques para el diagnóstico y pronóstico de cánceres [36].

CKB es una de las dos isoformas citosólicas de la creatina quinasa y pueden participar en los procesos metabólicos que implican la glucólisis en células no musculares [37]. En contraste con las células normales, que generan principalmente energía a través de la fosforilación oxidativa, la mayoría de las células cancerosas prefieren glucólisis aeróbica, que se conoce como el efecto Warburg [38]. Curiosamente, el oncogen MYC parece activar varios transportadores de glucosa y las enzimas glucolíticas, contribuyendo así al efecto Warburg [39]. Nuestro estudio proteómico anterior reveló que varias proteínas implicadas en los procesos de producción de energía fueron desregulados en muestras de GC y se refuerza el efecto Warburg en esta neoplasia [40]. El papel de CKB en GC sigue siendo poco conocida: algunos estudios de transcriptómica informaron de la regulación al alza de
CKB Hoteles en muestras de GC [41, 42], mientras que otro mostró
CKB
regulación a la baja [43]. Además, como para el
LYN
gen,
CKB
metilación se describió anteriormente en hematológica y líneas de células de cáncer sólido, incluyendo líneas celulares de GC [44]. La metilación de
CKB
parece estar relacionada a su nivel reducido de expresión; Sin embargo, más investigación sigue siendo necesaria para entender la regulación de los
CKB fotos: por modificaciones epigenéticas.

Por lo tanto, lo primero que tuvo como objetivo evaluar la expresión del ARNm y la proteína de SRC, Lyn y CKB en un gran conjunto de muestras de GC. A continuación, se evaluó si estos genes pueden estar regulados por la metilación del ADN en la carcinogénesis gástrica. Además, se investigó la posible asociación entre la expresión de la quinasa o metilación y variables clínicas, así como la expresión de MYC y metilación.

Material y Métodos

Las muestras de tejido
expresión
quinasa y los patrones de metilación se evaluaron en 138 pares de muestras de GC y sus correspondientes muestras de tejido gástrico no neoplásicas obtenidas de pacientes que se sometieron a gastrectomía en el norte de Brasil. Todos los pacientes tenían antecedentes negativos de la exposición a la quimioterapia o la radioterapia antes de la cirugía, y no había co-ocurrencia de otros tipos de cáncer diagnosticados. Este estudio fue aprobado por el Comité Ético del Hospital João de Barros Barreto Universidad (Protocolo#316737). Se obtuvo el consentimiento informado por escrito con la aprobación del comité de ética de todos los pacientes antes de la recogida de muestras.

Una parte de cada muestra de tumor fue diseccionado fijado en formol e incluido en parafina (FFPE). Secciones de tejido FFPE se tiñeron con hematoxilina-eosina para la evaluación histológica o se utilizan para el análisis de inmunohistoquímica (IHC). Las porciones adicionales de cada tumor y muestras de tejido no neoplásicas fueron emparejados instantánea congelada en nitrógeno líquido y se almacenan a -80 ° C hasta el momento de proteínas y purificación de ácidos nucleicos.

Todas las muestras fueron clasificadas de acuerdo con Lauren [45 ], y los tumores se organizaron de acuerdo a los criterios de estadificación TNM [46]. La presencia de
Helicobacter pylori
, un carcinógeno de clase I, en las muestras gástricas fue detectado por la prueba rápida de ureasa, y su gen asociado factor de virulencia citotoxicidad A (gen CagA) fue la detección por PCR utilizando ADN purificado de forma simultánea con las proteínas y el ARNm, según lo realizado anteriormente por nuestro grupo [47]. El virus de Epstein-Barr (VEB) se detectó por ARN hibridación in situ [47].

