Extracto
El desarrollo de vacunas basadas en células dendríticas es un enfoque prometedor en la inmunoterapia del cáncer. Para su utilización con éxito en las clínicas, la propagación y la funcionalidad de los países en desarrollo es crucial. Nos anterior establecido un método de dos etapas para la generación a gran escala de las DC de la sangre del cordón umbilical derivado MNCs /CD34 + células. Este trabajo tiene como objetivo mejorar su funcionalidad en base a las siguientes observaciones:
in vitro
genera DC puede ser menos eficiente en la migración y otras actividades funcionales debido a los bajos niveles de eicosanoides. La producción de eicosanoides a partir de ácido araquidónico (AA) puede verse obstaculizada debido a la supresión de la enzima fosfolipasa A2 por IL-4, una citoquina esencial requerido para la diferenciación de las CD. La hipótesis de que la adición exógena de AA al medio de cultivo durante la generación de DC puede dar lugar a DCs con funcionalidad mejorada. Países en desarrollo se genera con y sin AA. Los dos conjuntos de CC se compararon mediante análisis fenotípico, morfología y ensayos funcionales como la captación de antígenos, MLR, ensayo de CTL y
in vitro
y
in vivo
migración. Aunque no hubo diferencias entre los dos tipos de países en desarrollo en términos de morfología, fenotipo y la captación de antígenos, AA
+ DC mostró un aumento de
in vitro
y
in vivo
la migración, T capacidad de la célula estimuladora, la actividad CTL y significativamente más altos niveles de transcripción de COX-2. AA
+ DC también muestran un perfil favorable de citoquinas Th1 de AA
- DC. Por lo tanto la adición de AA a los medios de cultivo se sesgando los países en desarrollo hacia la secreción de más IL-12 y menos de IL-10 junto con la restauración de los niveles de eicosanoides en una vía mediada por la COX-2 mejorando de este modo la funcionalidad de estas células para ser usado como una vacuna celular potente. Tomados en conjunto, estos resultados serán útiles en el mejor de DC el idear vacunas basadas en la inmunoterapia del cáncer
Visto:. J Kumar, Gurav R, V Kale, Limaye L (2014) exógena adición de ácido araquidónico a la Cultura medios mejora la funcionalidad de las células dendríticas para su posible uso en la inmunoterapia del cáncer. PLoS ONE 9 (11): e111759. doi: 10.1371 /journal.pone.0111759
Editor: Thorbald Van Hall, Universidad de Leiden, Países Bajos
Recibido: 13 Junio, 2014; Aceptado: 30 de septiembre de 2014; Publicado: 4 de noviembre 2014
Derechos de Autor © 2014 Kumar et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. La autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. Los autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. Todos los datos relevantes se encuentran dentro de los archivos de información de apoyo
Financiación:. El proyecto recibió fondos del Departamento de Biotecnología (DBT), Gobierno de la India a través de la subvención no. BT /PR13565 /MED /31/89 /de 2010. JK recibió su beca del Consejo de Investigación Científica e Industrial (CSIR) de la India y DBT (PR-4930/31). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
las células dendríticas (DC) son las células presentadoras de antígenos más eficientes (APC) que reconocen el universo de antígenos y controlan varios tipos de respuestas [1], [2]. Los países en desarrollo son capaces de captar antígenos, procesarlos y presentarlos con moléculas de coestimulación adecuadas e iniciar la respuesta inmune [3], [4]. DCs no son sólo es fundamental para la inducción de ambas respuestas inmunitarias celulares T y B primarias y secundarias, pero también son importantes para la inducción de tolerancia inmunológica. DCs son en el centro del sistema inmune y la modulación de la respuesta inmune es importante en la inmunidad terapéutica contra el cáncer [5]. La capacidad única de las DC en la presentación y regulación de la respuesta inmune antígeno les ha hecho un adyuvante atractivo en la inmunoterapia del cáncer [6]. Los avances en el
in vitro
protocolos de generación de corriente continua y mejor comprensión de la biología DC han dado lugar a su uso como vacunas CC en las clínicas. Desde su primer informe en 1995, un gran número de ensayos clínicos se han llevado a cabo para evaluar las vacunas basadas en DC contra más de una docena de diferentes tipos de tumores [7], [8], [9]. El uso clínico de DCs requiere vacunación repetida para inducir frecuencias relativamente altas de linfocitos antígeno específico de tumor T citotóxicos (CTL) y una respuesta completa. Esto a su vez requiere un gran número de países en desarrollo, generada
ex vivo [10].
