Extracto
Introducción
La amplificación del receptor del factor de crecimiento de fibroblastos 1 (FGFR1) gen se ha descrito en los tumores de células no pequeñas de cáncer de pulmón (NSCLC) pacientes. informes previos mostraron en conflicto tasas de frecuencia de la amplificación y la relevancia clínica.
Materiales y Métodos
Hemos desarrollado un fiable en tiempo real el ensayo de PCR cuantitativa para evaluar la frecuencia de FGFR1 amplificación y se evaluó el nivel de corte óptimo de amplificación para la aplicación clínica.
resultados
En una cohorte de formación de 203 NSCLC, se estableció que una amplificación de 3,5 veces divide de forma óptima a los pacientes en grupos con diferentes tasas de supervivencia con un nivel umbral claro. Aquellos con niveles de amplificación FGFR1 por encima de 3,5 veces tenían una supervivencia inferior. Estos datos fueron confirmados en una cohorte de validación de 142 NSCLC. Después de ajustar por edad, sexo, estado funcional, estadio, y la histología, los pacientes con niveles de amplificación FGFR1 por encima de 3,5 veces tenían un riesgo relativo de 2,91 (95% CI 1,14, 7,41; valor de p-0.025) de muerte en el grupo de validación. Las tasas de FGFR1 amplificación con el valor límite de 3,5 eran 5,1% en células escamosas y el 4,1% en los adenocarcinomas. Hubo una tendencia no significativa hacia tasas más altas amplificaciones en los fumadores pesados (& gt; 15 paquetes-año de consumo de cigarrillos). En comparación con los fumadores leves
Discusión
Nuestros datos sugieren que un 3,5 -fold amplificación de FGFR1 es de importancia clínica en el CPNM. Nuestro análisis de punto de corte mostró un efecto umbral claro para el impacto de la amplificación de FGFR1 en la supervivencia de los pacientes, que se puede utilizar como una guía inicial para la selección de pacientes en ensayos que evalúan la eficacia de los inhibidores de FGFR nuevos
Visto:. Gadgeel SM, Chen W, Costa ML, Bollig Fischer-A, S Tierra, Schwartz AG, et al. (2013) de crecimiento de fibroblastos receptor del factor de amplificación 1 en células no pequeñas de cáncer de pulmón por Cuantitativo PCR en tiempo real. PLoS ONE 8 (11): e79820. doi: 10.1371 /journal.pone.0079820
Editor: A R M Ruhul Amin, Winship Cancer Institute de la Universidad de Emory, Estados Unidos de América
Recibido: 30 de junio de 2013; Aceptado: 3 de octubre de 2013; Publicado: 8 Noviembre 2013
Derechos de Autor © 2013 Gadgeel et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Con el apoyo de Departamento de Defensa de conceder W81XWH-11-1-0050. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, la decisión de publicar o preparación del manuscrito.
Conflicto de intereses: Los autores han declarado no existen intereses en competencia
Introducción
un cambio de paradigma en el tratamiento del cáncer de pulmón no microcítico (CPNM) de los pacientes tiene. sido la identificación de alteraciones genéticas terapéuticamente accionable "conductor" [1]. El número de estas alteraciones genéticas está aumentando constantemente [2]. Sin embargo, la mayoría de las alteraciones se han identificado en adenocarcinomas de pulmón. Por lo tanto, el impacto terapéutico de este cambio de paradigma ha sido mínimo para los pacientes con carcinoma de células escamosas del pulmón
.
Recientemente, la amplificación del receptor del factor de crecimiento de fibroblastos 1 gen (FGFR1) se ha descrito como una alteración oncogénica en un subgrupo de carcinomas de células escamosas [3,4]. FGFR1 pertenece a la familia de los receptores FGFR y está implicado en la inflamación, la cicatrización de heridas y el desarrollo embrionario. Puesto que la familia de los receptores FGFR parece tener un papel en muchos tipos de cáncer, se están desarrollando varios inhibidores de FGFR [5]. Presentación de un caso único ha demostrado que el inhibidor de FGFR BGJ398 demostró respuesta parcial en un paciente con carcinoma de pulmón de células escamosas cuyo tumor se amplificó por FGFR1 [6].
