Extracto
factor de crecimiento transformante β1 (TGF-β1) y -β2 se correlacionan con un peor pronóstico en el cáncer gástrico (CG), que actúan tanto en el tumor y las células inmunes. Sin embargo, sus expresiones en el precáncer y de células tumorales interacciones con células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) no están claros. Los niveles de proteína de TGF-β1 y -β2 se analizaron por inmunohistoquímica y los correspondientes niveles de ARNm se determinaron mediante la reacción cuantitativa en cadena de polimerasa en tiempo real en 93 muestras quirúrgicas y de biopsia. La concentración sérica de TGF-β se detectó mediante ensayos inmunoenzimáticos. líneas de células AGS y MKN45 fueron directa o indirectamente cocultured con PBMCs
in vitro
. TGF-β y las moléculas de Smad se detectaron después de cocultivos y los crecimientos de células GC y PBMCs se evaluaron mediante el ensayo de proliferación celular. Los resultados mostraron se detectó tinción positiva para el TGF-β1 en el 20% de las muestras de control, el 52,3% de las lesiones precancerosas, el 59,1% de GC temprana y el 66,7% de las muestras de GC avanzada, correlacionada con la progresión de la lesión (χ
2 = 9,487,
P
= 0,002). Todos los tejidos fueron positivos para TGF-β2. los niveles de ARNm de TGF-β1 se incrementaron en cánceres avanzados, mientras que TGF-β2 aumentó antes. los niveles de ARNm de TGF-β1 fueron más altas en el tumor que en peritumoral, que positivamente correlacionado con Smad2 y Smad7. Los niveles séricos de TGF-ß fueron significativamente mayores en los pacientes con cáncer en etapas tempranas y avanzadas en comparación con los controles (TGF-β1:50.08 ± 4,38 y 45,76 ± 5,00 vs 27,78 ± 6,11 ng /ml; TGF-β2:133.61 ± 21.90 y 111.34 ± 15.76 vs. 59,41 ± 15,42 ng /ml, tanto
P
& lt; 0,05). Los niveles de TGF-β1 mRNA y la secreción de citocinas fueron más altos en las células de GC después de cocultivo directo en comparación con la cultura indirecta. TGF-β1 disminuyó y TGF-β2 se incrementó en PBMCs después de cocultivos. Por otra parte, el TGF-β1 inhibe la viabilidad de PBMCs pero no las células cancerosas. En conjunto, la transformación neoplásica puede ser un evento temprano que implica el aumento de TGF-β1 en el medio ambiente en general y local. la producción de TGF-β1 es promovido por la interacción directa entre las células PBMCs y GC, lo que podría facilitar el desarrollo del cáncer
Visto: Ma. GF, Miao Q, Zeng XQ, Luo TC, Ma LL, Liu YM, et al . (2013) factor de crecimiento transformante-β1 y -β2 en precáncer y el cáncer gástrico y roles en las interacciones tumor de células con células mononucleares de sangre periférica
in vitro
. PLoS ONE 8 (1): e54249. doi: 10.1371 /journal.pone.0054249
Editor: Noriko Gotoh, Instituto de Ciencias Médicas, Universidad de Tokio, Japón
Recibido: 16 Agosto, 2012; Aceptado: December 10, 2012; Publicado: 14 Enero 2013
Derechos de Autor © 2013 Ma et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo recibió el apoyo de Xinjiang Uygur Región Autónoma de Ciencia y Tecnología Proyecto de Apoyo (No.200991127) (http://www.kjzj.gov.cn/). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer gástrico (CG) es uno de los cánceres humanos más devastadoras, con una tasa de incidencia más alta se produce en Asia Oriental [1]. Factor de crecimiento transformante β (TGF-beta) desempeña un papel importante en la progresión tumoral maligna [2] - [4]. La familia de TGF-β incluye TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3 y, que presentan acciones diferentes y que no se solapan en vitro [5]. TGF-β1 y TGF-β2 principalmente contribuyen a la progresión del cáncer, actuando tanto en las células tumorales y las células del estroma [6], [7], y una pérdida de la sensibilidad a la inhibición del crecimiento por TGF-β se cree que ocurre en la mayoría de las células cancerosas. Mientras tanto, las células cancerosas adquieren una ventaja por reducción selectiva de la actividad de tumor supresor de TGF-β y el aumento de su actividad oncogénica [8], [9]. Estudios anteriores han demostrado que el TGF-β1 constituye un factor pronóstico independiente correlacionado con el estadio del tumor y peor pronóstico [5], 10,11. Sin embargo, los estados de la proteína TGF-β y el ARNm y su papel en la transformación de las lesiones precancerosas gástrica (PC) para el carcinoma siguen sin estar claros.