En 49 de estos pares de muestras neoplásicas y no neoplásicas, se evaluó la inmunorreactividad MYC, expresión de ARNm y de estado de metilación de datos previamente publicado por nuestro grupo [18].

la proteína, ARNm y ADN de purificación

la proteína total, ARNm y ADN fueron al mismo tiempo aislado de muestras de tejido gástrico utilizando el /ARN Kit de ADN AllPrep /proteína ( Qiagen, Alemania) según las instrucciones del fabricante. El sedimento de proteína se disolvió en un tampón que contiene 7 M urea, tiourea 2 M, 4% de CHAPS, DTT 50 mM, 1% inhibidor de la proteasa Cocktail (Sigma-Aldrich, EE.UU.), y 0,5% de cada uno de cóctel fosfatasa inhibidor 1 y 2 (Sigma -Aldrich, EE.UU.), tal como se realizó anteriormente por nuestro grupo [48]. Las concentraciones de proteína se determinaron por el método de Bradford (Sigma-Aldrich, EE.UU.). La concentración de ARN y la calidad se determinaron usando un espectrofotómetro NanoDrop (Kisker, Alemania) y 1% geles de agarosa, respectivamente. Las muestras fueron almacenadas a -80 ° C hasta su uso.

El análisis de proteínas inmunorreactividad

secciones de tejido tumoral (3 o 4 mm de espesor) se deparaffinized en xileno y rehidratada en una serie graduada de etanol. Después de la recuperación de epítopo inducida por calor, las secciones de tejido se incubaron con anticuerpos monoclonales de ratón primaria contra SRC (dilución 1: 400; clon 28, Life Technologies, EE.UU.), LYN (dilución 1: 400; clon C13F9; Life Technologies, EE.UU.) o CKB (dilución 1: 250; HPA001254, Santa Cruz Biotechnology, EE.UU.). Se utilizó un kit de anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa universal (System LSAB, DakoCytomation, EE.UU.) para la detección. Utilizamos 3,30-diamino-bencidina /H
2O
2 (Dako, Dinamarca) como cromógeno y hematoxilina como el colorante de contraste. Una muestra de proteína inmunoreactividad positiva se define como uno que tiene 10% o más células neoplásicas que fueron positivas para la proteína.

Se realizó el análisis de expresión de proteínas

Western blot como se describió anteriormente por nuestro grupo [49]. proteína reducido (25 g) de cada muestra se separó por 12,5% homogénea SDS-PAGE y electro-transfirieron a una membrana de PVDF (Hybond-P, GE Healthcare, EE.UU.). La membrana de PVDF se bloqueó con solución salina tamponada con fosfato que contiene 0,1% de Tween 20, y 5% de leche baja en grasa y se incubaron durante la noche a 4 ° C con los correspondientes anticuerpos primarios: anti-SRC (dilución 1: 1000; clon 28, Life Technologies, EE.UU.), anti-LYN (dilución 1: 1000; clon C13F9; Life Technologies, EE.UU.), anti-CKB (dilución 1: 400; HPA001254, Santa Cruz Biotechnology, EE.UU.), y anti-ACTB (dilución 1: 250; Ac -15, Life Technologies, EE.UU.). Después de un lavado extenso, se añadió un anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa durante 1 hora a temperatura ambiente. Las bandas inmunorreactivas se visualizaron utilizando el reactivo luminol Western Blot, y las imágenes fueron adquiridas mediante un sistema de imagen digital ImageQuant 350 (GE Healthcare, Suecia). ACTB se utilizó como control de carga de referencia.

expresión de ARNm de análisis

En primer lugar, el ARN fue inverso-transcrito utilizando la alta capacidad de cDNA Archivo kit de acuerdo con el protocolo del fabricante (Life Technologies, EE.UU.) . El ADN complementario se amplificó por tiempo real de transcripción inversa cuantitativa PCR (RT-qPCR) utilizando sondas TaqMan comprados como los productos ensayos-on-demand para la expresión génica (Life Technologies, EE.UU.) y un Fast Real-Time instrumento 7500 PCR (Life Technologies , ESTADOS UNIDOS). El
GAPDH
gen fue seleccionado como un control interno para la entrada de ARN y la transcripción inversa-eficiencia. Todos RT-qPCRs se realizaron por triplicado tanto para los genes diana (
SRC
: Hs01082246_m1;
LYN
: Hs00176719_m1;
CKB
: Hs00176484_m1) y el control interno (
GAPDH
:. NM_002046.3)