DC puede generarse a partir de CD34
+ células utilizando un unos sistemas de cultivo de dos pasos o de un paso . En el primer tipo de sistema de cultivo de CD34
+ células se cultivan con una combinación de factores de crecimiento, donde en que se diferencian directamente como células dendríticas [11], [12], [13]. Por otro lado, en el sistema de dos pasos cultura CD34
+ células se expanden primero a gran escala como precursores de DC. Estas células expandidas se diferencian más que los países en desarrollo [14], [15], [16], [17]. A pesar de la plena comprensión de la compleja regulación DC-mediada de las respuestas de leucocitos de acogida,
in vitro
genera DCS no puede representar el equivalente de DC migratoria
in vivo
, lo que limita su uso como balas mágicas para mejorar la precisión y la eficacia de la inmunoterapia del cáncer. evidencia experimental recientes demuestran que derivados de monocitos humanos DC (MoDC) puede verse obstaculizado en su capacidad para migrar en respuesta a inflamatoria, así como quimiotaxinas homeostáticos [18]. En informes anteriores muestran que la IL-4, que es una citoquina importante para
in vitro
generación DC, inhibe muchas de las vías aguas abajo de ácido araquidónico (AA), el metabolismo que resultan en la producción alterada de eicosanoides y factor de activación de plaquetas ( PAF). La prostaglandina E
2 (PGE
2) es un miembro de la familia de eicosanoides derivados de AA oxigenados. El primer paso de PGE
2 biosíntesis es la liberación de AA de los fosfolípidos de membrana por fosfolipasas, tales como la fosfolipasa A2 (PLA
2). Como se sabe que los eicosanoides y PAF para jugar un papel importante en procesos tales como la migración de leucocitos, activación de las células asesinas naturales, y el tipo de diferenciaciones de células helper 2 T, la deficiencia en la biosíntesis de estos factores pueden ser responsables de las desventajas observadas de moDCs [19] .
anteriormente establecido un método adherencia de plástico de dos etapas para la generación a gran escala de las DC derivadas de ambos umbilical CD34 + de sangre de cordón células [17] y MNCs (células mononucleares) [20]. Las CD generadas por nuestro método tienen un fenotipo maduro y son funcionalmente activa. Sin embargo una de las citoquinas utilizadas para generar los DC por nuestro método es IL-4 y como se mencionó anteriormente IL-4 puede afectar a la liberación de ácido araquidónico de la membrane.We la hipótesis de que la adición exógena de AA a nuestros cultivos durante la etapa de diferenciación puede ayudar en la mejorando aún más las funciones de los países en desarrollo. La razón para la adición de AA exógeno era que puede quedar convertido en prostaglandinas de manera ciclooxigenasas-1 (COX-1) y ciclooxigenasas-2 (COX-2) dependiente. Para comprobar esta hipótesis, en el presente estudio se evaluó el efecto de la adición de AA en
in vitro
generación de DC. Nuestros datos demuestran que, efectivamente, AA
+ DC son superiores en funciones tales como una mejor
in vitro e
in vivo
la migración, la capacidad estimulante de células T, la captación de antígenos, la actividad CTL, significativamente mayor los niveles de transcripción de la COX-2 y una citoquina Th1 favorable que AA
- DCS. Así, nuestros hallazgos nos llevan un paso más hacia la generación de la forma ameliorate de la vacuna contra el cáncer basada DC.
Materiales y Métodos
Las citoquinas
Las citoquinas humanas recombinantes utilizadas para el estudio eran Fms como tirosina quinasa 3 ligando (Flt-3L), trombopoyetina (TPO), factor de células madre (SCF), la interleucina-4 (IL-4), de granulocitos monocitos -colony factor estimulante (GM-CSF), factor de necrosis tumoral-α (TNF-α), el ligando CD40 y ligando de quimioquinas-19 (CCL-19). Todas las citoquinas humanas recombinantes se adquirieron de Peprotech Asia, Israel Revohot
Los anticuerpos
Los anticuerpos utilizados para la citometría de flujo fueron anti-ratón anticuerpos monoclonales humanos:. CD1a, CD34, CD11c, CD40, CD8 -APC etiquetado ; CD14, CD20, CD33, CD58, CD80, CD83, CD86, HLA-A2, CD45RA -PE etiquetada; CD3, CD54, HLA-DR, HLA-ABC FITC etiquetados, anti CD de murino 45,1 -PB etiquetado y CCR-7 (mAb purificado rata antihumano). Todos los anticuerpos monoclonales y los respectivos controles de isotipo utilizados para el estudio se compraron de BD Pharmingen (San Diego, CA).