Un aspecto esencial para el enfoque terapéutico de las alteraciones genéticas en el pulmón el cáncer es la identificación rápida, específica y precisa de las alteraciones en las muestras de pacientes. Muchos investigadores han utilizado la hibridación fluorescente in situ (FISH) para detectar la amplificación FGFR1 [7-11]. La definición de FGFR1 amplificación ha variado entre los distintos informes. Además, el análisis FISH es laborioso, técnicamente compleja, y el lector dependiente. Estas características limitan su aplicabilidad clínica. Hemos desarrollado una, en tiempo real prueba de PCR cuantitativa, lo que es más fácil de realizar y robusto en su interpretación, para evaluar NSCLC para FGFR1 amplificación y se evaluaron las características clínicas y la importancia pronóstica de esta alteración genética. Nuestro objetivo final es ser capaz de identificar a los pacientes con CPNM que se pueden derivar beneficios clínicos de los inhibidores de FGFR1 que utilizan esta prueba basado en la PCR.
Pacientes y métodos
toma de la muestra y los resultados de datos
Recogida de muestras biológicas y los datos de los resultados cumplió con la Declaración de Helsinki y fue aprobado por la Escuela de Medicina Junta de Revisión Institucional de la Universidad del Estado de Wayne. materiales tumorales utilizadas en esta investigación eran de pacientes que dieron su consentimiento informado por escrito. las muestras de tumor fresco congelado se recogieron de forma prospectiva de pacientes que se sometieron a una resección quirúrgica para el cáncer de pulmón diagnosticado o se sospecha. Todos los pacientes que eran candidatos para la resección quirúrgica del cáncer de pulmón, ya sea por biopsia o se sospecha, se dieron su consentimiento para la recogida de muestras. Sólo los pacientes cuyos tumores fueron confirmados para ser CPNM fueron incluidos en este análisis. (3 N =) fueron excluidos muestras de pacientes con un diagnóstico final de carcinoma de células pequeñas (N = 16) o un componente de células pequeñas de NSCLC (N = 2), los tumores carcinoides (N = 6), o mesotelioma. Las muestras se mantuvieron congeladas a -80 ° C en alícuotas de aproximadamente 0,1 g. los procedimientos de adquisición de muestras fueron desarrollados para reducir la resección de la congelación intervalo de tiempo a menos de 30 minutos. La calidad de los analitos extraídos se aseguró mediante la realización de análisis de integridad. El período general de adquisiciones varió de 1985 a 2001. Fijado en formol y embebidos en parafina especímenes fueron revisados para verificar el diagnóstico y determinar el contenido de las células tumorales. Los especímenes se identifican por números de laboratorio que permitieron la referencia cruzada con los datos clínicos del registro de tumores y la revisión de las historias sin la revelación de la identidad del paciente. resultados demográficas y clínicas de datos recogidos incluyen las fechas de nacimiento, diagnóstico (definida como la fecha de la primera comprobación patológica de los tumores malignos), la resección quirúrgica (la misma que la fecha de adquisición de la muestra), y la fecha del último seguimiento o la muerte; el sexo, la raza, la histología del tumor, patológico y el estadio clínico del tumor (versión 6), el estado funcional, la pérdida de peso (definido como & gt; 5% durante los 3 meses que proceden de la cirugía), y la historia de tabaquismo de auto-reporte (definidos como tiempo de vida que nunca Hábitos para aquellos que habían fumado & lt; 100 cigarrillos, ex fumador de los que habían dejado de fumar cigarrillos durante más de un año, y fumador para todos los demás). Uno de los pacientes incluidos en este análisis tenido la quimioterapia preoperatoria y la radiación y uno tenía la radioterapia preoperatoria. Ninguno de los pacientes tenía la terapia adyuvante. Un protocolo estandarizado para la evaluación de seguimiento de los pacientes no se especificó.