La cuantificación relativa de la expresión génica se calculó según Livak y Schmittgen [50]. La muestra de control correspondiente se designó como calibrador de cada tumor.

análisis de la metilación del ADN

El patrón de metilación y la frecuencia de los genes quinasa se evaluaron mediante PCR específica de metilación (MSP) [51]. El Kit de ADN EZ metilación-relámpago ™ (Zymo Research, EE.UU.) se utilizó para modificar el gDNA por tratamiento con bisulfito, la conversión de citosinas no metiladas en uracilos y citosinas metiladas dejando sin cambios. cebadores específicos para los promotores de genes se describen en la Tabla 1.

reacciones de PCR se llevaron a cabo utilizando 0,1 mol /L de dNTPs, 2 mol /L MgCl
2, 0,5 mol cebadores, 1,25 U Taq ADN polimerasa, y 100 de ADN bisulfite modificados ng. Después de la desnaturalización inicial de 5 min a 94 ° C, 40 ciclos a 94 ° C durante 45 s, la temperatura de hibridación (Tabla 1) durante 45 s, y 72 ° C durante 30 s se llevaron a cabo, seguido de una extensión final de 5 min a 72 ° C. Los productos de PCR se cargaron directamente sobre 3% geles de agarosa y electroforesis. El gel se tiñó con SYBR
® Segura gel de ADN de manchas (Life Technologies, EE.UU.) y se visualizó directamente bajo iluminación UV. Como control positivo para todas las reacciones de MSP, una muestra gDNA estaba completamente metilado usando CpG metilasa (SssI, New England Biolabs, EE.UU.) siguiendo las instrucciones del fabricante. Además, se utilizaron cebadores para la detección de la secuencia de tipo silvestre para controlar la conversión completa de ADN obtenido en la reacción de bisulfito

Las muestras fueron estratificados como sigue:. 1) una muestra se definió como hypomethylated cuando una amplificación positiva producto se detectó sólo en la PCR con cebadores específicos para las secuencias no metiladas; 2) una muestra se definió como hypermethylated cuando se detectó amplificación positiva sólo en la PCR con cebadores específicos para secuencias metiladas; 3) una muestra se define como parcialmente metilado cuando se detectó amplificación positiva en la PCR con los dos conjuntos de cebadores.

Los cebadores especificidad 'y los resultados fueron confirmados MSP utilizando un enfoque de secuenciación de bisulfito PCR (BSP) [52] . BSP también se utilizó para evaluar el porcentaje de metilación. Los cebadores y Anneling temperaturas de BSP se describen en la Tabla 1. Después de la amplificación, los fragmentos fueron purificados utilizando el Gel NucleoSpin y PCR Clean-up Kit (Macherey-Nagel, Alemania), se ligaron en pGEM T-fácil vector (Promega, Alemania) y se clonó en competente
e
.
coli
células JM109. Después de tiempo de incubación, se seleccionaron colonias blancas para PCR con M13 hacia adelante (5'-TGTAAAACGACGGCCAGT-3 ') y M13 inverso (5' CAGGAAACAGCTATGAC-3 ') primers [53]. Después de la desnaturalización inicial de 3 min a 94 ° C, la amplificación de PCR consistió en 35 ciclos a 94 ° C durante 30 s, 55 ° C durante 30 s, y 72 ° C durante 90 s se llevaron a cabo, seguido de una extensión final de 5 min a 72 ° C. Los productos de PCR se visualizaron en gel de agarosa. Se seleccionaron seis clones para la purificación y se secuenciaron en un secuenciador automático ABI310 (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.). Todas las secuencias fueron alineadas con BioEdit v7.0.5 [54], y los análisis de metilación se realizaron con el software BIQ analizador [55]. El porcentaje de metilación para cada muestra se calculó dividiendo el número de CpG metilados por el número total de CpG secuenciado (GPC en todos los seis clones).