Otros reactivos utilizados
araquidónico Acid- (Cat. No. A3555 es) de Sigma Aldrich, un producto probado cultivo de tejidos derivados de hígado porcino. La pureza del producto era ≥99% tal como se analizó por cromatografía de gases capilar
Ficoll Hypaque-Histopaque (densidad 1,007 g /ml).; isotiocianato de fluoresceína (FITC) marcado con dextrano (40 kDa); Tinción de Wright, Giemsa, lipopolisacárido, DMEM (de Eagle modificado por Dulbecco) y IMDM (Iscove modificado de Dulbecco Medium) todos eran de Sigma Aldrich; kit ELISA (BD OptEIA); Heparina de la SRL Pvt. Limitado, Mumbai; Hidroxietil almidón (HES), Rosette SEP aislamiento de células T (Cell Technologies, Vancouver, Canadá tallo); [
3H] timidina (240 GBq /mol mili, Brit, Navi Mumbai, India); Dimetilsulfóxido (MP biomédica, Ohio, EE.UU.); kit Dynal para el aislamiento del ARNm (Dynal ASA, Oslo, Noruega).
Recolección y procesamiento de las muestras de sangre de cordón
La sangre del cordón muestras (CB) se obtuvieron de los hospitales locales de acuerdo con el comité de revisión institucional [Comité de Ética Institucional (CEI) y el Comité Institucional para la Investigación con células Madre (IC-SCRT)]: aprobado directrices éticas que están en conformidad con la Declaración de Helsinki. Se obtuvo un consentimiento informado por escrito antes de la madre. El procedimiento de consentimiento fue aprobado por IC-SCRT. Las copias impresas de los formularios de consentimiento firmados están numerados y clasificados con nosotros. Las muestras se recogieron en recipientes estériles que contienen heparina libre de conservantes (40 UI de heparina /ml de sangre) en IMDM sin formato. Las muestras se llevaron al laboratorio en bolsas de hielo y se procesaron para aislar las células mononucleares (MNC).
Aislamiento de MNC
Cable de la MNC de sangre fueron separados por centrifugación en gradiente de Ficoll-Hypaque. Se recogieron las células en la interfase y se lavaron para eliminar el Ficoll-Hypaque. recuento de células nucleadas (tinción con violeta cristal) fue tomado y las multinacionales se utiliza para la generación de corriente continua.
El aislamiento de células T de sangre periférica
La sangre periférica se recogió de donantes sanos de acuerdo con la revisión institucional tablero. [Comité de Ética Institucional (CEI) y el Comité Institucional para la Investigación con Células Madre (IC-SCRT)]: aprobado directrices éticas que están en conformidad con la Declaración de Helsinki. Se obtuvo un previo consentimiento por escrito del donante sano. El procedimiento de consentimiento fue aprobado por IC-SCRT. Las copias impresas de los formularios de consentimiento firmados están numerados y clasificados con nosotros. Se aislaron las células T de la sangre mediante el uso de kit de selección negativa (Rosette septiembre) según las instrucciones del fabricante (Stem Cell Technologies). Después las células centrifugación en gradiente de Ficoll-Hypaque en la interfase de Ficoll y medio se recogieron, luego se lava usado en los experimentos.
in vitro
Generación y Cultura de los países en desarrollo
Expansión culturas y la adhesión de plástico.
MNC (frescos o congelados) se expandieron durante 3 semanas, a continuación, enriquecidas para células CD14 + por la adhesión de plástico y posteriormente se diferencian como se describe anteriormente [17], [20]. En pocas palabras, después de 21 días de expansión se lavaron las células y se sembraron a la densidad de 3 × 10
5 células /pocillo en placa de seis pocillos que contenía 2 ml de IMDM suplementado con plasma autólogo 1%. Las células se mantuvieron durante 1,5 horas a 37 ° C en 5% de CO
2 incubadora y la no adherentes y las células débilmente adherentes se retiraron por lavado con IMDM. Se utilizaron las células adherentes para la generación de DC
La diferenciación de las CD a partir de precursores en presencia de AA (AA
+ DC) y ausencia de AA (AA
- DC)..
