Extracto
Las hormonas, incluyendo el estrógeno y la progesterona, y sus receptores desempeñan un papel importante en el desarrollo y progresión del carcinoma de ovario . Andrógenos, su receptor y coactivadores también han sido implicados en estos procesos. p44 /Mep50 /WDR77 fue identificado como una subunidad del complejo methylosome y últimamente caracterizado como un coactivador del receptor de esteroides que mejora receptor de andrógenos, así como la actividad transcripcional mediada por el receptor de estrógenos de manera dependiente de ligando. Hemos descrito previamente la expresión y función de p44 en el cáncer de próstata, testículo, mama y distinta. En este informe, hemos examinado la expresión y función de p44 en el cáncer de ovario. En contraste con los resultados en cáncer de próstata y testicular y similar a cáncer de mama, p44 muestra una fuerte localización citoplasmática en la superficie del ovario morfológicamente normal y epitelio trompa de Falopio, mientras que p44 nuclear se observa en el carcinoma de ovario invasivo. Hemos observado que la p44 puede servir como un coactivador de ambos receptor de andrógenos (AR) y receptor de estrógeno (ER) en las células de ovario. Además, la sobreexpresión de p44-nuclear localizada estimula la proliferación y la invasión en las células de cáncer de ovario en la presencia de estrógeno o andrógeno. Estos resultados sugieren fuertemente que p44 juega un papel en la mediación de los efectos de las hormonas durante la tumorigénesis de ovario
Visto:. Ligr M, Patwa RR, Daniels G, Pan L, Wu X, Y Li, et al. (2011) Expresión y función de receptor de andrógenos Coactivador p44 /Mep50 /WDR77 del cáncer de ovario. PLoS ONE 6 (10): e26250. doi: 10.1371 /journal.pone.0026250
Editor: Ilya Ulasov, Universidad de Chicago, Estados Unidos de América
Recibido: Marzo 7, 2011; Aceptado: September 23, 2011; Publicado: 13 Octubre, 2011
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Financiación:. Este trabajo fue financiado por la subvención de Northwestern Memorial Hospital Dixon Fondo de Investigación traslacional a JJW. La fuente de financiación no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de ovario es la quinta causa principal de muerte por cáncer en las mujeres, y la segunda neoplasia ginecológica más mortal en los Estados Unidos [1]. Epiteliales cáncer de ovario representa aproximadamente el 3% del total de casos de cáncer en las mujeres. Instituto Nacional del Cáncer estima que en 2010, 21.880 mujeres serían diagnosticados y 13.850 mujeres morirían de cáncer de ovario [2].
El cáncer de ovario es un grupo de enfermedades heterogéneas y se compone de diferentes tipos histológicos, que puede ser diferenciados fácilmente por evaluación histológica [3]. guías clínicas actuales establecidos por la Organización Mundial de la Salud distinguen ocho subtipos histológicos de tumores: carcinoma papilar seroso (PSC), el carcinoma endometrioide (CEM), el carcinoma mucinoso (MUC), carcinoma de células claras (CCC), el carcinoma de células transicionales (TCC), de células escamosas , epitelial mixto, y no diferenciada, con carcinoma seroso presentan el fenotipo más maligno [4], [5]. análisis génica global de todo el genoma define además distintos perfiles de expresión de los diferentes tipos de cáncer [6] de ovario. Los diferentes tipos histológicos de cáncer de ovario parece ser regulada por diferentes vías de patógenos [7]. La mayor parte de EMC y PSC presente moderados a altos niveles de ER [8], [9], [10] y la expresión AR [11], [12].
receptores de hormonas esteroides, como ER, receptor de progesterona ( PR), y AR, están involucrados en el desarrollo de cánceres de órganos endocrinos, incluyendo el cáncer de ovario [12], [13], [14]. Los estrógenos son conocidos por ser los reguladores de crecimiento y la diferenciación en los ovarios normales, así como en el desarrollo de carcinoma de ovario, pero el mecanismo de esta regulación hormonal sigue siendo ambigua. actos estrógenos a través de dos receptores nucleares, receptores de estrógenos alfa (ER) y receptor beta de estrógenos (ERβ) que se unen a un elemento de respuesta de estrógeno (ERE) en la región promotora de los genes diana, la regulación de su actividad transcripcional [15]. Del mismo modo, AR es también un factor de transcripción activado por ligandos. La unión de los andrógenos a los resultados de AR en la localización nuclear del complejo hormona-receptor junto con coactivadores y maquinaria transcripcional basal. Una vez en el núcleo, entonces se une a un elemento de respuesta a andrógenos (ARE), la regulación de la expresión de genes diana [16].