análisis estadísticos
Los datos se muestran como la gama de frecuencias, la mediana y rango intercuartil (IQR). Se utilizó la prueba de Shapiro-Wilk para evaluar la distribución de la edad, el mRNA, expresión de la proteína y el porcentaje de metilación de datos y para determinar la prueba posterior apropiado para las comparaciones estadísticas. Se utilizó la prueba de Mann-Whitney para investigar posibles asociaciones entre el ARNm o expresión de la proteína quinasa y las variables categóricas, como la inmunorreactividad, patrón de metilación y las características clínico-patológicas. Se utilizó la prueba de Mann-Whitney para investigar posibles asociaciones entre el porcentaje de metilación y la inmunorreactividad y las características clínico-patológicas. Se utilizó la prueba de Wilcoxon para comparar el porcentaje de metilación entre pares de muestras neoplásicas y no neoplásicas. Una asociación entre variables categóricas se analizaron mediante la prueba de Chi-cuadrado (χ
2). Se utilizó una prueba de correlación de Spearman para evaluar la posible correlación entre el ARNm y la expresión de proteínas, así como la metilación del promotor. Un valor de p menor de 0,05 fue considerado significativo. Se aplicó el ajuste de Bonferroni de la p-valor cuando se realizaron comparaciones múltiples, con el nivel alfa se divide por el número de comparaciones.

Resultados

quinasa expresión en tumores gástricos

células gástricas no atípicos no presentaron SRC o inmunorreactividad LYN (figura 1A y 1C). Sin embargo, se observó inmunorreactividad SRC en las células displásicas. se detectó la membrana celular y la inmunorreactividad citoplásmica de SRC y LYN en las células neoplásicas (Figura 1B y 1D), y LYN también presentaron inmunorreactividad nucleico. se detectó CKB inmunoreactividad en el citoplasma o en la membrana celular en las células gástricas no neoplásicas (Fig 1E). En contraste, las células GC no presentaron CKB inmunoreactividad (Figura 1F)

A) mucosa gástrica sin SRC inmunorreactividad.; B) el cáncer gástrico de tipo difuso presentación de la membrana celular y la inmunorreactividad citoplásmica de SRC; C) de tejido gástrico no neoplásico sin LYN inmunorreactividad; cáncer gástrico D) de tipo intestinal que presenta LYN inmunorreactividad; E) la mucosa gástrica no neoplásica que muestra débil tinción citoplásmica CKB en las células glandulares; F) de tipo difuso células de cáncer gástrico sin CKB inmunorreactividad.

SRC, LYN y inmunorreactividad CKB se detectó en 72 (52,2%), 66 (47,8%) y 0 (0%) del tumor muestras. SRC y la inmunorreactividad LYN se asociaron con mayores niveles de ARNm y proteínas en muestras de GC (P & lt; 0,001, para todas las comparaciones; prueba de Mann-Whitney; la figura 2A, 2C, 2E y 2G). Los niveles de proteína y ARNm de SRC se aumentaron al menos 1,5 veces (por lo menos un aumento del 50% en la expresión) en 67 (48,6%) y 80 (58%), respectivamente, las muestras de GC en relación con su gástrica no neoplásica emparejado muestras (Fig 2B, 2D y 2K). Por otra parte, la proteína y los niveles de ARNm de LYN se aumentaron al menos 1,5 veces en 36 (26,1%) y 72 (52,2%) muestras de GC, respectivamente (Fig 2F, 2H y 2K). Por el contrario, se detectó regulación a la baja de la proteína CKB y ARNm (por lo menos 50% de disminución de la expresión) en 104 (75,4%) y 49 (35,5%) muestras de GC, respectivamente (Fig 2I, 2J y 2K). Se observó una correlación fuerte y directa entre el ARNm y la expresión de la proteína SRC (p & lt; 0,001, ρ = 0,856, Spearman prueba de correlación), LYN (p & lt; 0,001, ρ = 0,762) y CKB (p & lt; 0,001, ρ = 0,819)