TGF-β es una citocina inmunosupresora fuerte producida por las células inmunes y no inmunes , incluyendo las células tumorales [12], [13]. TGF-β puede promover el crecimiento tumoral mediante la inducción de las células epiteliales a someterse epitelial-mesenquimal transición [14]. La inhibición de la señalización de TGF-β se ha informado para prevenir la progresión y la metástasis de ciertos tumores avanzados [15], [16], mientras que TGF-β1 se ha demostrado para reducir la respuesta inmune [17], [18] y estimular la angiogénesis [19 ] en microambiente tumoral. proteínas Smad, como efectores intracelulares de la señalización de TGF-β, se activan por los receptores y se translocan en el núcleo para regular la transcripción [20]. Sin embargo, el Smad-dependencia de la señalización de TGF-β en PC gástrico y cáncer temprano todavía no se comprende totalmente.
TGF-β juega un papel importante en microambiente tumoral, que implican no sólo las interacciones entre las células inmunes y no inmunes , pero también alternancia de parte de la producción de citoquinas. células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) son células inmunes secretoras de citocinas clave, y sus interacciones con las células de cáncer pueden inducir o suprimir las respuestas inmunes específicas de cáncer, incluyendo la inducción de la apoptosis y producción de citocinas, que contribuyen principalmente a la progresión del tumor [12], [21 ], [22]. Las interacciones entre las células cancerosas y PBMCs se presentan en dos formas principales: por contacto directo de célula a célula, y mediante los procedimientos indirectos dependientes de citoquina. Aunque algunos estudios han demostrado que varias células tumorales pueden generar células T reguladoras CD4 + CD25 + de CD4 periférica + células T ingenuas a través de la secreción de TGF-β [23], [24], [25], otros han demostrado que los niveles de la citoquinas de TNF-α, interleucina (IL) -1β, IFN-γ se incrementaron durante la interacción entre las células de cáncer de colon y linfocitos [26]. Sin embargo, los dos métodos de contacto no se compararon en estos estudios, y el principal tipo de interacción por lo tanto sigue siendo desconocido.
En este estudio, se evaluó la proteína y los niveles de ARNm de TGF-β1, TGF-β2, y otras moléculas correlacionadas en especímenes quirúrgicos y endoscópicos de pacientes con lesiones precancerosas y cáncer, para analizar su papel en la carcinogénesis. También células GC cocultivadas con PBMCs para determinar si interactuaron a través dependiente del contacto directo célula a célula o medios indirectos de citoquinas dependiente en un microambiente del tumor simulado.