AR es un receptor de esteroides sexuales frecuentes expresado en cánceres de ovario. Ochenta y cuatro por ciento de los tumores expresan AR, frente a sólo 74% de los tumores que expresan ER y 41% que expresa PR [17]. Existe un mayor riesgo de cáncer de ovario en la post menopausia, en la que los andrógenos de tiempo son los esteroides primaria secretada por el ovario [18]. Alta expresión de PR se asocia con buen pronóstico en el análisis multivariante para el cáncer de ovario [19]. Sin embargo, los resultados son controvertidos para la correlación de estos tres receptores con el pronóstico y la tasa de supervivencia de los pacientes [12], [20].
p44 es una proteína kDa AR-44 que interactúan, que se ha demostrado que aumenta la actividad transcripcional de AR. Contiene 342 residuos de aminoácidos y cuatro repeticiones WD40 putativo [21]. Además, existe p44 en un complejo methylsome con arginina metil transferasa 5 (PMRT5), y también es una subunidad de la supervivencia de las neuronas motoras (SMN) complejo [22]. Debido a la fosforilación de su subunidad, el complejo SMN es activa en el citoplasma, donde promueve montaje U snRNP [23]. La expresión y función de la proteína p44 han sido reportados en los cánceres de próstata, testiculares, y de mama. Curiosamente, se observó distintos patrones de expresión y función de estos órganos reproductivos [21], [24], [25]. Encontramos distinta localización intracelular de p44 en benigna (como proteína nuclear) y malignas (como citoplásmica proteína) tejido de la próstata. La expresión nuclear de p44 inhibe el crecimiento del cáncer de próstata bajo la influencia de andrógenos [21]. Por el contrario, p44 se expresó como una proteína citoplásmica en el epitelio de mama benigna y como una proteína nuclear en el cáncer de mama. p44 Nuclear promovió el crecimiento de células de cáncer de mama en la presencia de estrógeno [21], [24]. Nuestros hallazgos indican que las funciones de p44 como un cofactor que influye en la tumorigénesis de órganos específicos en el sexo tumores regulados por hormonas esteroides.
En este estudio, hemos examinado la expresión de p44 en células de ovario humano benignos y malignos. Se encontró que p44 se expresa de forma diferente en diferentes tipos de cánceres de ovario. En endometrioide y el cáncer de ovario seroso, p44 se expresó como una proteína nuclear. Sin embargo, p44 se expresó como una proteína citoplasmática en ovárico benigno (OSE), trompas de Falopio (FT), y endometrial epitelios (EM). Nuestros datos también indicaron que AR y ER juegan un papel en la regulación de la translocación nuclear-citoplasmática de p44 en el cáncer de ovario y, posteriormente, el crecimiento de células de cáncer y la invasión.
Resultados
Expresión y localización celular de AR p44 coactivador en cáncer de ovario humano: la regulación potencial de la localización de andrógenos y estrógenos
Para determinar si p44 está asociado con cánceres de ovario, se analizó la expresión de p44 en células de ovario benignos, endometrio y las trompas de Falopio y tejidos diferentes de histotypes carcinomas de ovario mediante técnicas de inmunohistoquímica. Para determinar la localización celular de p44, la expresión de p44 en el citoplasma y los núcleos fueron semi-cuantitativamente obtuvo por separado (ver Materiales y Métodos).