Las poblaciones de células precursoras se dividieron en dos conjuntos. Las células fueron inducidas a diferenciarse como DCs cultivándolas en GM-CSF (50 ng /ml) e IL-4 (30 ng /ml) durante 3 días, en días 3
rd GM-CSF (50 ng /ml) más TNF-α (30 ng /ml) se añadieron a los cultivos y se mantuvo adicionalmente durante 4 días en IMDM suplementado con plasma autólogo 5%. Con el fin de evaluar el efecto de AA, un conjunto de cultivo se mantuvo con 100 mM de AA, además de las condiciones mencionadas anteriormente. En el día 7, las células fueron sometidas a maduración con una combinación de TNF-α, lipopolisacárido, y CD40L, a la concentración de 100 ng /ml cada una, durante 48 horas. El diseño experimental se representa en forma de un diagrama de flujo Fig. S1. En todos los experimentos DC generadas sin AA fue considerado como un conjunto de control y con AA se consideró como prueba de conjunto
Análisis morfológico:.. Wright y Giemsa tinción
se hayan fijado las células adheridas en placas de cultivo en metanol durante 10 minutos a temperatura ambiente y se tiñeron con Wright y Giemsa. Las observaciones se realizaron bajo microscopio invertido y se tomaron imágenes (Olympus IX70)
Análisis fenotípico: Citometría de flujo
AA madura
+ y AA
- DC se lavaron y se suspendieron.. a 2 × 10
5 células en 100 l de solución salina fría tamponada con fosfato (PBS) y la tinción se llevó a cabo según el protocolo descrito [17], [20]. Para CCR-7 tinción, las células fueron incubadas con primaria seguido de anticuerpos secundario y terciario de 25 minutos cada uno. Las células se lavaron dos veces, después de cada incubaciones de anticuerpos y finalmente se resuspendieron en 1% de paraformaldehído. Las células se analizaron en un citómetro de flujo (FACS Canto II de BD Pharmingen- San Jose, California). Los restos celulares se eliminó del análisis utilizando una puerta en las dispersiones hacia adelante y laterales, y se analizaron las células totales. Los datos fueron analizados y superposiciones de histogramas se prepararon utilizando FACS Diva software de ordenador y teléfono de Quest Pro (Invitan Dickinson San Jose California), respectivamente.
Caracterización funcional
ensayo de endocitosis con FITC-dextrano.
inmaduros países en desarrollo cosechó el día 5 se incubaron con FITC-dextrano (20 mg /ml), ya sea a + 4 ° C (control internalización) o a + 37 ° C, durante 30 y 60 minutos. Después, las células se lavaron tres veces con PBS frío que contiene azida de sodio al 0,01% y 1% de BSA. Las células fueron re suspendidas en paraformaldehído al 1% y se adquirieron en un citómetro de flujo (Canto II, BD).
quimiotaxis.
DC La quimiotaxis de la
in vitro generados
hacia CCL-19 se evaluó en placas de cultivo celular de 24 pocillos con BD Falcon
™ cultivo de células 0,8 micras insertos. 500 l de IMDM con o sin rhCCL-19 (concentración final, 500 ng /ml) se añadió a la cámara inferior de acuerdo con el protocolo descrito [17], [20]. Para comprobar la especificidad de la interacción del receptor de quimioquinas (CCR), en algunos experimentos DCs fueron pretratados con CCR-7 anticuerpo de bloqueo durante 1 h en 1 × PBS y después se estudió su migración hacia CCL -19 como se describe anteriormente. Las células migradas se tiñeron por colorante azul de tripano y las células viables se contaron usando un hemocitómetro. Los resultados se expresan como la media del número de células que migran ± desviación estándar (SD).
leucocitos mezclados de reacción (MLR).
células alogénicas T se distribuyeron en 10
5 células por pocillo en placas de 96 pocillos de fondo redondo micro (Greiner Bio-One) y se cocultivaron en presencia de números de graduadas de las DC irradiadas (2500 rad, fuente Co) en 200 l de medio que contiene 10% de sangre de cordón combinado AB + plasma. La incorporación de timidina se midió en el día 3 después de un pulso de 18 horas con [
3H] timidina (1 Ci /pocillo) utilizando procedimientos estándar [17], [20].
medición de citocinas.
los sobrenadantes de los
in vitro
se recogieron cultivos de corriente continua generada a las 48 horas después de la adición de estímulos de maduración y se mantuvieron congeladas a -20 ° C. Los sobrenadantes se ensayaron posteriormente para el contenido de citoquinas (IL-10 y IL-12 p70) por ELISA usando un kit de ELISA según las instrucciones del fabricante. Cantidad de interleucinas presentes en los sobrenadantes se calcularon por el método de la curva estándar.
in vitro
CTL (linfocitos T citotóxicos) ensayo de
Preparación de lisado celular.
