Extracto
glicosilación aberrante es una característica común de muchos tumores malignos, incluyendo el cáncer colorrectal (CRC ). Alrededor del 15% de CRC muestran el fenotipo de inestabilidad de microsatélites (MSI) que se asocia con una alta frecuencia de mutaciones de cambio de bialélicos en la A10 codificación de microsatélites mononucleótido de la
factor de crecimiento transformante beta 2 del receptor
(
) de genes. Si y cómo deteriorada TGFBR2 señalización en las células MSI CRC afecta el patrón de glicanos de superficie celular es en gran parte inexplorado. En este caso, hemos utilizado el MSI línea celular de carcinoma de colon HCT116 TGFBR2 deficientes como un sistema modelo. clones estables que confieren doxiciclina (DOX) la expresión inducible de una sola copia de tipo salvaje
TGFBR2
transgén fueron generados por el intercambio de casete recombinasa mediada (RMCE). En dos clones independientes, se demostró la expresión dox-inducible de la proteína de tipo salvaje TGFBR2 y reconstitución de su función de señalización. experimentos de marcaje metabólico utilizando el precursor de ácido siálico tritiada
N
acetil-D-manosamina (ManNAc) revelaron una disminución significativa (~ 30%) de su incorporación en sialoglicoproteínas recién sintetizados de una manera TGFBR2-dependiente. En particular, hemos detectado una disminución significativa de sialilado SS1-integrina sobre reconstituido señalización TGFBR2 que no influyó en el recambio proteico SS1-integrina. Notablemente, TGFBR2 reconstitución no afectó a los niveles de transcripción de cualquiera de las sialiltransferasas humanas conocidas cuando se examina por análisis en tiempo real de RT-PCR. Estos resultados sugieren que la señalización reconstituyó TGFBR2 en un sistema de modelo de línea celular isogénica MSI puede modular la sialilación de las proteínas de la superficie celular como ß1-integrina. Por otra parte, nuestro modelo de sistema será adecuado para descubrir los mecanismos moleculares subyacentes de tumores MSI alterado glicobiológica
Visto:. Lee J, Ballikaya S, K Schönig, bola de CR, Glimm H, Kopitz J, et al. (2013) factor de crecimiento transformante beta del receptor 2 (TGFBR2) Cambios en el Sialylation inestable línea celular de microsatélites (MSI) del cáncer colorrectal HCT116. PLoS ONE 8 (2): e57074. doi: 10.1371 /journal.pone.0057074
Editor: Chih-Hsin Tang, de la Universidad Médica de China, Taiwán
Recibido: 17 Noviembre 2012; Aceptado 17 de enero de 2013; Publicado: 27 Febrero 2013
Copyright: © 2013 Lee et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. El apoyo financiero fue proporcionada por la DFG (GE592 /6-1) a JK y J. G. y la DFG (de KFO 227) para C.R.B. y HG Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Cerca del 15% de los tumores colorrectales hereditarios y esporádicos mostrar la inestabilidad de microsatélites de alta frecuencia (en adelante denominado MSI) fenotipo. MSI se manifiesta como variaciones de longitud de numerosas secuencias repetitivas cortas (microsatélites) causadas por la pérdida de la función normal de reparación de genes de ADN (MMR) en estas células tumorales. Si MSI afecta microsatélites de codificación de genes que se expresan las mutaciones de cambio resultantes conducen a la terminación de la traducción prematura y deterioro de la función de las proteínas [1] - [3]. Un gran número de genes que albergan los microsatélites en sus regiones codificantes se han identificado y se encontró que con frecuencia afectados por mutaciones de cambio de MSI tumores colorrectales [4] - [7]. Las mutaciones en un número limitado de estos genes se cree que conducir MSI tumorigénesis.
TGFBR2
es uno de los más interesantes genes diana MSI porque es parte de una vía de señalización clave en las células epiteliales del colon y se encontró que ser inactivado a alta frecuencia por mutaciones de cambio de bialélicos en MSI tumores colorrectales [8]. TGFBR2 es una serina-treonina quinasa transmembrana que es capaz de reprimir la proliferación y también induce la apoptosis y la diferenciación provocada por factor de crecimiento transformante beta (TGF-ß) de activación [9] - [11]. Tras la unión del ligando TGF-SS1 la formación de un complejo receptor hetero-tetrámero compuesto de tipo 1 (TGFBR1) y tipo 2 receptores (TGFBR2) se inicia y proteínas aguas abajo tales como SMAD2 y SMAD3 convierten fosforilados [10], [12] . Estas proteínas Smad fosforilada luego asocian con SMAD4 y sobre la translocación a la transcripción directa núcleo de diferentes genes diana como
SMAD7
[13] o
SERPINE
[14].