p44 era inmunorreactivo tanto en el citoplasma y núcleos. En los tejidos normales, incluyendo FT, EM, y OSE, hubo un mayor nivel de inmunorreactiva p44 en el citoplasma que en núcleos (citoplásmicos relación nuclear fue de aproximadamente 02:01, la Figura 1B). En todos los 5 tipos de carcinomas de ovario, incluyendo MUC, CCC, EMC, borderline serosa (SBT) y PSC, hubo un aumento de la inmunorreactividad nuclear para p44 en comparación con el citoplasma (Figura 1A, Tabla 1), aunque los niveles de p44 nuclear variada entre diferentes tipos histológicos de cáncer de ovario. SBT tenía la más alta inmunorreactividad para p44 en los núcleos y MUC tenía la más baja (Figura 1B, S1). El análisis ANOVA múltiple reveló que no hubo diferencias significativas de la inmunorreactividad de p44 en el núcleo entre benigna (FT: 0,89 ± 0,17; EM: 0,55 ± 0,15; OSE: 0,54 ± 0,14) y malignos (CCC: 1,64 ± 0,13; EMC: 1,71 ± 0,16; PSC: 2,06 ± 0,14, y SBT: 2,67 ± 0,17) epitelios (p & lt; 0,01). prueba t pareada reveló que no hubo diferencia significativa de la inmunoreactividad p44 en los núcleos de pares entre FT y PSC, OSE y PSC, EM y EMC, respectivamente (p & lt; 0,05). PSC, EMC, y CCC carcinomas mostraron immunointensity similar de p44 en el núcleo mediante el análisis ANOVA (p & gt; 0,05, Figura 1B, S1). En contraste, no hubo diferencia mínima de inmunorreactividad citoplásmica para p44 entre cada uno de los epitelios benignos y malignos (p & gt; 0,05, Figura 1B). En general, EMC, PSC, y SBT tenían expresión ER relativamente abundante y estos tumores mostraron niveles relativamente más altos de inmunorreactividad p44 en los núcleos (Figura 1A, 1B, Figura S1). Los resultados de diferencia en la localización celular de p44 entre los tejidos normales y el cáncer de ovario pueden sugerir un papel de p44 como un mediador de los receptores de estrógenos en la tumorigénesis del cáncer de ovario.
A. Ejemplos de expresión p44 por inmunohistoquímica en 4 diferentes tipos histológicos de cáncer de ovario y tubo normal de Falopio y el endometrio (200 aumentos). B. análisis semicuantitativo de immunointensity p44 y su localización celular en cuatro tipos histológicos diferentes de cáncer de ovario y de la trompa de Falopio normal y endometrio. barras de color gris oscuro son p44 nuclear y se encienden las barras grises son p44 citoplasmática. Pequeños camisetas barras representan el error estándar. El análisis de transferencia Western de C. AR, ER y expresión ERβ en diferentes líneas celulares, incluyendo T29, SKOV-3, OVCAR-3. β-actina se utilizó como control de carga. La dilución del anticuerpo primario utilizado para p44 fue 1:5000, por AR 1:1000, por ER y ERβ 1:2000 y para β-actina 1:5000.
Para evaluar la relación de p44 con AR y ER en el cáncer de ovario, se analizó primero los niveles de expresión de estos receptores en las líneas celulares de ovario seleccionados. Western blot reveló que la expresión de p44 fue mayor en líneas celulares de cáncer de ovario OVCAR-3 y Skov-3 de la línea celular epitelial benigno superficial del ovario (OSE) T29. Los niveles de expresión de p44 correlacionó positivamente con ER /β y la expresión de AR (Figura 1C). En particular, se encontró que la expresión de ER fue mayor en Skov-3 y por el contrario, ERβ isoforma mostró los niveles más altos en OVCAR-3 cells.To determinar p44 localización y regulación celular por los estrógenos y andrógenos en las células benignas y malignas de OSE, se analizó la localización de p44 en tres condiciones diferentes medios de comunicación: medio libre de hormonas y medio con niveles definidos de cualquiera de andrógenos o estrógenos por microscopía de inmunofluorescencia. Como se muestra en la Figura 2, las células T29 benignos tenían niveles más altos de p44 citoplásmica y, en cierta medida, p44 nuclear en las tres condiciones de medios. En SKOV-3, p44 se localizó predominantemente en el núcleo en libre de hormonas, andrógenos (10 nM andrógeno sintético R1881) y estrógeno (10 nM 17β-estradiol) medios de comunicación (Figura 2). En las células OVCAR-3, p44 se localizó tanto en el núcleo y el citoplasma en medios libres de hormonas, y situado al núcleo en presencia de cualquiera de andrógenos o estrógenos (Figura 2).