Materiales y Métodos
Paciente Las muestras
Un total de 93 casos fueron incluidos en este estudio, que comprende 30 muestras resecado quirúrgicamente primarias GC, 43 neoplásica y las muestras cancerosas obtenidas de la disección endoscópica de la submucosa (ESD), y 20 muestras de biopsia de control de aspecto normal-gástrica mucosa en pacientes libres de enfermedades neoplásicas o inflamatorias. Características de los pacientes se analizaron de la siguiente manera: 20 tejidos normales (12 hombres, 8 mujeres; edad media = 45,20 ± 14,01 años, sonaron 28-63 años), 21 PC que incluye principalmente de bajo grado o la neoplasia intraepitelial de alto grado (15 machos , 6 mujeres con una edad media = 65,86 ± 7,81 años, rango 57-79 años), 22 principios de GC (EGC) se define como la invasión de tumor superficial no más de submucosa (14 hombres, 7 mujeres; edad media = 63,50 ± 13,82 años, rango 41-81 años), y 30 PG avanzada (AGC) (21 hombres, 9 mujeres; edad media = 59,48 ± 10,75 años, rango 30-70 años). Todos los pacientes fueron confirmados por examen patológico. El tipo histológico se evaluó de acuerdo con la clasificación de la Organización Mundial de la Salud [27]. Los grupos estudiados fueron demográficamente comparable a la del grupo de control (
P Hotel & gt; 0,05).
Declaración de Ética
Los pacientes que recibieron radioquimioterapia, sufrieron de otros tipos de cáncer, o que tenían antecedentes familiares de GC fueron excluidos del estudio. escrito el consentimiento informado se obtuvo de todos los sujetos. El proyecto fue aprobado por el Comité Ético de Investigación del Hospital Zhongshan [28].
La inmunohistoquímica (IHC)
TGF-beta 1 y TGF-beta 2 niveles de proteína fueron examinados por IHC en 4-μm- parafina secciones gruesas cortadas a partir de un único bloque seleccionado contiene tejidos gástricos neoplásicas y no neoplásicas. Las muestras fueron desparafinados e hidratada de forma rutinaria. Después del bloqueo de la actividad de la peroxidasa endógena, los antígenos se recuperaron mediante calentamiento con ácido etilendiaminotetraacético (pH = 9,0). Los antígenos se detectaron posteriormente mediante un procedimiento de tinción estándar (kit de detección EnVision ™, Dako, CA, EE.UU.). Anticuerpos de conejo policlonales se utilizaron para detectar TGF-β1 y TGF-β2 (todas las diluciones 1:100; Santa Cruz Biotechnology, CA). Para los controles de anticuerpo-negativos, los anticuerpos primarios fueron sustituidos con suero normal de conejo. Los casos se consideran positivos si al menos el 5% de las células displásicas o cáncer muestra tinción citoplásmica para el TGF-β1 o TGF-β2 en 100 × magnificación.
Cuantitativo en tiempo real de reacción en cadena de polimerasa (QRT-PCR)
El ARN total fue aislado de las muestras de biopsia y quirúrgicos, o de células cultivadas, utilizando el reactivo Trizol (Invitrogen, EE.UU.). El ADN complementario se preparó usando oligo
cebadores dT de acuerdo con el protocolo suministrado con el guión Reactivo Primer ™ RT (Takara, Tokio, Japón). Los niveles de expresión de TGF-β1, TGF-β2, Smad2, Smad3, Smad4 y Smad7 mRNAs fueron confirmados por SYBR® verde II QRT-PCR usando Mastercycler ep realplex (Eppendorf, Hamburgo, Alemania) con dos etapas, a 95 ° C para 30 segundos y luego 60 ° C durante 1 min, repetido durante 40 ciclos. Partes alícuotas de los productos de PCR se analizaron por fusión de curvas para probar su especificidad. Todos los cebadores, incluyendo TGF-β1, TGF-β2, Smad2, Smad3, Smad4 y Smad7, se ensayaron para determinar la eficiencia de amplificación y normalizado a los niveles de mRNA de la deshidrogenasa gliceraldehído-3-fosfato (GAPDH) (Tabla S1). Todos los experimentos QRT-PCR se realizaron por el mismo investigador sin conocimiento de los datos clínicos correspondientes.
Células y cultivo celular
líneas de células AGS y MKN45 GC se adquirieron de Shanghai Instituto de Biología Celular , Academia de Ciencias de china (Shanghai, china). Ellos fueron rutinariamente cultivadas en medio DMEM (Gibco, Invitrogen, EE.UU.) suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS), 100 U /ml de penicilina y 100 ug /ml de estreptomicina (Gibco) en 5% de CO
2 incubadora a 37 ° C.