Muchos proteínas, especialmente proteínas de la superficie celular, están glicosiladas y requieren modificaciones de glicano con el fin de conferir la función normal en la comunicación celular, reconocimiento y adhesión. Por otra parte, alterado de glucosilación de la superficie celular se ha implicado en la tumorigénesis y metástasis [15] - [17]. En el cáncer de colon, se encontró la expresión del ARNm de varias glicosiltransferasas que aumentarse en comparación con los de colon mucosa normal [18], [19] correspondiente. Además, fucosilación de proteínas de superficie celular también se ha implicado en el cáncer [20]. Fucosiltransferasas están asociados con la formación de antígenos tumorales como sialil-Le
xy -Le
a [21]. El ácido siálico es un componente clave de las glicoproteínas y se ha correlacionado con la metástasis [22]. Different posicionamiento de ácido siálico en la superficie celular de plomo para enmascarar o desenmascaramiento de sacáridos específicos que son importantes para la metástasis [23]. Se ha demostrado, que el ácido siálico se correlaciona con
in vivo
capacidad tumoral en la línea celular HCT116 CRC [24].
SS1-integrina es un miembro de una gran familia de proteínas de las proteínas de adhesión conocida a ser altamente sialilada. Las integrinas son glicoproteínas que forman complejos hetero-dimérica de alfa y beta subunidades que confieren diferentes afinidades de ligandos. Desde la señalización por integrinas está involucrado en varios procesos celulares clave como la adhesión focal y la motilidad, alteración de la señalización de integrina se ha implicado en la metástasis del cáncer [25], [26]. Se ha informado de que la unión de la lectina SNA a sialilada ß1-integrina se aumenta en el tejido tumoral de colon en comparación con el epitelio normal de colon [27]. Por otra parte, se demostró que de-sialilación de ß1-integrina para estimular su unión a las glicoproteínas de la matriz extracelular [28], [29].
Aunque señalización TGFBR2 está implicado en la comunicación célula-célula, la adhesión celular y la célula Migración el papel de esta vía en el patrón de glicosilación de las proteínas de la superficie celular es en gran parte inexplorado. La evidencia experimental sugiere una posible relación entre los genes diana mutados MSI y el patrón de glicosilación en la superficie celular [30]. En el presente estudio, se utilizó el reconstituido-TGFBR2 MSI línea celular de cáncer colorrectal HCT116 como un sistema modelo para analizar las alteraciones TGFBR2-dependientes en la glicosilación de proteínas. Se detectó una disminución de la sialilación global de las proteínas recién sintetizadas por lo tanto reflejan el aumento inversamente sialilación observada en los tumores primarios de colon. En particular, hemos identificado la señalización TGFBR2 como modulador de los niveles de sialilación de SS1-integrina.
Materiales y Métodos
Los plásmidos
S2F-cLM2CG-FRT3 [31] contiene una unidad de transcripción bidireccional controlada por tet para la regulación simultánea de los dos genes informadores luciérnaga
luciferasa Opiniones y proteína fluorescente roja
mCherry.
casete de expresión está flanqueado por dos sitios de reconocimiento de FLP-hetero-específica, un F3 mutado y un sitio de tipo salvaje F [32]. Para el montaje retroviral, se utilizaron los vectores pVPack-GP y pVPack-VSV-G (Stratagene). La recombinación estaba mediada por la enzima Flpo-recombinasa que está codificada por el plásmido pCAGGS-Flpo-IRES-Puro obtuvo de Michael Hahn (DKFZ, Heidelberg). El plásmido pE11.F3.HygTK.F [31] que codifica una proteína de la fosfotransferasa de higromicina B-timidina quinasa (HygTK) de traslación de fusión se utiliza para la selección de antibióticos y la generación de la línea celular HCT116 maestro-HygTK. El vector retroviral S2F-cLM2CG-FRT3-TGFBR2 fue generado mediante amplificación por PCR de la de tipo salvaje
TGFBR2
cDNA a partir del plásmido pcDNA3.1 expresión /His-TGFBR2 [30] usando cebadores que llevar a
EcoRI
o
NotI gratis (NEB) sitios de restricción (Tabla S1) y la sustitución de la
EcoRI
/
NotI mCherry
fragmento de S2F-cLM2CG-FRT3. Verificación de la inserción correcta y la secuencia del tipo salvaje
TGFBR2
gen se confirmó por análisis de secuencia de ADN.