p44 anticuerpo primario y rodamina se utilizó conjugado policlonal de conejo anticuerpo secundario. DAPI se utilizó para teñir los núcleos. (Ampliación: 400x) guía empresas
funciones AR coactivador p44 como coactivador tanto AR y ER en las células de ovario
p44 es un coactivador de AR y ER y tiene clara expresión en células de próstata y de mama líneas [21], [24]. Para determinar si las funciones de p44 como un activador de la transcripción en líneas celulares de cáncer de ovario, se realizó un ensayo in vivo de la transcripción en el uso del sistema indicador de luciferasa dual. Estamos transfectadas transitoriamente células T29 con vector que expresa p44 y, o bien un par de vectores que expresan AR y un informador de luciferasa bajo el control de cuatro elementos de andrógenos de respuesta (Figura 3A), o ER, y un informador de luciferasa bajo el control de elementos de respuesta a estrógenos (Figura 3B). En la presencia de andrógenos, p44 activa de andrógenos transcripción receptor impulsado de una manera dependiente de la dosis, lo que lleva a tanto como 2,6 veces aumento de la actividad del indicador en comparación con el control. Del mismo modo, en presencia de estrógeno, p44 transcripción dependiente del receptor de estrógeno activado de una manera dependiente de la dosis: la señal del informador se incrementó tanto como 4,5 veces en comparación con el control. Cuando p44 se expresó sola, en ausencia de cualquiera de AR o ER, no se observó efecto sobre la actividad del indicador, tanto en presencia como en ausencia de hormonas en los medios de comunicación (datos no presentados), lo que confirma la activación de p44 a través de los receptores de hormonas. Estos hallazgos indican que p44 de hecho funciona como un coactivador de ambos receptores de andrógenos y estrógenos en células de ovario.
A. Los vectores que contienen p44 y AR se transfectaron en células T29 junto con un vector indicador que contiene gen de la luciferasa bajo el promotor de control que contiene 4 elementos de respuesta a andrógenos. B. Los vectores que contienen p44 y ER se transfectaron en células T29 junto con el vector reportero ER-luc. reportero de la actividad se expresó como unidades relativas.
p44 AR coactivador promueve el crecimiento de células de cáncer de ovario y la invasión
Para diseccionar el efecto de p44 en la proliferación de células de cáncer de ovario, lo primero que transfectaron vectores retrovirales expresando NLS-p44 en células SKOV-3. NLS-p44 se construye con señal de localización nuclear (NLS) fusionado en marco a N-terminal de p44. SKOV-3 células son incapaces de responder a los estrógenos activación [26], [27]. Después de confirmar que la p44 transfectadas se expresó, se procedió a analizar el estado de proliferación de las células (Figura 4A). En ambos medios libres de hormonas y estrógenos suplementado, la sobreexpresión de NLS-p44 no tuvo ningún efecto sobre el crecimiento de células SKOV-3 (p & gt; 0,05). Sin embargo, en la presencia de andrógenos, la sobreexpresión de NLS-p44 llevó a reducción de aproximadamente el 33% en el crecimiento celular (p & lt; 0,01). La disminución de los niveles de p44 mediante el tratamiento de las células Skov-3 con el correspondiente ARNsi dirigidos a resultados similares. Si bien en medios que contienen andrógenos de la caída de p44 llevó a ~ 25% de disminución de la tasa de crecimiento (p & lt; 0,05), y la reducción de ~ 15% del crecimiento de las células en medios libres de hormonas (p & lt; 0,05), no había estadísticamente significativa efecto del tratamiento con siRNA en el crecimiento de células en medio que contiene estrógeno (Figura 4C). Puesto que el receptor de estrógeno en células SKOV-3 no responde a los estrógenos, los resultados validados nuestros métodos del estudio
A, B:. SKOV 3-células (A) y OVCAR-3 células (B) fueron transfectadas ya sea con pBabe-NLSp44 vector sobreexpresión o un vector de control, y se cultivaron tanto en medio libre de hormonas o en presencia de andrógenos o estrógenos. La sobreexpresión de p44 se verificó mediante western blot (muestras tomadas cada dos días) y las células se contaron todos los días. C, D: células SKOV-3 (C) y células OVCAR-3 (D) fueron tratados con siRNA p44 usando Hiperfect y cultivadas ya sea en medio libre de hormonas o en presencia de andrógenos o estrógenos. El siRNA tratamiento se repitió cada dos días. La sobreexpresión de p44 y la caída se verificó mediante western blot (muestras tomadas cada dos días) y las células se contaron todos los días.