MCF-7 es un HLA-A2 restringido línea celular y se usó como la línea celular diana en el ensayo de CTL. La lisis de las células MCF-7 hecho por la descongelación repetidos de congelación a continuación, seguido por tratamiento con ultrasonidos. Después de la estimación de la proteína de la esterilización del filtro se realiza y el lisado se almacenó a -80 ° C para el antígeno pulsante a los DC.
Generación de células efectoras y el ensayo de CTL.
HLA-A2 cable positivo MNCs de sangre se utilizaron para generar los DC. Inmaduros países en desarrollo se incubaron con lisado de las células MCF-7 a una concentración final de 100 g /ml de proteína junto con KLH (hemocianina de lapa californiana) 25 mg /ml para 48 hr como estímulos de maduración en el medio de cultivo para la presentación cruzada de antígenos de tumor de células T vírgenes autólogas. Para el conjunto de control de países en desarrollo, los estímulos de maduración componen de 100 ng /ml cada uno de LPS, CD40L y TNF-α. Las células T vírgenes autólogas fueron obtenidos por clasificación de CD3, CD8, y células positivas CD45RA en FACS ARIA (BD). Las células T ingenuas fueron co cultivaron con células MCF-7 de lisado de DC pulsados que se generaron a partir de la misma muestra de UCB con o sin AA. cultura co celular DC-T se mantuvo durante 3 semanas con la adición de citoquinas IL-2 (0,1 g /ml) e IL-7 (5 mg /ml) y la estimulación re semanal con DCs antígeno fresco pulsadas para generar efectoras células citotóxicas Killer . de este modo CTL generado a partir de LPS pulsado y pulsado lisado AA
+ DCS /AA
- DCs fueron co cultivaron con las células diana MCF-7 durante 18 horas. Después, las células se lavaron con medios de fricción y luego pulsadas con [3H] timidina durante 8 horas. homicidio por ciento de las células MCF-7 se calculó mediante el ensayo de JAM-P [21], [22] el uso de la formulación% de destrucción = CPM [Target solo - Objetivo Killer +]. X 100 /CPM solo objetivo
RT el análisis por PCR
ARNm se aisló de la AA
+ DC y AA
- DC usando el kit Dynabeads ARNm DIRECT según las instrucciones del fabricante. Los mRNA eluido se transcribieron inversamente en ADNc utilizando transcriptasa inversa (Sigma Aldrich) y cebadores oligo-dT (Invitrogen) según las instrucciones y se llevó a cabo PCR con cebadores específicos. El ciclo térmico usado fue (95 ° C durante 2 min, 95 ° C durante 45 s, hibridación (como por diferentes genes) durante 45 seg, extensión de 72 ° C durante 2 min) durante 35 ciclos y una extensión final a 72 ° C durante 5 minutos. Las secuencias de los cebadores utilizados se describen en la Fig. S2.
Homing de CD maduras en ratones NOD-SCID
La ratones NOD /SCID-LtSz /SCID se obtuvieron de los Laboratorios Jackson y fueron criados en las instalaciones de animales de nuestro instituto. El estudio se llevó a cabo la adhesión a las directrices de la institución para la ganadería y ha sido aprobado por AICE-NCCS /CPCSEA (animal Institucional Comité Ético-NCCS /Comité para los fines de control y supervisión de los experimentos con animales Número de autorización:. CICUAL-Institucional Animal El cuidado y el empleo Comisión, Animalario EAF-Experimental /2004 /B-71). los procedimientos con animales que implican la infusión intravenosa se llevaron a cabo bajo anestesia. Los ratones a las 4-6 semanas de edad fueron expuestos a dosis subletales de 300 rads de irradiación corporal total de un
fuente de 60Co (Cámara Gamma 5000, Brit, Navi Mumbai, India). 10
6 AA
+ DC y AA
- DC fueron infundidas a través de la vena de la cola en los sub ratones irradiados letalmente (n = 43; infusión de AA
DC + - 20 ratones, AA
- DCs - 20 ratones y PBS - 3 ratones). Los ratones se sacrificaron después de 18 horas para evaluar homing de DCs humanas en la médula ósea. células alojados fueron identificados como DC por tinción con mAb CD11c humana. CD de murino mAb 45.1 se utilizó para negar las células presencia de origen murino
El análisis estadístico
Las diferentes variables de AA
+ DC y AA
-. Se compararon los DC. El análisis estadístico se realizó utilizando Sigma Stat (Versión-2.03) y los gráficos se prepararon utilizando el software Sigma Plot (versión 10) (Jandel Scientific, San Rafael, CA, EE.UU.) y GraphPad Prism 5 Software (San Diego, California, EE.UU.). Los análisis estadísticos de las diferencias entre los dos grupos se realizaron mediante una prueba t. valor de probabilidad: P £ 0,05 (*), p≤0.01 (**) & amp; P≤0.001 (***) fueron considerados estadísticamente significativos.