Las muestras se dividieron en un entrenamiento y que no se solapan cohorte de validación. han sido previamente informado de los detalles de la cohorte de validación [12].
extracción de ADN y PCR cuantitativa análisis
Las muestras (~ 100 mg) se pulverizaron con mortero y majas separada, esterilizada y congelada . Se extrajo el ADN usando técnicas de extracción basados en fenol a base de resina o, y las muestras se dividió en alícuotas y se almacena refrigerado. cantidad y calidad del ADN se evaluó mediante la Quantifiler
® kit de cuantificación de ADN humano (Life Technologies, Carlsbad, CA), un enfoque para cuantificar el ADN amplificable presente en la muestra mediante una PCR en tiempo real TaqMan
® ensayo que los objetivos una secuencia de pares de base 62 en el gen de la telomerasa humana. Una curva estándar de concentraciones de ADN conocidas también se analizó para la comparación y cuantificación de cada muestra de ADN. El fluorescente en tiempo real TaqMan
® reacción descrita por Hied, et al, se basa en una sonda de hibridación marcada con dos colorantes diferentes, un colorante informador (FAM) y un extintor de colorante no fluorescente [13]. Cuando la sonda está intacta y no extendida, la emisión fluorescente del colorante reportero es absorbida por el tinte de extinción. Cuando la sonda se hibrida específicamente a la secuencia diana de ADN correspondiente, durante la fase de extensión de la PCR la sonda se escinde por la actividad nucleolítica 5'-3 'de la ADN polimerasa. En la escisión de la sonda, el colorante de extinción se libera del complejo que resulta en un aumento de los espectros de emisión de fluorescencia del tinte reportero.
análisis del número de copia para el gen FGFR1 humano se realizó mediante PCR en tiempo real utilizando dos independiente TaqMan
® ensayos (Life Technologies, Carlsbad, CA) específicos para el exón 15 (número de catálogo; Hs02702320 dirigidos Chr.8: 38274932 en NCBI construir 37, se solapan el intrón 14 - exón 15 de límite en la región del dominio quinasa) y el exón 19 (número de catálogo Hs00237051; focalización Chr.8: 38271828 en NCBI Build 37, solapando el intrón 18 - exón 19 de límite en la región del dominio quinasa). la cuantificación relativa del número de copias de genes en muestras de cáncer de hecho por el método (2
-ΔΔCT) Livak usando CEPH 1347-1302 ADN de control y RPLPO como el gen de referencia (número de catálogo 4326314E), ambos de Life Technologies [14]. El valor promedio de 3 repeticiones se calculó y se utiliza como nivel de amplificación de genes.
cuantificación de ADN y número de copia TaqMan
® ensayos se llevaron a cabo y los datos de espectros de emisión obtenidos mediante un Applied Biosystems
® 7900 Real- Time PCR System (Life Technologies).
El análisis estadístico
El umbral óptimo FGFR1 amplificación para la separación de los pacientes con la supervivencia global a largo y corto (OS) se determinó por primera vez en una cohorte de entrenamiento y luego confirmado en una cohorte de validación independiente y externa. El criterio de valoración principal fue la SG, que se define como el intervalo de tiempo desde la fecha de diagnóstico hasta la muerte por cualquier causa. Los pacientes que estaban vivos o perdieron durante el seguimiento fueron censurados en la fecha última vez con vida. características descriptivas de los pacientes al inicio del estudio fueron reportados para las cohortes de entrenamiento y validación. Debido a la sobre tema apropiado en la identificación del valor del marcador de corte relacionados resultado, se utilizó una validación cruzada de diez veces dentro de la cohorte de formación. En pocas palabras, la cohorte de formación se dividió al azar en 10 porciones. Cada vez, una porción se dejó de lado y se utilizaron los nueve partes restantes para identificar el mejor punto de corte, que se define como el que llegó a la prueba de log-rank más significativo sobre la asociación entre el sistema operativo y la asignación de grupo (amplificado o no amplificado) entre todos los puntos de corte posibles. A continuación se utilizó el mejor punto de corte determinado para obtener una asignación de grupo para cada uno de los pacientes en la parte de retirada de tierras, que no se utilizan para determinar el punto de corte. Este proceso se repitió para cada una de las porciones de 10, hasta que todos los pacientes en la cohorte de formación tenían una asignación de grupo. A continuación, se realizó una prueba de log-rank en toda la cohorte de formación. Hemos repetido este proceso 1000 veces para obtener una distribución de las mejores puntos de corte. El punto de corte con la frecuencia más alta fue el corte final que se probó en la cohorte de validación.