A diferencia de la línea celular Skov-3, las células OVCAR-3 es sensible a la estimulación de estrógeno [28]. De hecho, cuando se cultivaron las células OVCAR-3 en medio suplementado con estrógeno o andrógeno (Figura 4B y D, triángulos abiertos y cuadrados), ambos mostraron aumento de la proliferación en comparación con las células cultivadas en medios libres de hormonas (55% y 40%, respectivamente ). Contrariamente a la situación en células SKOV-3, se observó un fuerte efecto positivo de la sobreexpresión de p44 nuclear en el crecimiento de células OVCAR-3 en medio suplementado marchitan ya sea de andrógenos o estrógenos. En la presencia de andrógenos, la sobreexpresión de NLS-p44 dio como resultado aumento de 1,5 veces en la tasa de crecimiento, y en presencia de estrógeno de la inducción del crecimiento observado fue de 1,6 veces. No hubo influencia significativa del crecimiento celular mediante la sobreexpresión de p44 en medios libres de hormonas (Figura 4B).
También observó una fuerte, pero negativo, efecto de agotamiento de p44 en células OVCAR-3 utilizando siRNA confirmó en el nivel de proteínas por Western blot. Mientras que la sobreexpresión de p44 no tuvo una influencia significativa en el crecimiento en medio libre de hormonas, knock-down de los niveles de proteína p44 dio lugar a una reducción del 25% de la tasa de crecimiento en el medio libre de hormonas. En los medios de hormonas complementado la reducción del crecimiento asociado con el agotamiento de p44 parecía aún más fuerte. En los medios de estrógenos, el agotamiento p44 causó reducción de 40% de la tasa de crecimiento de células tumorales, mientras que en la presencia de andrógenos esta diferencia representó el 33% (Figura 4D).
Hemos probado aún más los efectos p44 sobre la capacidad invasión de células utilizando un
in vitro
ensayo de invasión en Matrigel. Se observó el aumento de invasión de las células en medios suplementados con andrógenos en comparación con medio libre de hormonas. El tratamiento de células con estrógeno no cambió el número de células que cruzan la membrana (Figura 5A). Cuando overexpressed NLS-p44 en células SKOV-3, no hubo ningún cambio en la capacidad de las células para invadir a través de la membrana de Matrigel, ya sea en medio libre de hormonas o medio suplementado con andrógenos o estrógenos. Para bloquear la expresión endógena de p44, p44 siRNA introdujimos en Skov-3 células. En hormonas medios que carecen de, el agotamiento de p44 no afectó la invasión de células tumorales a través de Matrigel, ya que no afectó la invasión tumoral en los medios que contienen estrógeno. En medio suplementado con andrógenos, la falta de expresión de p44 se redujo significativamente la invasión de células hasta 3 veces (Figura 5C)
A, B:. SKOV 3-células (A) y células OVCAR-3 (B) se transfectadas ya sea con pBabe-NLSp44 vector de sobreexpresión o un vector de control; C, D: células SKOV-3 (C) y células OVCAR-3 (D) fueron tratados con siRNA p44 usando Hiperfect y cultivadas ya sea en el medio libre de hormonas o en presencia de andrógenos o estrógenos. La sobreexpresión y desmontables de p44 fue verificado por transferencia de western (véase la Figura 4). Las células se sembraron sobre Matrigel membranas en medios libres de hormonas. Andrógenos o estrógenos se utilizan como chemoatractants en la cámara inferior.
También probó el efecto de p44 en la invasión de células OVCAR-3. Similar a SKOV-3 células, aumento o disminución de la expresión de p44 no afectó a la invasión de células en medios libres de hormonas (Figura 5B, D). En andrógenos o estrógenos medios suplementados, más de dos veces de incremento de la invasión de Matrigel se observó (Figura 5B). Consistentemente, desmontables de p44 en células OVCAR-3 resultó en una reducción drástica de la capacidad de invasión en los medios suplementados con la hormona.