Líneas Celulares
Todas las líneas celulares se cultivaron en DMEM (PAA) suplementado con inactivado por calor 10% FBS Gold (PAA) y 100 U /ml de penicilina y 100 mg /ml de estreptomicina (PAA) utilizando condiciones estándar. El HCT116 línea celular parental CRC se ha comprado de Colección Europea de Cultivos Celulares (ECACC). Esta línea celular MMR-deficiencia exhibe el fenotipo MSI y es refractario a la señalización mediada por TGF-ß, debido a mutaciones de cambio de bialélicos en el microsatélite de codificación de la A10 endógena de
TGFBR2
gen. El AWE17 HCT116 (HCT116-Tet-On) línea celular es un derivado transfectadas de forma estable de la línea celular HCT116 los padres que confiere expresión constitutiva del transactivador transcripcional inverso (rtTA) y la proteína EGFP [33]. La línea celular HepG2 se utilizó como un control positivo para la señalización SMAD2. Se obtuvieron células 293T de la ATCC. Para los experimentos de señalización, se mueren de inanición las células durante 17 h en presencia y ausencia de 1 mg /ml dox (Sigma) y posteriormente se incubaron con 10 ng /ml TGF-ß1 recombinante (Señalización Celular) durante 1 h. Los experimentos de transfección se llevaron a cabo usando el reactivo de transfección Fugene HD de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Roche). la selección de antibióticos se ha realizado mediante la higromicina B (Hyg, 100 g /ml, PAA), puromicina (1,5 mg /ml, Sigma) y ganciclovir (Gan, 40 mM, Roche) para los pasos que se indican.
Generación de Las células HCT116-TGFBR2
Hemos aplicado un enfoque basado retroviral descrito anteriormente [31]. En resumen, 10
6 293T células fueron co-transfectadas con 3 proviral plásmidos [34], [35]. 10
5 HCT116-Tet-On células (~ 30% de confluencia) se infectaron a una MOI de 0,01 y 0,05 para asegurar la integración del virus de copia única. Transducidas con éxito HCT116-Tet-On células fueron inducidas con células de 0,2 g /ml dox y mCherry-positivos fueron seleccionados y aislados por FACS (On-Off-On). Se seleccionaron las células mCherry-positivos individuales para la expansión clonal (HCT116-mCherry). En la primera etapa de recombinación (RMCE), 5 × 10
5 células HCT116-mCherry fueron co-transfectadas en placas de 6 pocillos con 2 mg pE11.F3.HygTK.F plásmido que porta un casete de expresión Hyg-TK flanqueado por dos sitios de recombinación (F3 /F) y 2 g pCAGGS-Flpo-IRES-Puro (Figura 1A). Los clones resultantes de células primarios HCT116-HygTK, que son resistentes y sensibles a Gan (Hyg
r, Gan
s) Hyg, se sometieron a una segunda RMCE resultando en clones de HCT116-TGFBR2 que confieren expresión dox-inducible de TGFBR2 y luciferasa simultáneamente (Figura 1A). La cuantificación de los niveles de expresión inducible por dox se determinaron mediante ensayos de luciferasa.
(A) Representación esquemática del intercambio de casete de recombinación mediada (RMCE). transducción retroviral se realizó utilizando el vector proviral S2F-cLM2CG-FRT3 que contiene un promotor inducible por dox bidireccional (P
tetbi) que permite la expresión simultánea de dos genes marcadores (
luciferasa
y
mCherry
) en los clones de HCT116-mCherry. Los casetes de expresión están flanqueadas por mutante (F3) y sitios diana de recombinasa Flp-de tipo salvaje (F) que permiten el intercambio de casete dirigidos a través de Flpo-recombinasa. señal de empaquetamiento retroviral (Ψ
+) y repeticiones terminales largas (LTR) están indicados. (B) Caracterización de los sitios de integración virales por nrLAM-PCR y secuenciación. En la parte superior, los sitios de integración-clon específico y loci del genoma afectada (marco de lectura abierta (ORF);
aldehído deshidrogenasa familia 1 miembro L1 gratis (
ALDH1L1
)) se representan. En la parte inferior, 5 'y 3' se muestran las secuencias virales LTR de ADN (letra pequeña), así como las que flanquean secuencias de ADN genómico (letras mayúsculas).