Se utilizó la prueba de log-rank para confirmar el punto de corte en la cohorte de validación. Un modelo de Cox se utilizó para evaluar el papel pronóstico independiente de FGFR1 amplificación ajustado por edad, sexo, estado funcional (PS), el estadio y subtipo histológico. El PS faltaba un 10% en los datos de validación, lo que reduciría el tamaño de la muestra y el poder si se analizaron sólo las observaciones realizadas. Ya que creemos que la PS está completamente ausente al azar en esta serie clínica, se modificó el método de imputación múltiple propuesto originalmente por Rubin y lo implementó en el modelo de Cox para los datos de validación (15,16). En pocas palabras, sólo se imputó los valores que faltan dos veces (M = 2). Uno con toda la PS falta imputada a 0, y el otro con toda la PS falta imputada a 0, la única otra opción para el PS dicotómica. Este enfoque imputación múltiple libre de modelo se ajusta a nuestras necesidades para estimar el efecto de nuestra variable de interés, el amplificado o no amplificado FGFR1, bajo la circunstancia extrema de covariables. El error estándar estimado viene dada por la fórmula de Rubin [15,16]. Todos los
p-valores fueron
2 caras con un nivel de significación de 0,05. Todos los cálculos se realizaron con R, versión 2.14.0 [17]
Resultados
Características clínicas de entrenamiento y validación cohortes
ADN en cantidad y calidad suficientes se obtuvo de 347 tumoral Las muestras de pacientes con NSCLC. eran datos de SO disponibles en 345 pacientes, cuyas características basales se enumeran en la Tabla 1. La mediana de edad fue de 66 años, el 66% eran hombres, y la mediana del consumo de cigarrillos fue de 50 paquetes-años (PY). La mayoría (66%) de los pacientes tenían enfermedad en estadio I, y los adenocarcinomas (49%) y carcinomas de células escamosas (39%) fueron las principales categorías histológicas. Las características basales de los cohortes de entrenamiento y validación fueron similares, aunque la cohorte de validación tenía más no blancos (p & lt; 0,001), peor PS (p & lt; 0,001) y es ligeramente mayor paquete años la mediana del consumo de tabaco (p = 0,033) en comparación con . la cohorte de formación
variable
formación cohorte de validación
cohorte
Valor P
* gratis (n = 203) (n = 142) Edad media (rango) 66,2 (35,0 - el 83,8 ) 65,2 (25,8-81,9) 0.144Sex Hombre 133 (66%) 93 (65%) 1,000 Female70 (34%) 49 (35%) Race White197 (97%) 125 (88%) & lt; 0,001 African American3 (1% ) 15 (11%) Otros3 (1%) 2 (1%) Histología Adenocarcinoma98 (48%) 71 (50%) 0,108 Squamous79 (39%) 57 (40%) cell15 grande (7%) 13 (9%) Other11 (5%) 1 (1%) Etapa IA56 (28%) 42 (30%) 0,857 IB83 (41%) 48 (34%) IIA7 (3%) 6 (4%) IIB32 (16%) 27 (19% ) IIIA16 (8%) 12 (8%) IIIB2 (1%) 3 (2%) IV6 (3%) 4 (3%) Estado de Rendimiento 0,147 (72%) 29 (20%) & lt; 0.001 144 (22% ) 79 (56%) 21 (& lt; 1%) 20 (14%) Falta Data11 (5%) 14 (10%) la pérdida de peso Absent162 (80%) 117 (82%) 0,049 Present28 (14%) 9 (6 %) Falta Data13 (6%) 16 (11%) de fumadores History0.247
** Nunca smoker10 (5%) 11 (8%) fumador leve (& lt; 15 PY) 13 (6%) 3 (2% ) fumador empedernido (& gt;. 15 PY) 163 (80%) 106 (75%) Falta Data16 (8%) 22 (15%) Tabla 1. características de los pacientes
* la prueba exacta de Fisher para las variables categóricas y la suma de rangos de Wilcoxon prueba para las variables continuas edad y años-paquete. ** la prueba exacta de Fisher entre los fumadores nunca y nunca. Descargar CSV CSV
concordancia Concordancia entre las variaciones del número de copias (CNV) del exón 15 y el exón 19 del gen FGFR1
En primer lugar, se evaluó entre el exón 15 y el exón 19 CNV para el gen FGFR1 utilizando nuestro nuevo desarrollo ensayo de PCR en tiempo real en la cohorte de formación de 203 pacientes con CPNM. Exón 15 VNC oscilaron entre 0.58 - 14.32, exón 19 VNC oscilaron entre 0,44 - 12.89, y estaban altamente correlacionados (Spearman rango r = 0,918, p & lt; 0,001) (Figura 1)
óptima. punto de corte determinación en la formación cohorte
a continuación, se determinó el nivel del exón 15 CNV que produjo la separación óptima de los pacientes en la cohorte de entrenamiento en grupos con OS corto y largo. El uso de un umbral de CNV de 3,50 dio como resultado la mejor separación, con 191 pacientes que tienen niveles de menos de 3,50 y 12 (5,9%) pacientes mayor que 3,50. Los pacientes con un alto CNV tenían significativamente una mayor probabilidad de muerte en comparación con aquellos con VNC por debajo del umbral (HR CI = 2.19, 95%: 1,02, 4,75;
p = 0,045
; Figura 2). Ajustar por covariables la edad, sexo, estado funcional, estadio, histología y dado el mismo punto de corte de 3,50 (Figura 2).