Discusión
Las hormonas esteroides son factores importantes en el desarrollo y progresión de cáncer de ovario cáncer. Los receptores de hormonas y sus cofactores son esenciales para la acción hormonal. La mayoría de los carcinomas de ovario, incluyendo tipo seroso y endometrioide, muestran variados niveles de ER, PR y AR expresión [12], [27]. La expresión de los receptores de hormonas esteroides sexuales y sus cofactores en el cáncer de ovario proporcionar los objetivos para los tratamientos anti-hormonales. Por lo tanto, es fundamental para caracterizar el papel de las hormonas sexuales y sus tumorigénesis mediada cofactor en el cáncer de ovario. Se ha informado de que la AR es un marcador importante en el cáncer de ovario [29], sin embargo, los mecanismos moleculares para la AR asociados comportamiento agresivo cáncer de ovario [30], [31], [32] son aún poco conocidos.
en nuestros estudios anteriores, se encontró que p44 AR coactivator juega un papel importante tanto en los cánceres de próstata y de mama, lo que indica la implicación de la vía de AR en la tumorigénesis de estos órganos endocrinos. En este estudio, hemos aplicado principios similares a determinar la contribución de p44 a las funciones oncogénicas en la tumorigénesis del cáncer ovárico, en relación a los andrógenos o estrógenos. Se encontró que p44 citoplásmica es altamente expresado en ovárico benigno, endometrial, y las células epiteliales de la superficie del tubo de Falopio. Sin embargo, en diferentes tipos de tumores, p44 tiene patrones de expresión diferenciales celulares, reflejadas por los distintos niveles de localizaciones citoplasmáticos y nucleares. p44 se sobreexpresa significativamente en el carcinoma seroso de alto grado, carcinomas endometrioide, el carcinoma de células claras y tumores borderline seroso (Figura 1A). En particular, la expresión de p44 nuclear es significativamente mayor en tejidos de cáncer de ovario que en sus contrapartes benignos emparejados, apoyando el papel funcional de p44 nuclear en la tumorigénesis del cáncer de ovario. Del mismo modo, el análisis de transferencia Western reveló niveles comparables de p44 entre OVCAR-3 y SKOV-3 (Figura 1C) cuando las células fueron cultivadas en medio completo (con rojo fenol y no carbón suero depurado), sin embargo, en medio de andrógenos completada, la tinción de inmunofluorescencia reveló que p44 se expresa a más alto nivel en el núcleo (Figura 2). Será de gran interés para determinar en futuros estudios si los niveles de ER, AR y la expresión de p44 se asocian con tipos histológicos específicos de cáncer de ovario, el grado del tumor, etapas, y la supervivencia.
Para definir aún más la funcionalidad funciones de p44, se investigó p44 en líneas celulares de OSE benignas y malignas en presencia y en ausencia de andrógenos o estrógenos. Se utilizó la línea celular epitelial de la superficie del ovario benigno inmortalizada T29 y dos líneas celulares de cáncer de ovario malignos Skov-3 y OVCAR-3 en este estudio. Se informó de que SKOV3 no responde a los estrógenos, mientras que OVCAR-3 células son sensibles a la estimulación de estrógenos. De acuerdo, se encontró que los estrógenos no afectó localización p44, la proliferación celular, o la invasión en células SKOV-3, mientras que el estrógeno mejora p44 de localización nuclear, la proliferación celular y la invasión en células OVCAR-3. Mientras tanto ER y ERβ se expresan en SKOV 3-células (Figura 1C), SKOV-3 falta de respuesta a los estrógenos puede ser debido a la mutación en ER [27], lo que indica la función de p44 puede estar mediada por ER, en lugar de ERβ.
p44 mejora de forma significativa la proliferación maligna de células OSE y la invasión en presencia de andrógenos o estrógenos, lo que indica que se requiere la expresión de AR o ER para p44 para estimular la mitogénesis y la invasión (Figura 1C). p44 mediada por función tumorigénico parece ser diferente entre la próstata y el cáncer de ovario. En el cáncer de próstata, p44 nuclear inhibe la proliferación celular de una manera dependiente de andrógenos. En la línea celular de cáncer de ovario OVCAR-3, p44 nuclear promueve el crecimiento celular. En particular, se observa que p44 nuclear promueve la invasión tanto de andrógenos y estrógenos medios de comunicación. Los resultados de cáncer de ovario son similares a lo que hemos observado en el pecho. En el cáncer de mama, p44 nuclear promueve la proliferación de células tumorales de una manera dependiente de estrógenos [24]. Aunque nuestros desmontables experimentos siRNA mediada demostraron que nuestros anticuerpos p44 reconoce específicamente una sola especie de proteína en la próstata, de mama y de ovario, no podemos excluir completamente la posibilidad de que muy relacionadas, pero funcionalmente proteínas distintas (por ejemplo, variantes de corte y empalme de p44) actúan como distintos cofactores receptor de la hormona en cada uno de estos tejidos. Con esta advertencia, nuestros hallazgos sugieren que p44 también puede actuar a través de una vía funcional mediada por ER en el tejido ovárico. P44 nuclear
En resumen, nuestros datos indican está implicado en la proliferación de cáncer de ovario y la invasión. Estos procesos están regulados por andrógenos y estrógenos. p44 puede ser un objetivo potencial para el tratamiento de cáncer de ovario.