Resultados
morfológica y Caracterización fenotípica de las DC
El AA
+ DC y AA
- los países en desarrollo muestran una morfología similar
los precursores de DC generados después de 21 días de la expansión de las multinacionales se enriquecen con el método de la adhesión de plástico y más diferenciada como los DC [20].. No hubo diferencia marginal en el número absoluto de las DC generadas por los dos métodos de mismo número de comenzar la población (aproximadamente 3 × 10
7 AA
+ DC y 2,5 × 10
7 AA
- DC por cada 10 MNC
7 de entrada). La morfología de AA
+ CC y AA
- DC era comparable. Se encontró que las DCs de ambos los conjuntos mostraron la morfología velada característica y racimos de corriente continua; Higo. S3. imágenes de contraste de fase mostraron DCs inmaduras típicos adherentes, tanto en los conjuntos de [S-3 (A)]. Después de la adición de estímulos de maduración se observaron agrupaciones típicas DC no adherentes tanto en los cultivos [S-3 (B)]. Wright-Giemsa tinción de células adherentes maduras muestra la presencia de países en desarrollo con las dendritas de los dos conjuntos [S-3 (C)]
El AA
+ DC y AA
-. DC Muestra Similar DC fenotipo.
in vitro
las DC generadas se tiñeron de un panel de marcadores específicos asociados y DC DC y se analizaron en el citómetro de flujo. Higo. 1A representa el perfil de citometría de flujo de una muestra representativa con porcentaje de células positivas y valores de MFI entre paréntesis. AA
+ DC y AA
- DC mostraron un alto y un porcentaje equivalente de las células que expresan diferentes moléculas co-estimuladoras como CD40, CD80, CD86, DC-asociado integrina CD11c, moléculas de adhesión como CD54 y CD58, moléculas MHC de clase II como HLA ABC y HLA DR. Higo. 1B y 1C muestra el perfil fenotípico en términos de la positividad por ciento y MFI respectivamente, de tres muestras (media ± SD, n = 3). La expresión de linaje mieloide marcador específico CD 33 se encontró significativamente más alto en AA
+ DCs (67,4%) en comparación con AA
-. DCs (38,7%) Fig 1B. Los valores de las IFM de la molécula de adhesión de CD 58 se encontró significativamente más alto en AA
+ DC (1423), en comparación con AA
-. DC (1048) figura 1C. Tomados en conjunto, AA
+ DC y AA
- DC muestran una morfología similar y el fenotipo típico DC intersticial
perfil
(A) FACS histograma de un experimento representativo.. histogramas llenos muestran el control de isotipo y los abiertos muestran el fenotipo específico con respectivos valores de MFI en los soportes. (B) Se ve que los DC completamente maduras se generaron y no había mucha diferencia en los niveles de expresión de diferentes marcadores de superficie, excepto CD33 (línea mieloide) fue mayor en AA
sets + DC (media ± SD, n = 3, P £ 0,05 *). (C) Gráfico de barras de marcadores específicos y asociados DC en cuanto a la IMF, para CD 58 (molécula de adhesión) se encontró que la diferencia significativamente mayor (media ± SD, n = 3, P £ 0,05 *). (D) del receptor mediada por la captación de antígenos de AA
+ DC y AA
- DC: captación de dextrano-FITC por países en desarrollo (n = 3, media ± DE). El valor de control (absorción a 4 ° C) se deduce del valor de la prueba respectiva (absorción a 37 ° C).
Caracterización funcional de las DC
La capacidad de endocitosis de AA
+ DC fue mayor en comparación con AA
-.