El aislamiento de PBMCs
PBMCs se aislaron de sangre venosa de los pacientes o los controles de GC, como se describe anteriormente [22], [29]. Brevemente, 3 ml de sangre se diluyeron inmediatamente en 3 ml de solución salina tamponada con fosfato y se acoda en 3 ml de Ficoll-Paque Plus ™ (Amersham Healthcare, Aylesbury, Reino Unido). Después de la centrifugación, PBMCs fueron recuperados de la capa de interfase, se resuspendieron en medio de cultivo completo y se cultivaron a 37 ° C durante 24 h para permitir la unión de las células adherentes, tales como células dendríticas.
Cell Coculture Modelo
placas Transwell (Corning, Nueva York, EE.UU.) fueron utilizados como un modelo de cocultivo indirecto, que contienen cámaras inferiores y superiores cámaras con 0,4-micras poros del filtro de membrana que no permiten que las células GC pasen a través, pero permiten medio para intercambiar libremente. Co-incubación de los dos tipos de células se utilizó como un modelo de cocultivo directo. la cultura única de células de GC se definió como monocultivo. células de GC se ajustaron a 5 x 10
5 células /ml, se siembran en las cámaras inferiores de placas de 6 pocillos y se incubaron durante 8 h para permitir la unión. Insertos que contienen 5 × 10
5 células /ml de PBMCs cultivadas fueron luego transferidos a las cámaras superior e cocultured durante otras 24 h en medio condicionado de FBS-libre o medio completo. Como controles negativos, insertos con PBMCs fueron colocados en los pozos con el mismo medio de cultivo en ausencia de células cancerosas, y los pocillos con células de GC se quedaron sin insertos. El recuento de células en el grupo de monocultivo fue el doble que en el grupo de co-cultivo, para asegurar el número de células similares en todos los grupos. Los sobrenadantes y las células se recogieron por separado después de 24 h para su uso posterior.
Ensayo de proliferación celular
Una plataforma de cultivo celular Cell-IQ (Chip-Man Technologies, Tampere, Finlandia), equipado con una fase microscopio -Contraste (Nikon CFI Achromat objetivo de contraste de fase con × 10 magnificación, Nikon, Japón) y una cámara, se utilizó para detectar el crecimiento de células tumorales, como se describe anteriormente [30]. Brevemente, las células de GC fueron cultivadas en placas de 24 pocillos (1 x 10
4 células /pocillo) durante 24 h y después se trató con TGF-β1 (Peprotech, EE.UU.) a 25 ng /mL. Los grupos de control se dejaron sin tratar. Las células se incubaron entonces durante otras 72 h en el sistema Cell-IQ. Las imágenes fueron capturadas en intervalos de 30 min durante 72 h, controlada por el software de imagen (Chip-Man Technologies), y se analizaron utilizando la imagen del software distribuido libremente-(Facilidad de McMaster Biofotónica, Hamilton, ON), mediante el seguimiento manual de plug-in creado por Fabrice Cordelières (Institut Curie, Orsay, Francia). El sistema Cell-IQ discrimina automáticamente la división y etapas celulares estables, y calcula el número total de células durante la proliferación. Ocho imágenes fueron analizados para cada grupo.