Materiales y Métodos
La selección de casos, TMA y IHC
Los casos se recogieron después de la cirugía en el Hospital Northwestern Memorial y se obtuvieron la Universidad de Nueva York, de 1996 a 2009. La aprobación de la Junta de Investigación Institucional (IRB) de ambas instituciones (exento). Se recogieron un total de 105 casos de cáncer de ovario para este estudio (Tabla 1). Todos los casos PSC y EMC fueron recuperados de la Universidad de Nueva York banco de tejidos y todos los otros tipos de cáncer de ovario, así como los tejidos normales de control, fueron recuperados del banco de tejidos NWU. Esto incluye el diagnóstico histológico de carcinoma seroso papilar de alto grado (PSC, N = 32), tumor borderline serosa (SBT, N = 9), carcinoma de ovario endometrioide (EMC, N = 34), carcinoma de ovario mucinoso (MUC, N = 15 ) y el carcinoma de células claras de ovario (CIC, N = 15). tejidos normales de control utilizados en este estudio fueron: 30 tubos normales de Falopio (FT, los controles normales más cercanos para el carcinoma seroso de alto grado), 20 endometria normales (EM, los controles normales más cercanos para el carcinoma endometrioide), y 28 ovarios normales (OSE, de ovario epitelio de la superficie, como el tejido de control general).
Todos los carcinomas de ovario eran primarios. microarray de tejido (TMA) la preparación se ha descrito en nuestro estudio anterior [33]. En breve, 0,6 y 1 mm núcleos de tejido fueron recogidos de cada caso de cortes de tumores bien conservados y de alta densidad TMA se prepararon en dos bloques de recepción.
La producción, purificación por afinidad y especificidad de la p44 policlonal de conejo anticuerpo utilizado se han descrito anteriormente [34]. El suero preinmune se usó como control. La especificidad del anticuerpo p44 se confirmó mediante un ensayo de siRNA que mostró expresión p44 reducida con ARN de interferencia p44 [21]. Los niveles relativos de expresión de p44 se anotó semi-cuantitativamente mediante combinación de immunointensity [0 (negativo), 1+ (débil), 2+ (débil), 3+ (moderado), y 4+ (fuerte) la expresión] y immunopercentage ( 1 como 0-10%, 10-50% como 2, 3 como 50 a 75% y 4 como 75 a 100%)]. Los análisis estadísticos se realizaron mediante la prueba t.
Cultivo de células y ensayo de proliferación celular
Las líneas celulares Skov-3 [35] y OVCAR-3 [28] se obtuvieron de la American Type Culture Americana Colección. La línea de ovario benigno inmortalizada de células epiteliales T29 superficie [36], como se describe anteriormente en detalle, se mantuvo en medio 199 y MCDB105 (Sigma). Las dos líneas celulares de cáncer de ovario Skov-3 y OVCAR-3 se cultivaron en medio 5A de McCoy (Invitrogen) y RPMI 1640 (Gibco), respectivamente, suplementado con 10% de FBS y 1 U /ml de penicilina y 1 mg /ml de estreptomicina. Para medir la tasa de proliferación, 2 × 10
4 células fueron sembradas en placas de 6 pocillos. En los puntos de tiempo apropiados, las células se trataron con 0,25% de tripsina y 0,38 mg /ml EDTA (Gibco) y se contaron usando un hemocitómetro (Reichert).