PCR y secuenciación
PCR estándar se ha realizado mediante el CALIENTE FIREPol ADN polimerasa (Solis Biodyne) con las siguientes condiciones de ciclos: desnaturalización inicial de 95 ° C 15 min; 35 ciclos de 95 ° C de desnaturalización durante 30 s, 60 ° C recocido durante 30 s, 72 ° C alargamiento durante 1 min y una etapa de elongación final a 72 ° C durante 2 min. La secuenciación de ADN se realizó usando el kit de secuenciación BigDye Terminator v1.1 (Invitrogen). El análisis se llevó a cabo en un analizador genético ABI3100 (Applied Biosystems).
Linear amplificación mediada (LAM) -PCR
ADN genómico fue extraído de las líneas celulares de acuerdo con el protocolo del fabricante utilizando DNeasy Blood & amp; Tissue Kit (Qiagen). No restrictiva (nr) LAM-PCR se realizó como se describe anteriormente [36]. En resumen, 1 g de gDNA derivado de los clones de células transducidas se utilizó para la amplificación lineal de las uniones genoma del vector con cebador biotinilado (Tabla S1). Después del enriquecimiento de los fragmentos amplificados mediante perlas magnéticas, se generó la segunda cadena de ADN. Después de la ligación de un oligonucleótido conocido a la parte desconocida de los amplicones, se realizaron dos PCR anidadas exponenciales. Para más preparación de las muestras se añadieron adaptadores a ambos extremos de los amplicones PCR mediante una exponencial adicional para permitir la amplificación y secuenciación Roche 454-específico. Para la secuenciación paralela de diferentes muestras se utilizó un código de barras 6-10 pb. 40 ng de ADN se amplificó utilizando el siguiente programa de PCR: desnaturalización inicial durante 120 s a 95 ° C; 12 ciclos a 95 ° C durante 45 s, 58ºC durante 45 s y 72ºC durante 60 s; elongación final de 300 s a 72 ° C. amplificación de secuencias LAM-PCR primas fueron separados de acuerdo al código de barras introducido, más recortado y se alinea con la secuencia del genoma humano utilizando Blat (Asamblea febrero de 2009) [37].
ensayo de luciferasa
La actividad de luciferasa se midió por el sistema de ensayo de luciferasa (Promega) por duplicado de acuerdo con las instrucciones del fabricante y se normalizaron a la concentración de proteína se determina por el ensayo de Bradford (BioRad).
análisis de transferencia Western
los sedimentos celulares se se volvieron a suspender en tampón RIPA (50 mM Tris-HCl pH 7,4, NaCl 150 mM, 1% de Triton X-100, 1% de sodio-desoxicolato, 0,1% SDS, CaCl 0,1 mM
2 y MgCl 0,01 mM
2) . Después de la sonicación, la incubación (1 h, 4 ° C) y centrifugación (12.000 g, 20 min, 4 ° C) la concentración de proteína del lisado se midió por el ensayo de Bradford. Para inmunotransferencia, 50 g de proteína se separó en 4-12% Bis-Tris geles (NuPAGE, Invitrogen) y a electrotransferencia sobre una membrana de nitrocelulosa. Después de bloquear la membrana durante 30 min a temperatura ambiente (RT) en 5% de leche descremada /TBST (20 mM Tris-HCl pH 7,5, 0,5 M NaCl y Tween-20 0,1%), los siguientes anticuerpos primarios se utilizaron en solución de bloqueo: ratón anti-TGFBR2 (sc-17799; Santa Cruz; 1:500, 4 ° C, durante la noche); ratón anti-ß-actina (MP Biomedicals; 1:30,000, RT, 1 H); conejo anti-fosfato Smad2 (Ser465 /467; Señalización Celular; 1:1000, 4 ° C, durante la noche); conejo anti-SMAD2 (86F7, Señalización Celular; 1:1000, 4 ° C, durante la noche). Después de varios pasos de lavado (10 minutos cada uno a TA) en TBST, las transferencias se incubaron con el secundario ovejas anticuerpos anti-ratón-IgG HRP (1:5000; GE-Healthcare) y de cabra anti-conejo-IgG HRP (1:2500; Promega) durante 1 h a TA. Después de tres etapas de lavado (10 min cada uno a temperatura ambiente) en TBST, se detectaron señales a través de Western ECL Plus relámpago (PerkinElmer).