A) Asociación entre SRC inmunorreactividad y su expresión de la proteína.; B) expresión de la proteína SRC; C) Asociación entre SRC inmunorreactividad y su expresión de ARNm; D)
SRC
la expresión del ARNm. E) Asociación entre LYN inmunorreactividad y su expresión de la proteína; F) LYN expresión de la proteína; G) Asociación entre LYN inmunorreactividad y su expresión de ARNm; H)
LYN
la expresión del ARNm; I) la expresión de proteínas CKB; J)
CKB
la expresión del ARNm; K) imagen representativa de Western-blot, en cada TNM de cada muestra es espectáculo. Las proteínas y la expresión del ARNm se determinaron por Western-blot y análisis de RT-qPCR, respectivamente. En todos los gráficos, la expresión en tumores gástricos se normalizó por tejido gástrico no neoplásico emparejado. * Diferencia significativa entre los grupos de Mann-Whitney (p & lt; 0,05). IHC +: casos que presentan inmunorreactividad de la proteína; IHC-: casos sin inmunoreactividad de proteínas; . NM: muestra normal mucosa

La inmunorreactividad del SRC se asoció con la inmunorreactividad de LYN (p & lt; 0,001, χ
2 test), con 52 (37,7%) de las muestras de GC la presentación de inmunoreactividad para ambas proteínas. Además, se observó una correlación directa entre el SRC y la proteína LYN (p & lt; 0,001, ρ = 0,556) y el ARNm (p & lt; 0,001, ρ = 0,779) expresión. Los niveles de proteína CKB y la expresión de ARNm fueron correlacionados inversamente con SRC (p & lt; 0,001, ρ = -0.734; p & lt; 0,001, ρ = -0,806, respectivamente) y LYN (p & lt; 0,001, ρ = -0.643; p . & lt; 0,001, ρ = -0,703, respectivamente)

la Tabla 2 muestra los resultados para SRC, LYN y la expresión de CKB y las características clínico-patológicas. Los tumores de los pacientes con GC de aparición tardía presentaron significativamente mayor SRC y la proteína LYN (por IHC y transferencia de Western) y el ARNm (por RT-qPCR) expresión, así como la reducción de la expresión de proteínas CKB por Western Blot, en comparación con inicio temprano CG muestras (p & lt; 0,05, para todas las comparaciones; Tabla 2). Aumento de la proteína y la expresión del ARNm de SRC y LYN y expresión CKB reducida se asociaron con la etapa avanzada, más profunda invasión tumoral, y la presencia de ganglios linfáticos y metástasis distantes (p & lt; 0,05, para todas las comparaciones; Tabla 2)


se observó un aumento significativo gradual en proteínas SRC (por Western Blot), y la expresión de ARNm correspondiente a la etapa del tumor (p & lt; 0,008, para la mayoría de las comparaciones; prueba de Mann-Whitney seguido por corrección de Bonferroni; Fig 3A y 3B). Por el contrario, una disminución significativa gradual en proteínas y mRNA expresión CKB se observó correspondiente a la etapa del tumor (p & lt; 0,008, para la mayoría de las comparaciones; Fig 3G y 3H). Con respecto a la expresión LYN, no se observó una diferencia significativa entre las etapas I y II o entre las etapas III y IV. Sin embargo, las etapas I y II fueron significativamente diferentes de las fases III y IV (p & lt; 0,008, para estas comparaciones; Fig 3D y 3E)

A) expresión de la proteína SRC.; B)
SRC
la expresión del ARNm; C) Porcentaje de
SRC
metilación; D) expresión de la proteína LYN; E)
LYN
la expresión del ARNm; F) Porcentaje de
LYN
metilación; G) CKB expresión de la proteína; H)
CKB
la expresión del ARNm; I) Porcentaje de
CKB
metilación. Las proteínas y la expresión del ARNm se determinaron por Western-blot y análisis de RT-qPCR, respectivamente. En estos análisis de expresión, la expresión en tumores gástricos se normalizó por tejido gástrico no neoplásico emparejado. la metilación del ADN se determinó mediante secuenciación de bisulfito de PCR. * Diferencia significativa entre los grupos mediante la prueba de Mann-Whitney, seguido de las correcciones de Bonferroni para el análisis de comparación múltiple (p & lt; 0,008); ** Diferencia significativa entre los grupos mediante la prueba de Mann-Whitney, seguido de las correcciones de Bonferroni para el análisis de comparación múltiple (p & lt; 0,001);
+ Diferencia entre los grupos, pero no estadísticamente significativa después del ajuste de Bonferroni (p & lt; 0,05).