La movilidad de los linfocitos hace que sea difícil de controlar y calcular con exactitud el número de células que utilizan el sistema Cell-IQ. Por lo tanto, se utilizó un ensayo de Cell Counting Kit-8 (CCK-8) (Dojindo, Kumamoto, Japón) para evaluar la viabilidad de PBMC, de acuerdo con las instrucciones del proveedor. Brevemente, PBMCs cultivadas se sembraron a 5 x 10
3 células /pocillo en placas de 96 pocillos. Los cultivos se trataron con TGF-β1 o se dejaron sin tratar como controles. Después de 72 h, se añadieron CCK-8 reactivos a cada pocillo y las placas se incubaron durante 4 h. Los recuentos de células se determinaron entonces por cinco pocillos por grupo experimental, en base a la absorbancia a 450 nm del reactivo de reducción de CCK-8, usando un lector de automicroplate (Flexstation 3, Molecular Devices, USA). La viabilidad celular se expresó como el porcentaje de células viables con respecto a los recuentos de células no tratadas. Cada experimento se llevó a cabo dos veces. Los datos fueron promediados y se muestra un experimento representativo.
inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA)
niveles
TGF-beta 1 y TGF-beta 2 en sistemas de monocultivo y de cocultivo se determinaron mediante ELISA sándwich usando Quantikine inmunoensayo humano TGF-β1 y TGF-beta 2 inmunoensayos (aMP R y; D Systems, USA), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Un total de 100 l de sobrenadantes de células de los grupos de cultivo directos e indirectos, respectivamente, se trataron con 20 l de 1 M de HCl durante 10 min, seguido de neutralización con 20 l de NaOH 1,2 M. Las muestras fueron luego pipetearon en pocillos de la microplaca previamente recubiertas con un anticuerpo monoclonal específico para TGF-β1, y se incubaron durante 2 h a temperatura ambiente. Un anticuerpo policlonal ligado a enzimas específico para TGF-β1 A continuación se añadió a los pocillos y se incubaron durante 2 h para intercalar el ligando TGF-β1. Se añadió una solución de sustrato que consiste en peróxido de hidrógeno y tetrametilbenzidina y se determinó la intensidad del color con un lector de automicroplate (Flexstation 3, Molecular Devices). Cada experimento se realizó dos veces y cada punto de muestra se evaluó por triplicado, y se promediaron los datos.
Análisis estadístico
El análisis estadístico se realizó con el programa SPSS 16.0 para Windows (SPSS, Chicago, EE.UU.). Los datos se presentan como medias ± SD. Chi-cuadrado pruebas se utilizaron para analizar la correlación entre la tinción de TGF-β y características patológicas clínicas. pruebas de Kruskall-Wallis se utilizaron para comparar los valores entre los diferentes grupos, y se utilizaron pruebas de Mann-Whitney para identificar las diferencias específicas entre los dos grupos utilizando un valor α corregido. Emparejado con signo de Wilcoxon rango pruebas se realizaron para comparar los niveles de mRNA en tejidos tumorales y peritumoral. Las concentraciones de TGF-β en el suero y células sobrenadante se analizaron mediante ANOVA. Se realizó un análisis de correlación de dos variables para examinar las asociaciones entre los estados de ARNm de TGF-β1, TGF-β2, y las moléculas de Smads.
Resultados
Los cambios en TGF-β1 y TGF-β2 expresión en la displasia -carcinoma Secuencia
positivo TGF-β1 estaba presente no sólo en células displásicas o epiteliales malignas en la parte superior de la glándula, al lado del lumen, sino que también fuertemente en los fibroblastos de actina del músculo liso que expresa (Figura 1A-1C) . La tinción positiva para la forma intracelular de TGF-β1 se produjo en el 20% de las muestras de control, 52,3% de PC, 59,1% de EGC, y 66,7% de las muestras de AGC. prueba de tendencia lineal mostró que las tasas de inmunotinción positiva para el TGF-β1 se correlacionaron positivamente con la progresión de la lesión (χ
2 = 9,487,
P
= 0,002). La histología de GC a continuación se dividió en tipos 'intestinales' y '' difusas, de acuerdo con los criterios de Lauren [31]. Entre las muestras de GC, el 64,1% de los de tipo intestinal mostró una fuerte reactividad inmune y el 63,6% de los de tipo difuso se tiñeron débilmente. Todos los tejidos se tiñeron positivo para TGF-β2 (Figura 1D). No hubo diferencia en la expresión de TGF-β1 en relación con Helicobacter pylori (
Hp)
infección, la clasificación o la linfa participación de Lauren nodo (Tabla 1).