Real-Time RT-PCR
1 g de ARN total fue aislada con el Kit RNeasy (Qiagen) y se transcribió inversamente usando cebadores oligo-dT y la transcriptasa inversa Superscript II de acuerdo con el protocolo del fabricante (Invitrogen). Por tiempo real transcripción inversa (RT) -PCR experimentos, se utilizaron cebadores específicos (Tabla S1 y S2) y PowerSYBR verde Master Mix (Applied Biosystems). Triplicados de diferentes muestras de cDNA (-DOX frente + DOX) fueron analizados en el termo-ciclador StepOnePlus (Applied Biosystems) con el siguiente programa: 95 ° C durante 10 min, seguido de 40 ciclos de 95 ° C durante 15 s y 60 ° C durante 1 min. Los datos se analizaron por v2.1 Software StepOne (Applied Biosystems). La expresión génica se normalizó a la expresión de los genes de referencia
GAPDH
y
sintasa hidroximetilbilano gratis (
HMBS
).
Ensayo de proliferación
ensayos de proliferación de MTS se realizaron por triplicado con el kit de CellTiter 96 acuoso (Promega) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Incorporación de marcado radiactivo monosacáridos
5-10 × 10
4 células /pocillo se sembraron por triplicado en una placa de 6 pocillos. Después de 24 h, las células se volvieron a alimentar con 2 ml de nuevos medios de comunicación que contiene 0.185 MBq de la respectiva
marcada con 3H sacárido (
3H-ManNAc (
N CD - [manosamina-6-
3H]), [185 a 370 GBq /mmol] o
3H-L-fucosa (L-6-
3H), [1,48 a 2,22 TBq /mmol], American Radiolabeled Chemicals, Inc.) y 10 ml TGF-ß1 ng /. Las células fueron cultivadas en presencia o ausencia de 0,5 mg /ml dox para obtener una confluencia del 60-80%. Después de 72 h, las células se lavaron 3 veces con PBS y se rasparon. Las células se centrifugaron 5 min a 1000 g a temperatura ambiente y se lavaron con PBS. El sedimento celular se solubilizó en 400 l de NaOH 0,2 N para 1 h a 56 ° C. La concentración de proteína se determinó por el ensayo de Lowry. Se añadió 1 g de BSA y 400 l de TCA al 10% para precipitar las proteínas por centrifugación (10 min, 12.000 g, RT) y para eliminar los sacáridos marcados no incorporados. Después, el sedimento se resuspendió en 400 l de NaOH 1 N y se neutralizó por 200 l de ácido 2,5 N acético y se mezcla con 10 ml de cóctel de centelleo (Ultima Gold; PerkinElmer). Las muestras se contaron usando un analizador de centelleo líquido (TRI-CARB 2900TR; Packard) y se realizaron mediciones dpm con la corrección de apagado automático de la aplicación del índice espectral de la transformada /Control de Eficiencia automática estándar externo método (TSIE /AEC). Los resultados se expresaron como dpm y normalizado a la cantidad de proteína (mg).
marcaje radioactivo y ß1-integrina inmunoprecipitación (IP)
Para el marcaje dual utilizando
35S-L-metionina [37 TBq /mmol] (American Radiolabeled Chemicals, Inc.) y
3H-ManNAc, 1-2 x 10
6 células se sembraron por triplicado en placas de 10 cm. Después de 24 h, el medio se reemplazó por 5 ml de nuevos medios que contienen 1,11 MBq de
3H-ManNAc, 0,37 MBq de
35S-L-metionina y 10 ng /ml TGF-ß1. Las células fueron cultivadas en presencia o ausencia de 0,5 mg /ml dox. Después de 72 h, las células se lavaron 3 veces con PBS y se rasparon. Las células se centrifugaron 5 min a 1000 g a 4 ° C y se lavaron con PBS. El sedimento se resuspendió en 150 l de tampón RIPA. Las células se sometieron a ultrasonidos y se incubaron 1 h a 4 ° C mientras se gira. Después de centrifugación a 4 ° C durante 30 min a 12.000 g se utilizó el lisado resultante para determinar la concentración de proteína mediante el ensayo de Bradford. Para IP ß1-integrina, 1,6 mg de lisado se incubó con 1,7 mg de anticuerpo ß1-integrina (P5D2 de DSHB, Iowa) en un volumen de 300 l durante 2 horas a 4 ° C. Como control para la unión no específica a las perlas, cada clon celular se incubó sin el anticuerpo en presencia o ausencia de dox y los recuentos se restaron de los resultados. 