DC
inmaduros países en desarrollo se caracterizan por la capacidad de captación de antígenos mediante diferentes mecanismos. Se analizó la capacidad de los
in vitro
las DC generadas en para su captación de antígenos mediada por el receptor mediante la medición de la absorción de FITC marcado dextrano. AA
+ DC y AA
- DC fueron igualmente eficientes en la captación mediada por receptor a los 30 min y 60 min intervalos de tiempo ensayados. AA
+ DC exhiben absorción de FITC-dextrano de alto y comparable en comparación con AA
- DC Fig. 1D (media ± SD, n = 3).
in vitro
las DC generadas expuestas más la absorción en el intervalo de 60 minutos en comparación con los 30 minutos, demostrando que son funcionalmente activos y muestran un aumento de la captación con el aumento en el tiempo.
mejorada
in vitro
quimiotaxis de AA
+ DC hacia CCL19.
la migración de los países en desarrollo hacia un gradiente de quimioquinas es una propiedad funcional importante porque en los protocolos de inmunoterapia deben ser capaces de migrar desde el sitio de la inyección hacia el los ganglios linfáticos, donde interactúan con las células T e iniciar la respuesta inmune. Higo. 2A muestra, las células en suspensión en IMDM añaden a la cámara superior en el pozo a 0 hrs. No se observó la migración espontánea en los pocillos después de 3 horas, donde no se añadió CCL-19 (Fig. 2B). Más número de AA
+ DC (figura 2D.) Migraron hacia CCL-19 en comparación con AA
- DC (figura 2C.) Y la diferencia fue estadísticamente significativa (p = 0.05 *, ** p≤0.01 ; n = 3; Fig. 2E). Migración hacia CCL19 se debe principalmente a los países en desarrollo expresan receptor CCR7. Cuando teñidas los países en desarrollo de los dos conjuntos para el anticuerpo receptor CCR-7, el AA
+ DC y AA
-. DCs mostró 93,25% y el 91,89% de células positivas, respectivamente, junto con valores de MFI entre paréntesis (figura 2F ). Los valores medios de las IFM de 3 muestras de AA
- Países en desarrollo fueron 821 ± 156 y AA
+ DC fueron 1.089 ± 392. Por lo tanto ambos conjuntos mostraron alto nivel y comparable de expresión CCR7. La especificidad de la reacción del ligando al receptor CCR7-CCL19 se confirmó además por el bloqueo del receptor con CCR-7 bloqueo Ab y luego probar la capacidad migratoria. Como se ve en la Fig. 2G hubo una reducción significativa en la migración de las células pretratadas con anticuerpo de bloqueo en los dos cultivos. La migración de las células de ensayo fue una vez más significativamente mayor que las células de control. Estos datos indicaron que, la adición de AA durante la etapa de diferenciación de las DC mejora significativamente su capacidad migratoria
.
Después de 3 horas (B) no se observó migración espontánea en los pozos, en los que no se añadió CCL-19. Menos no. de AA
- DC (C) migraron hacia CCL-19 de AA
+ DC (D). (E) AA
+ DC mostró estadísticamente eficiente migración hacia CCL-19 en comparación con AA
- DC (n = 3, media ± DE). perfil histograma (F) FACS de un experimento representativo que muestra la expresión de receptores de quimioquinas CCR-7, junto con valores de MFI entre paréntesis. histogramas llenos muestran el control de isotipo y los abiertos muestran el fenotipo específico. (G) que bloquea con CCR-7 Ab causa una reducción significativa en la migración tanto en AA
+ DC y AA
- DC (n = 3, media ± DE). [P £ 0,05 (*), p≤0.01 (**) & amp; P≤0.001 (***)].
AA
+ DC función estimuladora de células T superiores exhibido.
DC se caracterizan por su capacidad de estimular células T alogénicas . Esta capacidad se evaluó por MLR. El MLR se llevó a cabo mezclando el AA
+ DCs y AA
- DCs con las células T alogénicas de sangre periférica en diferentes proporciones. se tomaron por triplicado para cada concentración ensayada. La proliferación de células T se midió por el ensayo de absorción de timidina como se describe en los métodos. Los datos de la Fig. 3 (media ± SD, n = 3) indican que el AA
+ DC tienen mayor capacidad aloestimuladora. Las diferencias fueron estadísticamente significativas en cuatro de seis DC: ensayaron las proporciones de células T. En relación 1:10, la incorporación de timidina en AA
+ fue superior a AA
-.