quinasa de genes patrones de metilación en muestras gástricas

La Tabla 3 muestra el patrón de metilación de las proteínas quinasas estudiadas en muestras gástricas neoplásicas y no neoplásicas por MSP. Aproximadamente el 60% y el 30% de las muestras presentaron GC positivo de amplificación sólo con el conjunto de cebadores metilados (muestras hypomethylated) para el
SRC
y
LYN
genes, respectivamente (Fig 4A y 4B). La hipometilación de estos genes no se observó en ninguna muestra no neoplásico. Por lo tanto, la frecuencia de
SRC
y
LYN
hipometilación fue significativamente mayor en GC que en las muestras gástricas no neoplásicas (p & lt; 0,001, para todas las comparaciones, seguido χ
2 de prueba por las correcciones de Bonferroni) guía empresas
a)
SRC
análisis de la metilación del promotor, en el que las muestras 1 y 2 presentan promotor hypomethylated, la muestra 3 presentó metilación parcial y la muestra 4 presentan promotor hypermethylated.; B)
LYN
análisis de la metilación del promotor, en el que las muestras 1 presentó promotor hypomethylated, muestra 2 presentó metilación y las muestras 3 y 4 parciales presentó promotor hypermethylated; C)
CKB
análisis de la metilación del promotor, en el que las muestras 1 y 2 presentan promotor hypermethylated, y las muestras 3 y 4 presentan promotor hypomethylated. C: blanco; C +: control positivo, la muestra ADNg completamente metilado; T: PCR con el juego de primers no metilado; M: PCR con conjunto de cebadores metilados; MW: marcador de peso molecular; pb:. pares de bases

El análisis BSP confirmó el análisis de MSP. Por BSP, 82 (59,4%) de las muestras neoplásicas y 0 (0%) de las muestras no neoplásicas presentado una secuencia clonada sin CpG metilación en
SRC
promotor. Además, 4 (2,89%) y 1 (0,72%) de las muestras neoplásicas y no neoplásicas presentan una secuencia clonada sin CpG metilación en
LYN
promotor, respectivamente. Por BSP, el porcentaje de
SRC
[0,135 (0,31)
frente
0,563 (0,23); p & lt; 0,001] y
LYN
[0,238 (0,40)
frente
0,7063 (0,26); p & lt; 0,001] metilación fue menor en las muestras neoplásicas que en las muestras no neoplásicas (Figura 5A y 5B)

A)
SRC
metilación en tumores gástricos y las muestras no tumorales.; B)
LYN
metilación en tumores gástricos y las muestras no tumorales; C)
CKB
metilación en tumores gástricos y las muestras no tumorales; D) La correlación entre el porcentaje de
SRC
metilación en tumores gástricos y muestras no tumorales emparejadas; E) La correlación entre el porcentaje de
LYN
metilación en tumores gástricos y muestras no tumorales emparejadas; F) La correlación entre el porcentaje de
CKB
metilación en tumores gástricos y muestras no tumorales pareadas. * Diferencia significativa entre los grupos mediante la prueba de Mann-Whitney (p & lt; 0,05).

El
SRC
y
LYN
los patrones de metilación del neoplásicas y no mientras que las muestras neoplásicas que se encuentran asociados (p & lt; 0,001, para ambos análisis; χ
2 pruebas). Hemos observado que 70/81 (86,4%) de los tumores con hypomethylated
SRC
presentan metilación parcial de este gen en la muestra no neoplásico emparejado. Además, se encontró que 37/41 (90,24%) de los tumores con hypomethylated
LYN
ha presentó metilación parcial de este gen en la muestra no neoplásico emparejado.
SRC
y
LYN
metilación parcial en muestras no tumorales se observó con mayor frecuencia en individuos que presentan las muestras tumorales con hipometilación de este gen en comparación con los tumores con metilación parcial (p & lt; 0,001, tanto para análisis) o hipermetilación (p & lt; 0,001, para ambos análisis). Además, parcialmente metilada
LYN
en muestras no neoplásicas también se detectó con mayor frecuencia en individuos que presentan las muestras de tumor con la metilación parcial de este gen en comparación con los tumores con hipermetilación (p = 0,004). Por BSP, también se observó que el porcentaje de
SRC gratis (p & lt; 0,001, ρ = 0,6902; Figura 5D) y
LYN gratis (p & lt; 0,001, ρ = 0,739; figura 5E ) metilación de las muestras neoplásicas y no neoplásicas fueron correlacionados.