Resultados de la validación de cohortes
Para confirmar el impacto del sistema operativo de la CNV umbral de 3,50, se analizó la cohorte de validación de 142 pacientes (exón 15 CNV rango 0,69 a 46,54). Cinco pacientes (3,5%) tenían niveles más altos, y 137 tenían niveles bajos. Se realizó un análisis de regresión de Cox ajustando por las mismas covariables y pudimos confirmar que los pacientes con altos CNV y una razón de riesgo de muerte de CI 2,91 (95%: 1,14, 7,41;
p = 0,025
; Tabla 2). las estimaciones de supervivencia de Kaplan-Meier demostraron ya SG en pacientes con NVC bajos en comparación con aquellos con alta CNV. (
p = 0,0398
; Figura 3) Cociente de riesgos
variable gratis (IC del 95%)
p
-Valor
valor FGFR1 CNV & lt; 3,50 (n = 137) Reference0.025 & gt; 3,50 (n = 5) 2.91 (1.14 - 7.41) Etapa I (n = 90) Reference0. 005 & gt; I (n = 52) 1,90 (1,22 - 2,96) en HI edad (como variable continua) 1,01 (0,99 - 1,03) 0.35Sex masculino (n = 93) Reference0.11 femenino (n = 49) 0,68 (0,42 - 1,09) estado funcional de 0 (n = 29) Reference0.15 & gt; 0 (n = 113) 1,57 (0,86 - 2.88) histología de adenocarcinoma (n = 71) de referencia escamosas (n = 57) 1,08 (0,69 - 1.68) 0.75 células grandes (n = 13) 1,16 (0,51 -. 2,62) 0,73 Otros (n = 1) modelo multivariante de Cox 2. NANATable en la cohorte de validación (N = 142)
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Frecuencia y características de los pacientes con FGFR1 amplificación
a continuación, se combinaron las cohortes de entrenamiento y validación y analizado la tasa de pacientes con FGFR1 amplificación (que se define como la CNV & gt; 3,50) por sus características basales (Tabla 3). La tasa global de amplificaciones FGFR1 fue del 4,9% (17/345). FGFR1 amplificación fue más frecuente en los hombres (7%) en comparación con las mujeres (2%),
p = 0,064
. No hubo diferencia significativa en la tasa de amplificación FGFR1 entre adenocarcinomas (4,1%) y carcinomas de células escamosas (5,1%). No se encontró una diferencia estadísticamente significativa para la amplificación FGFR1 entre los tumores de pacientes con (& lt; 15 PY) "luz" y "pesado" (≥ 15 PY) antecedentes de fumar (3% frente a 6%), aunque hubo una tendencia hacia una tasa más alta entre los fumadores 'pesados'. El número de pacientes que estaban de por vida que nunca han fumado nunca en comparación con los fumadores con y sin FGFR1 amplificación era demasiado bajo para una comparación estadísticamente significativa
variable
FGFR1 CNV & gt;. 3.50
FGFR1 CNV & lt; 3,50
p
-Valor
* Sexo seguro Male15 (7%) 211 (93%) 0,06 Female2 (2%) 117 (98%) Carrera White17 (5%) 305 (95% ) 1 African American0 (0%) 18 (100%) Other0 (0%) 5 (100%) de fumadores Historia & lt; 15 AP1 (3%) 36 (97%) 0,74 & gt; 15 PY15 (6%) 255 (94 %) Data1 Missing (3%) 37 (97%) Histología Adenocarcinoma7 (4%) 162 (96%) 0,04 Squamous7 (5%) 129 (95%) cell0 grande (0%) 28 (100%) Otros3 (25% ) 9 (75%) Etapa I 9 (4%) 220 (96%) 0,29 & gt; I8 (7%) 108 (93%) Estado de Rendimiento 09 (5%) 167 (95%) 0,59 & gt; 06 (4% ) 138 (96%) Falta Dato2 (8%) 23 (92%) Tabla 3. Distribución de FGFR1 amplificación en todos los pacientes (N = 345).