Conjunto
AA
+ DC mostró una mejor estimulación de células T que el AA
- DC , las diferencias fueron significativas en cuatro de seis DC: proporciones de células T a prueba (P £ 0,05 *, ** p≤0.01). Se muestran los datos representativos de tres experimentos independientes. TdR = timidina.
Perfil de citocinas de AA + DCS es más favorable para la inmunoterapia adoptiva.
No sólo las señales para el desarrollo de las funciones efectoras de las células T, sino también programas de las IL-12 las células sobrevivir como células de memoria funcionales [23].
in vitro
las DC generadas eran capaces de secretar un alto nivel de IL-12 p70 y un bajo nivel de IL-10. El AA
+ DCs mostró un mejor perfil de secreción de IL-12 p70 en comparación con AA
- DCs (Fig. 4). AA
- DCs en otra parte tenían un mayor nivel de IL-10 en comparación con la secreción de la de AA
+ DCs (n = 3). La relación de IL12 /IL10 fue mayor en AA
+ DCs como se muestra en la Fig. S4. Estas observaciones sugieren que el AA
+ DC tienen un mejor perfil de citocinas Th1 favorables en comparación con AA
- DC, por lo que una mejor opción para la aplicación clínica
Los resultados muestran que las DC generadas por ambos. condiciones de cultivo eran capaces de la secreción de p70 de IL-12 e IL-10. (A) AA
+ DC mostró una mejor secreción de p70 de IL-12 en comparación con AA
- DC. (B) Del mismo modo, AA
+ DC tienen un bajo nivel de IL-10 perfil de secreción en comparación con AA
- DC. Se muestran los datos de tres muestras independientes (n = 3, media ± DE). [P £ 0,05 (*), p≤0.01 (**) & amp; P≤0.001 (***)].
AA
+ DC demuestran mayor
in vitro
actividad CTL
Figura 5A representa los datos de un CTL muestra representativa. Se ve claramente que AA
+ DCs son más eficientes en la función efectora de las células T es decir, provocando la muerte de las células MCF-7 células en el ensayo de CTL en comparación con AA
- DCs. La matanza es significativamente más alta en cuatro proporciones de las concentraciones de células diana efector. Las otras dos muestras también mostraron tendencia similar (Fig. S5). CTL derivado de AA
+ DC exhibió una función efectora mejorada es decir, matar global mejorada en comparación con los CTL derivados de AA
- DC. Para el conjunto de control negativo, AA
+ DC y AA
- conjuntos DCs fueron madurados con LPS, TNF-α y CD40L [20]. El CTL genera así no fuera eficaz para matar la línea celular MCF-7 de destino. No matanza se observó en cualquiera de estos conjuntos (datos no mostrados). Como control negativo adicional de la especificidad objetivo, CTLs obtuvo de MCF-7 DCs lisado preparado se utilizaron en el ensayo de CTL contra la línea celular H1299, pero no efecto letal se ha visto en estos conjuntos, así (valores de CPM para la incorporación de timidina en el caso de control fue de 12.649,33 30.73 ± SD. para el grupo pulsado y sin pulsar en el más alto objetivo relaciones entre células T eran 12.405,66 ± SD y 36.35 ± 27.47 12.537,33 SD, respectivamente).
(a) los datos de CTL de una muestra representativa es decir, el asesinato del objetivo ( MCF-7 células) por los CTL generados por AA
+ DC /AA
- DC pulsados con células MCF-7 lisado celular. CTL derivado de AA
+ DC exhibió una función efectora mejorada es decir, matar global mejorada en comparación con los CTL derivados de AA
- DC. La matanza es significativamente más alta en cuatro proporciones de las concentraciones de células diana efector. (* P £ 0,05, ** p≤0.01, p≤0.001 ***). perfil (B) La expresión de genes de tres enzimas claves asociados con la vía AA junto con la limpieza gen GAPDH. Hay una sustancial sobre regulación de la transcripción a nivel de la enzima clave de la COX-2 en los países en desarrollo cultivadas en presencia de AA.
Los niveles de mRNA de las enzimas clave implicadas en el metabolismo de AA son más altos en AA
+ DCs
Los niveles de transcripción de tres enzimas asociadas con ruta del ácido araquidónico, tales como COX-1, COX-2, PLA
2, fueron detectados por RT-PCR llevada a cabo según métodos estándar. Gel imágenes de RT-PCR se muestran en la Fig. 5B. Higo.