se observó CKB
hipometilación parcial y en ambas muestras neoplásicas y no neoplásicas. Sin embargo, 48 (39%) de las muestras de GC presentó
CKB
hipermetilación (Fig 4C), que no se detecta en las muestras no neoplásicas. Además, la frecuencia de
CKB
muestras -hypermethylated fue significativamente mayor en comparación con las muestras neoplásicas gástricas no neoplásicas (p & lt; 0,001), y
CKB
metilación parcial también fue significativamente más frecuente en GC que en las muestras no neoplásicas (p & lt; 0,001). Por BSP, el porcentaje de
CKB
metilación fue mayor en las muestras neoplásicas que en las muestras no neoplásicas [0,511 (0,42)
frente
0,133 (0,12); p & lt; 0.001; Fig 5C]. secuencias clonadas sin CpG metilación se detectó en 4 (2,89%) y 0 (0%) de las muestras neoplásicas y no neoplásicas, respectivamente.

El
CKB
patrón de metilación del neoplásicas y no -neoplastic muestras parecen estar asociados (p = 0,014, por χ
2 pruebas). Un análisis de 2x2 utilizando la χ
2 prueba reveló que las parejas en las que las muestras tumorales presentaron hypermethylated
CKB
y las muestras no neoplásicas emparejados presentó hipometilación de este gen fueron más frecuentes que los tumores con pares de hipermetilación y emparejado muestras no neoplásicas con metilación parcial (p = 0,0381), pero este resultado no alcanzó significación estadística, si se aplica el ajuste de Bonferroni (ajustado α = 0,05 /3 = 0,0167). Sin embargo, por el BSP, se observó que el porcentaje de
CKB
metilación de las muestras neoplásicas y no neoplásicas se correlacionaron inversamente (p & lt; 0,001, ρ = -0,375; Figura 5F).

se observó una correlación directa entre el
SRC
y
LYN
patrones de metilación en las muestras no neoplásicas (P & lt; 0,001, ρ = 0,627). Además, se detectó una correlación inversa entre el
SRC
y
CKB gratis (p & lt; 0,001, ρ = -0,467) y
LYN
y
CKB
(p & lt; 0,001, ρ = -0,359) metilación. Sin embargo, en las muestras de GC, se observó una correlación directa entre el porcentaje de metilación de las tres quinasas estudiadas:
SRC
y
LYN
(p & lt; 0,001, ρ = 0,840);
SRC
y
CKB gratis (p & lt; 0,001, ρ = 0,684);
LYN
y
CKB gratis (p & lt; 0,001, ρ = 0,663).

Regulación de metilación de las quinasas

Para dilucidar la regulación epigenética de la estudiada genes, se evaluó la posible asociación entre la metilación del promotor y la inmunorreactividad de la proteína y ARNm y la expresión de la proteína (por Western Blot)

hemos observado que tanto el ARNm y la expresión de la proteína SRC (p. & lt; 0,001, ρ = -0.834; p & lt; 0,001, ρ = -0,718; respectivamente; Fig 6A y 6B) y LYN (p & lt; 0,001, ρ = -0.792; p & lt; 0,001, ρ = -0,654; respectivamente; Fig 6D y 6E) se correlacionó inversamente con el porcentaje de metilación del promotor. Por otra parte, los tumores con SRC [0,062 (0,08)
frente
0,375 (0,33); p & lt; 0.001; prueba de Mann-Whitney; 0.001; Yang et al. Li et al.

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