* CSV exacta de Fisher test descarga CSV
Discusión
la capacidad para identificar y seleccionar las alteraciones oncogénicas en NSCLC ha sido un gran avance en el tratamiento de los pacientes. Un aspecto importante de la traducción de estas alteraciones moleculares en la práctica clínica es el desarrollo de ensayos que pueden identificar con rapidez y fiabilidad aberraciones específicas en muestras clínicas. Nuestros resultados sugieren que el tiempo real de ensayo PCR cuantitativa desarrollado puede identificar tumores con amplificación FGFR1 clínicamente significativa.
señalización FGFR se activa en muchos tipos de cáncer, incluyendo células escamosas orales, de ovario, de vejiga, y los cánceres de mama [5,18 -22]. Weiss et al. fueron de los primeros en informar de que el segmento cromosómico 8p12, que incluye el gen FGFR1, se amplifica en el 9,7% de los carcinomas de células escamosas de pulmón [3]. Además, los autores informaron que los pacientes con FGFR1 amplificación tumoral tendían a tener una supervivencia inferior, aunque no significativa. El análisis incluyó a 77 adenocarcinomas, y encontraron FGFR1 amplificación sólo en el 1% de los pacientes. También analizaron un conjunto independiente de 153 carcinomas de células escamosas, utilizando una sonda de FISH 8p12-específica y se detectaron FGFR1 amplificación (definido como & gt; 9 copias en una fracción de las células no especificado) en el 22% de los pacientes. Dutt et al. 8p11-12 evaluado los segmentos en más de 600 tipos de cáncer de pulmón que utilizan la tecnología de matriz SNP y lo encontramos amplificado (definida como la variación del número de copia 3.25) en el 6% de NSCLC, el 21% (12/57) de células escamosas y el 3,4% (20/588 ) en adenocarcinomas [4]. Además, mostraron que la proliferación de líneas de células de NSCLC con amplificación parecía ser dependiente de la vía de activación FGFR1.
Varios otros investigadores han analizado muestras clínicas de NSCLC para presencia de FGFR1 amplificación por FISH [7-11]. Existe una considerable variabilidad en la definición de un resultado positivo en estos informes. Sin embargo, todos reportaron una tasa significativamente mayor en los carcinomas de células escamosas en comparación con los adenocarcinomas. Algunos informes han encontrado tasas más altas en los hombres en comparación con las mujeres, y algunos informes han encontrado pronóstico FGFR1 amplificación de supervivencia inferior [8,9]. Los datos relativos al impacto pronóstico de FGFR1 amplificación varía entre los diferentes estudios; con algunos estudios que muestran una peor supervivencia [3,7] y otras personas que no muestran diferencias en los resultados [8].
La variabilidad de los tipos de amplificación FGFR1 según lo determinado por FISH está relacionada con las diferencias en la definición de un resultado positivo y en la interpretación de los resultados. Por ejemplo, en un análisis de 420 cánceres de pulmón, un grupo de investigadores de Alemania define un tumor como altamente amplificado si la relación de FGFR1 /centrómero fue ≥ 2,0, el promedio de las señales de FGFR1 por núcleo de células tumorales fue ≥6, o si es grande racimos (≥ 15 señales FGFR1) fueron encontrados en ≥ 10% de los núcleos contados. Con estos criterios, reportaron una tasa de FGFR1 amplificación del 16% [11].