25 l de proteína A /G agarosa (Oncogene) se lavaron 3 veces con 1 ml de tampón RIPA y después se incubó con el lisado y el anticuerpo durante la noche mediante la rotación a 4 ° C. Las perlas se lavaron 5 veces con 500 l tampón RIPA y se eluyeron con 2 x 200 l de tampón 1x muestra de proteína (106 mM Tris-HCl, la base de 141 mM Tris, 2% SDS, 10% de glicerol, EDTA 0,51 mM) a 99 ° C durante 5 min. Las muestras se mezclaron con 10 ml de cóctel de centelleo y se contaron mediante un analizador de centelleo Luquid la aplicación del método TSIE /AEC. Los resultados se expresaron como dpm. Como control para la unión no específica de la elución de la IP se analizó mediante SDS-PAGE y posterior teñido con SYPRO-Ruby (Invitrogen). En paralelo, las bandas correspondientes se detectaron por transferencia de Western usando un anticuerpo (Señalización Celular) ß1-integrina (datos no mostrados). Para el experimento de pulso y persecución, las células se sembraron y se trató como se describe anteriormente, pulsadas durante 72 h con 1,11 MBq
35S-L-metionina /5 ml de medio nuevo y después se recogieron en 5 puntos de tiempo diferentes (0h, 4h, 8h , 16h, 24h, persecución). Posteriormente, las células se lisaron como se describió anteriormente. 1,5 mg lisado se incubó con 1,3 mg de anticuerpo SS1-integrina en un volumen total de 300 l de tampón RIPA y se hace girar durante 2 horas a 4 ° C. Después de la adición de la proteína A /G agarosa, las muestras se procesaron tal como se ha descrito anteriormente.
Resultados
Generación de clones de HCT116-mCherry inducible por doxiciclina
Con el fin de investigar TGFBR2- cambios dependientes de la glicosilación de proteínas, hemos tratado de generar un sistema modelo de línea celular de cáncer colorrectal MSI que permite la reconstitución de expresión inducible TGFBR2 en un fondo isogénica. En general, este sistema refleja inversamente la situación de los tumores primarios colorrectales MSI que han perdido la expresión TGFBR2 durante la progresión del tumor. Como primer paso, la MSI línea celular HCT116-Tet-On que expresa constitutivamente la dox reguladas rtTA [33] se modificó genéticamente mediante transducción con retrovirus de auto-inactivación que expresan luciferasa controlado-tet y mCherry (S2F-cLM2CG-FRT3) a baja multiplicidad de infección (MOI) para favorecer la integración de copia única. El análisis cuantitativo de clones estables identificaron dos clones HCT116-mCherry (# 5 y#22) con 40 a 70 veces de inducción dox regulado de expresión del gen informador como se determina por ensayos de luciferasa. Identificación y caracterización molecular de los sitios de integración retroviral por nrLAM-PCR y la secuenciación confirmaron que sólo una única copia se había insertado. Integración de la
luciferasa-mCherry
casete de expresión fue localizado en los cromosomas 1 (
C1orf159) Opiniones de clon#5 y en el cromosoma 5 (
ALDH1L1
) para el clon#22, respectivamente (Figura 1B). Más importante aún, los casetes de expresión integrados no alteraron el crecimiento de clones de HCT116-mCherry cuando se compara con su HCT116-Tet-On progenitores. Con el fin de dirigir la inserción y la expresión dox-inducible de la
TGFBR2
transgén exactamente en estos sitios genómicos, se siguió la estrategia de dos pasos (Figura 1A). En una primera etapa de recombinación, el
luciferasa-mCherry
casete fue sustituido por un casete de expresión que codifica la proteína de fusión Hyg-TK generando así dos líneas de células primarios HCT116-HygTK#5 y#22 que permiten la integración de cualquier gen de interés en estos dos loci genómicos. De acuerdo con ello, reemplazamos el
HygTK
casete de expresión en un segundo RMCE por un
luciferasa-TGFBR2
casete de expresión que resulta en HCT116-TGFBR2 clones#5 y#22 que se caracteriza y se utiliza para los análisis posteriores .