(A) tinción positiva para TGF-β1 en un caso de precáncer gástrico. (B) tinción citoplásmica fuerte en las células tumorales limitados a la mucosa en un caso de cáncer gástrico precoz y tinción débil en algunas células del estroma. (C) la expresión de TGF-β1 en un caso de tipo intestinal cáncer gástrico avanzado, según la clasificación de Lauren. (D) La tinción citoplasmática para TGF-β2 en un caso de cáncer gástrico avanzado. (Todas las fotos se muestran en la magnificación × 200).
Cambios en el TGF-β1 y TGF-β2 ARNm en gástrico y cáncer de tejidos PC
niveles de TGF-β1 mRNA se incrementaron en AGC, mientras que los niveles de TGF-beta 2 son potenciados en el EGC. los niveles de TGF-β1 mRNA aumentaron significativamente del control, PC, etapas EGC, y AGC (Figura 2A;
P Hotel & lt; 0,05). Subanálisis demostró que los niveles de TGF-β1 mRNA fueron significativamente mayores en AGC comparación con los grupos de control (PC y
P Hotel & lt; 0,05), mientras que los niveles de TGF-beta 2 se incrementaron en EGC y AGC, en comparación con el grupo de control (
P
& lt; 0,01) (Figura 2B). Además, los niveles de TGF-β1 de ARNm eran más altas en el tumor que en peritumoral (
P
& lt; 0,001) (Figura 2C); Sin embargo, los niveles de TGF-beta 2 demostraron la tendencia opuesta (
P Hotel & lt; 0,05) (Figura 2D). Además, el análisis de correlación identificó una correlación positiva entre los niveles de ARNm de TGF-β1 y Smad2 (
r = 0,346
,
P = 0,025
) y Smad7 (
r =
0.461,
P = 0,002
) (Figura 2E y 2F). TGF-β2, sin embargo, no mostró asociación con Smad2 o Smad7, y ni TGF-β1 ni TGF-β2 se correlacionó con Smad3 o Smad4. Tomados en conjunto, estos resultados sugieren que el TGF-β1 y TGF-β2 pueden jugar diferentes papeles en la progresión del tumor.
(A) Los niveles de TGF-β1 de ARNm en la secuencia de los controles (
n =
20), las lesiones precancerosas (PC) (
n
= 21), el cáncer gástrico temprano (EGC) (
n
= 22), con el cáncer gástrico avanzado (AGC) (
n
= 30). Los datos se presentan como media ± desviación estándar de los niveles de transcripción normalizaron a GAPDH. (B) correspondientes niveles de TGF-β2 ARNm en la misma secuencia. (C) y (D) los niveles de TGF-beta 1 se upregulated y los niveles de TGF-beta 2 se downregulated en los tejidos tumorales, en comparación con los tejidos peritumorales de los mismos pacientes. Los niveles se normalizaron a GAPDH. se muestran los datos de QRT-PCR en 20 casos emparejados. (E) y (F) correlaciones positivas significativas entre el TGF-β1 y Smad2 /Smad7, utilizando un modelo de correlación de dos variables. Los datos representan los niveles de transcripción en 36 casos de GC después de la normalización a GAPDH. (G) Las concentraciones séricas de TGF-β1 y TGF-β2 medido por ELISA fueron significativamente mayores en GC temprana y avanzada en comparación con los controles (
F =
4,745 y
P = 0,018
;
F =
4.939 y
P = 0,015
, respectivamente). No hubo diferencia significativa entre GC temprana y avanzada.