análisis FISH es laboriosa y técnicamente compleja, y el lector dependiente. Todos son características que limitan su aplicabilidad clínica. Por lo tanto, diseñamos un ensayo que evalúa FGFR1 amplificación de genes por PCR en tiempo real cuantitativo, que es técnicamente menos complejo, automatizado, cuantitativa, e independiente de la interpretación lector. Nuestra investigación reveló que una amplificación de 3,5 veces del gen FGFR1 fue pronóstico de supervivencia inferior. Además, nuestro análisis óptimo punto de corte sugiere que hay un umbral claro (Fig. 2) para la interacción entre la amplificación del gen y la supervivencia; es decir, el cociente de riesgo se mantiene aproximadamente 1,0 para niveles de amplificación por debajo de 3,0 veces y se mantiene en aproximadamente 2,5 veces para los niveles por encima de 3,5 veces. El uso de este punto de corte, la tasa de tumores FGFR1 amplificado fue 5,1% en los carcinomas de células escamosas. Esta tasa es inferior a los reportados en otros manuscritos debido a un nivel más alto punto de corte. Por ejemplo, tuvimos nos fijamos el punto de corte a una amplificación de 2,0 veces, el 19% (26/136) de los carcinomas de células escamosas habría sido positivo. Aunque este tipo de amplificación es más consistente con informes anteriores, no optar a utilizar este nivel, porque carece de utilidad clínica pronóstica. Curiosamente, Genoma del Cáncer Atlas de Investigación (TCGA) informó recientemente a la red un análisis exhaustivo de las alteraciones genómicas y epigenómicos en 178 carcinomas de células escamosas del pulmón y se encontró que la tasa de FGFR1 amplificación fue del 7% [23]. Por lo tanto, nuestros resultados son similares a los hallazgos del TCGA.
No se encontró una diferencia significativa en la tasa de FGFR1 amplificación entre células escamosas y adenocarcinomas como se informó anteriormente [3,4]. Esto puede explicarse por el sesgo de selección, las diferencias en las definiciones tecnologías y los puntos de corte, la variabilidad en la interpretación histológica, o el impacto de los antecedentes de tabaquismo. Algunos informes han sugerido que la tasa de FGFR1 amplificación es mayor en los fumadores, y amplificaciones no pueden ser observados en los fumadores nunca [7]. Se ha observado una tendencia hacia una mayor tasa de FGFR1 amplificación en los fumadores 'pesados' como en comparación con los fumadores "light". Es posible que la tasa de amplificación FGFR1 está relacionada con historia de tabaquismo, el tabaquismo prolongado específicamente, lo que puede explicar la asociación percibida con carcinoma de células escamosas, ya que es este subtipo que está más estrechamente relacionada con el consumo de cigarrillos. Nuestra tasa de FGFR1 amplificación del 4,1% en los adenocarcinomas es similar a la tasa de la amplificación detectada en otras publicaciones [3,11].
Interés
La identificación de FGFR como un "conductor" potencial de cánceres ha estimulado el desarrollo de inhibidores de la vía. Los ensayos en curso están evaluando el papel de los inhibidores de FGFR en los tumores con la activación de FGFR1, incluyendo carcinoma de células escamosas del pulmón. Recientemente, Wolf et al. informado de una respuesta confirmado que BGJ398, un inhibidor de FGFR, en un paciente de carcinoma de células escamosas cuyo tumor tenía una relación de FGFR1 /CEP8 de 2,6 por FISH [6]. Ya sea que nuestro ensayo de PCR cuantitativa se puede utilizar para predecir las respuestas a los inhibidores de FGFR queda por determinar, como lo hace el punto de corte óptimo para predecir la respuesta. Sin embargo, nuestros datos sugieren que una amplificación de 3,5 veces es un punto de partida razonable preliminar.
En conclusión, hemos desarrollado un ensayo cuantitativo en tiempo real-PCR para la determinación rápida y fiable de FGFR1 amplificación en las muestras tumorales. Nuestros datos sugieren que una amplificación de 3,5 veces es de importancia clínica en el CPNM ya que los pacientes con niveles más altos tienen una menor supervivencia que aquellos con niveles más bajos. La frecuencia de las amplificaciones por encima de este nivel es del 5,1% en los carcinomas de células escamosas y el 4,1% en los adenocarcinomas. Nuestro análisis sugiere que el punto de corte se produce un efecto umbral claro para el impacto de FGFR1 amplificación en la supervivencia de los pacientes.
Reconocimientos
Los autores desean agradecer a los pacientes que dieron su consentimiento para proporcionar material de tumor que se se utilizó en este estudio.