Caracterización de clones de HCT116-TGFBR2
a continuación, analizamos estas células HCT116-TGFBR2 con más detalle. análisis de luciferasa reveló que los niveles de inducción del gen informador, obtenidas originalmente en las células HCT116-mCherry (40-70 veces), también se detectaron en las células HCT116-TGFBR2. Esto excluye a todos los efectos de la estrategia basada en RMCE o el casete de expresión utilizado en la inducibilidad de nuestro sistema de modelo. Por otra parte, cuando se utilizó cebadores transcripción específicos, en tiempo real RT-PCR análisis para comparar la expresión del mutante A9 endógena de
TGFBR2 Versión taquigráfica, la A10 transgénico
TGFBR2 Versión taquigráfica de tipo salvaje o ambas transcripciones tras la exposición dox,
no se observó ningún cambio en la endógena TGFBR2
nivel de transcripción. En lugar de ello, el tratamiento dox condujo a una fuerte inducción de la transgénico
TGFBR2
wildtype transcripción (Figura 2A). Para excluir, que el reconstituido
TGFBR2
gen de tipo salvaje podría haber adquirido las mutaciones que inactivan similares debido a la falta de la función del ADN MMR en estas células, secuenciado transcripción específicos de
TGFBR2
ADNc y se identificaron exclusivamente A9 repeticiones de tipo salvaje o mutantes A10 en la endógeno o transgénico
TGFBR2
transcripciones, respectivamente. De este modo se pudo excluir la inactivación mutacional del reconstituido
TGFBR2
transgén en estos clones de HCT116-TGFBR2 MSI y MMR-deficientes. Además de estos análisis de transcripción, también examinamos la capacidad de inducción y la funcionalidad de la proteína TGFBR2 por inmunotransferencia. En ausencia de DOX, no se detectó proteína TGFBR2 mientras que en presencia de dox, se observaron bandas específicas de proteínas TGFBR2 de la gama de tamaño esperado (75 kDa). Cuando se realizó el análisis de curso de tiempo, los niveles de proteína TGFBR2 alcanzaron un pico en las 6 h, pero disminuyeron posteriormente dentro de 24 a 48 h (Figura 2B). Para demostración de la funcionalidad de la proteína TGFBR2 reconstituido, se investigó su capacidad de señalización. De acuerdo con ello, la fosforilación de Smad2, la primera efector aguas abajo de la señalización de TGFBR2, se examinó por análisis de transferencia Western (Figura 3A). En la ausencia de expresión TGFBR2 (-DOX), el tratamiento de TGF-ß 1 indujo un nivel basal de pSmad2 tanto en las células HCT116-Tet-On y HCT116-TGFBR2 parentales. Sin embargo, cuando la expresión se indujo TGFBR2 (+ DOX) en presencia de su ligando, TGF-ß1, un aumento significativo de los niveles de pSmad2 mucho más allá se observó el nivel basal. Por otra parte, analizamos si éstos
TGFBR2
células -reconstituted son capaces de regular la transcripción de varios genes conocidos objetivo TGFBR2 como
SMAD7
y
SERPINE
. En tiempo real RT-PCR análisis reveló dox que dependen
SMAD7
y
SERPINE
regulación al alza y así confirmado la actividad normal de señalización (Figura 3B). Además, la proliferación se reduce cuando la señalización de TGF-ß1 se provoca en las células HCT116-TGFBR2 tras el tratamiento dox y TGF-ß1 comparación con las células HCT116-TGFBR2 expuestas a TGF-ß1 en ausencia de dox. Sin embargo, la proliferación no se vio afectado entre no inducido (-DOX) e inducida (+ DOX) parental HCT116-Tet-en células o HCT116-TGFBR2 - células en ausencia de ligando TGF-ß1 (Figura S1A) (/+ DOX). Ninguna de estas células mostraron alteraciones morfológicas (Figura S1B). En general, estos resultados demuestran que tanto los clones TGFBR2 expresan una proteína TGFBR2 funcionalmente intacto y muestran la señalización mediada por TGFBR2 adecuada.
(A) en tiempo real el análisis RT-PCR de mutante endógeno (A9), de tipo salvaje transgénico (A10 ) o ambos
se muestran TGFBR2
transcripciones en ausencia y presencia de dox (1 mg /ml). Los resultados representan la media de tres observaciones independientes ± S.D.. (B) Análisis de transferencia Western, lo que demuestra la presencia de (/ml 1 g) expresión TGFBR2 dox-inducible de una manera dependiente del tiempo. ß-actina sirvió como control de carga. Los datos se muestran para HCT116-TGFBR2 clon#5, pero también se aplican a el clon#22 (datos no presentados).