Western El análisis de transferencia
Western blot se utilizado para comprobar p44, expresión de AR, ER, y ERβ en medio completo, desmontables de p44, y la sobreexpresión de p44 plásmidos (vector pBabe y pBabeNLSp44) en líneas celulares de ovario. Las células se cultivaron bien en placas de 10 cm, 6 bien o placas de 24 pocillos. se añadió tampón de lisis que contenía cóctel inhibidor de proteasa (Sigma) en relación 1:100 a los gránulos para la resuspensión. La concentración de proteínas se midió usando el ensayo de proteínas de Bio-Rad y la cantidad apropiada de proteína se cargó para electroforesis en la electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE). A continuación, la proteína se transfirió a membrana de nitrocelulosa para el análisis de transferencia Western. Las membranas se bloquearon durante 1 hora en leche descremada en polvo 5% en solución salina tamponada con Tris y Tween 20 (20 mM Tris-HCl, pH 7,6, NaCl 150 mM, y 0,1% de Tween 20). Las transferencias se incubaron a continuación con anticuerpos producidos contra AR, ER, ERβ (Santa Cruz Biotechnology), p44 y β-actina durante 2 horas a temperatura ambiente, se lavaron con Tween solución salina tamponada con Tris 20 tres veces. Después de los lavados, las transferencias se incubaron durante 2 horas con apropiado peroxidasa de rábano picante conjugada con anticuerpo secundario (GE Healthcare). Las bandas de proteínas se detectaron mediante el uso de kit de quimioluminiscencia (GE Healthcare).
microscopía de inmunofluorescencia
T29, Skov-3, y OVCAR-3 células fueron cultivadas a dos densities- 3 × 10
4 y 1 × 10
4 por pocillo durante tres condiciones diferentes medios de comunicación (sin hormonas, andrógenos, estrógenos y) en portaobjetos con cámaras. Las células se enjuagaron primero tres veces en PBS, y se fijaron durante 20 min con paraformaldehído al 4% en PBS a temperatura ambiente. Después de la fijación, las células se permeablized con metanol y acetona (01:01) y se incubaron a -20 ° C durante 20 minutos. Las células se lavaron 3 veces en PBS y se bloquearon durante 1 hora con una solución de 5% de BSA en TBS-T. Las células fueron incubadas con anticuerpo primario p44 (1:250) durante 2 horas a temperatura ambiente. Después de la incubación con el anticuerpo primario, las células se tiñeron con anticuerpo conjugado con rodamina policlonal de conejo (1:500) (Abcam) durante 1 hora en la oscuridad a temperatura ambiente. Para el contador se aplicó la tinción DAPI (1:1000) y se incubó a temperatura ambiente durante 5 minutos en la oscuridad. La localización intracelular de p44 se examinó el uso de Nikon Digital DXM1200 F microscopio con el programa Nikon-ACT.
Interferencia de ARN de ensayo
Tres siRNAs más eficaces en la reducción del nivel de proteína p44 en las células de ovario se combinaron en cantidades equimolares y se utiliza en los experimentos posteriores, en general, a una concentración de 100 nM (Tabla 2). Revueltos siRNA (Ambion) se utilizó como control.
Las células se cultivaron en placas de 6 pocillos hasta la confluencia deseada en 2 ml de medio apropiado que contiene suero sin antibióticos. 100 nM de ARNsi se diluyó en 423 l Opti-MEM (Gibco) sin suero, seguido de 75 l de reactivo HiPerfect (Qiagen) y se incubaron durante 10 minutos a temperatura ambiente para permitir la formación de complejos de transfección. Las células se incubaron con los complejos de transfección en las condiciones normales durante 48 horas
electroporación
Tres plásmidos -. Vector pBabe, pBabeNLSp44 [21], y GFP (control) - se transfectaron en las células usando electroporación. Las células se cultivaron en tres condiciones - sin hormonas, andrógenos (10 nM), y estrógenos (10 nM). Las células fueron cultivadas a 80% de confluencia. Las células sedimentadas se resuspendieron en 100 l de solución de Nucleofactor (82 l de solución de 18 l de solución de suplemento) (Lonza) para cada reacción. Cuatro ng de plásmido se combina a continuación y la suspensión de células /ADN se transfirió a cubeta de electroporación. Se seleccionó y se aplicó el programa Nucleofactor recomendado para cada línea celular por el fabricante. Después de la electroporación se retiró la cubeta y las células transfiere inmediatamente a 10 ml de medio con FCS correspondiente y se incubó durante 48 horas en condiciones de crecimiento normales.
Luciferase ensayo
En ensayo de transcripción reportero vivo se realizó usando el sistema de ensayo de luciferasa Dual-reportero (Promega) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La salida de luz se midió por Lumat LB9507 luminómetro (Berthold).