(A) La fosforilación de Smad2 (pSmad2) se detectó mediante análisis de transferencia Western. El tratamiento con DOX (1 mg /ml) y TGF-ß1 (10 ng /ml) muestra niveles más altos de pSmad2 en comparación con las células cultivadas en ausencia de dox. La línea celular HCT116 parental sirvió como control negativo, mientras que se utilizaron células HepG2 sensible TGF-SS1 como control positivo. SMAD2 total se ha usado como control de carga. (B) Objetivo de la transcripción del gen de la señalización TGFBR2. En tiempo real RT-PCR experimentos revelaron dox que dependen
SMAD7
y
SERPINE
regulación al alza. Los datos se muestran para HCT116-TGFBR2 clon#5, pero también se aplican a el clon#22 (datos no presentados). Los valores representan las medias de tres experimentos independientes ± SD
TGFBR2 dependiente de glicanos Alteraciones
Dado que no detectó ningún cambio en los niveles de estado estacionario de las proteínas de la superficie celular por FACS-lectina análisis (Figura S2) y lectina-Western Blot (Figura S3), se llevaron a cabo experimentos de marcaje radiactivo utilizando dos
marcada con 3H monosacáridos independientes, ManNAc y L-fucosa. Con este enfoque nos centramos nuestras mediciones en las glicoproteínas de nueva síntesis. En los experimentos iniciales, se examinaron diferentes períodos de tiempo (24h, 48h y 72h). La incorporación de
3H-ManNAc, un precursor de ácido siálico, aumentó con el tiempo con un pico a aproximadamente 72 h. Tras la exposición DOX y la adición de TGF-beta1 durante 72 h, una reducción significativa de incorporarse
3H-ManNAc se produjo en ambos clones TGFBR2 pero no en la línea de células Tet-On parental (Figura 4A). Por lo tanto, se analizaron los 20 sialiltransferasas conocidos y dos sialidasas (Neu1 y NEU3), en tiempo real RT-PCR a las 24h, 48h y 72h después de la inducción (Tabla S2). Sin embargo, no fuimos capaces de detectar cualquier cambio en los niveles de expresión de ARNm (Figura S4). Re-expresión de TGFBR2 condujo a una disminución significativa en fucosilación de proteínas en uno de los dos clones mediante
3H-L-fucosa (Figura 4B). Estos resultados sugieren que TGFBR2 regula la sialilación de
de novo
proteínas.
experimentos de marcaje radiactivo se realizaron en presencia y ausencia de DOX (0,5 mg /ml) y por la exposición a TGF-ß1 ( 10 ng /ml) durante 72 h. (A) Incubación con
3H-ManNAc resultó en una reducción significativa de ManNAc incorporado en el TGFBR2 clones#5 y#22, pero no en la línea celular HCT116-Tet-On parental. (B) Incorporación de
3H-L-fucosa se redujo ligeramente en presencia de dox en ambos clones TGFBR2 en contraste con HCT116-Tet-On células. Los valores representan la media de tres experimentos independientes ± SD
Expresión ß1-integrina y sialilación
Dado que se sabe que ß1-integrina es una proteína altamente sialilada cuya expresión está alterada por TGF -ß1 [38], el próximo examinó si sialilación SS1-integrina puede verse afectado por Tgfbr2 expresión y señalización. Sobre la base de nuestra observación de que TGFBR2 parece modular única sialilación de
de novo
proteínas, que llevan a cabo experimentos de doble etiquetado radiactivo (
3H-ManNAc y
35S-L-metionina) para determinar la incorporación de ácido siálico y como control de la síntesis de ß1-integrina en las células inducidas por TGFBR2 (Figura 5). Después del marcaje durante 72 h, se recogieron las células y ß1-integrina fue inmunoprecipitado. Mientras que la señalización TGFBR2 reconstituido dio lugar a una mayor expresión de la integrina ß1-mRNA (2 veces) (no mostrado) y de la proteína como se determina por marcado metabólico (Figura 5A), la incorporación de ManNAc mostró una disminución TGFBR2-dependiente (Figura 5B). Al normalizar la incorporación de ácido siálico a SS1-integrina síntesis el efecto de TGFBR2 en ß1-integrina puede ilustrarse más sorprendentemente, que se muestra en la Figura 5C. Con el fin de determinar si el efecto de TGFBR2 sobre la expresión de la integrina ß1-es debido a un efecto de sialilación alterado en la estabilidad ß1-integrina, se realizó un experimento de pulso y persecución. Como se indica en la Figura 5D la vida media de la proteína ß1-integrina fue de alrededor de 16 h y esta tasa de rotación se mantuvo sin cambios en la presencia o ausencia de expresión TGFBR2. En general, estos datos sugieren que la señalización TGFBR2 regula la sialilación de
proteínas de novo
en general y de la ES1-integrina, en particular, sin afectar a su volumen de negocios.
(A-C) de doble etiquetado de las células con
3H-ManNAc y
35S-L-metionina se realizó en presencia y ausencia de DOX (0,5 mg /ml) y en presencia de TGF-ß1 (10 ng /ml) durante 72 h. FSC, dispersión frontal;