Ctrl
: Controles de voluntarios;
EGC
: cáncer gástrico precoz;
AGC
:. el cáncer gástrico avanzado
Los niveles séricos de TGF-ß
Para profundizar en la ocurrencia de TGF-β en el medio ambiente en general, se compararon las concentraciones séricas de TGF-β en pacientes con EGC o AGC a los de los controles. Las concentraciones séricas de TGF-β1 en los controles y en pacientes con EGC y AGC fueron 27,78 ± 6,11, 50,08 ± 4,38, y 45,76 ± 5,00 ng /ml, respectivamente, mientras que los valores correspondientes para TGF-β2 se 59,41 ± 15,42, 133,61 ± 21,90 y 111,34 ± 15,76 ng /ml, respectivamente. Los niveles de TGF-β1 y TGF-β2 fueron significativamente mayores en los pacientes con EGC o AGC en comparación con los de los controles (
F =
4.745 y
P = 0,018
;
F =
4.939 y
P = 0,015
). Sin embargo, no hubo diferencias significativas entre los pacientes con estadio temprano y tardío del GC (Figura 2G). Estos resultados sugieren que el estado anormal de TGF-β en la carcinogénesis gástrica puede ser una respuesta sistémica que implica no sólo el microambiente tumoral, sino también el sistema circulatorio general.
Coculture In Vitro
A cocultivo se estableció el modelo para determinar si el contacto directo célula a célula o indirecta de contactos de citoquinas dependiente es el principal mecanismo en un microambiente tumoral imitando. En primer lugar, no hubo diferencia significativa en los resultados de TGF-β1 y TGF-β2 niveles de mRNA en células de GC en el modelo de cocultivo directo utilizando PBMCs aisladas de pacientes GC o los controles (Figura 3A), y por lo tanto estos datos se agruparon para el análisis. Además, las concentraciones de TGF-β1 en el sobrenadante celular de cocultivos significativamente se aumentaron en comparación con los de PBMCs o GCs cultivadas solo en un ambiente libre de FBS (
P
& lt; 0,05) y sus niveles en el cocultivo directo grupo fueron significativamente mayores que los del grupo indirecta (
P =
0.029); Sin embargo, aunque los niveles de TGF-beta 2 también se incrementaron en cocultivos directos, las diferencias después de co-cultivos no fueron significativas (Figura 3B)
.
niveles (A) TGF-beta 1 y TGF-β2 de mRNA en células de GC después de co-cultivos directos se incrementaron en comparación con el monocultivo, pero no hubo diferencias significativas en el TGF-β1 y TGF-β2 niveles de mRNA en células de GC, con independencia del origen de las PBMC (GC pacientes o controles). (B) Los TGF-β1concentrations en el sobrenadante de células de co-cultivos se aumentó significativamente en comparación con los de PBMC o GC cultivadas solas en un ambiente libre de FBS (
P Hotel & lt; 0,05). Sus niveles en el grupo de cocultivo directo fueron significativamente mayores que los del grupo indirecta (
P =
0.029). los niveles de TGF-beta 2 también se incrementaron en cocultivos directos, pero las diferencias después de co-cultivos no fueron significativas. (C) los niveles de producción de citoquinas se incrementaron significativamente en los grupos de cocultivo indirectos después de la adición de FBS (
P
& lt; 0.05), pero ningún cambio obvio se detectó en los cocultivo directo. El experimento se realizó dos veces. Todos los datos se muestran como media ± desviación estándar de triplicados. (D) Origen de las citoquinas. En las células de GC, los niveles de TGF-β1 mRNA se incrementaron aproximadamente 3 veces en el cocultivo directo y el aumento de 2 veces en el indirecto en comparación con los monocultivos; los niveles de ARNm de TGF-β2 se incrementaron significativamente después del cocultivo directo, pero no cambiaron estadísticamente después de una indirecta. En PBMCs, los niveles de TGF-β1 mRNA se redujeron significativamente y los niveles de TGF-beta 2 se incrementaron notablemente después de co-cultivos. Los niveles se normalizaron a GAPDH, y los niveles en el grupo de monocultivo se definieron como 1,0. Todos los datos se muestran como media ± SD. (E) Los niveles de mRNA de Smad2 y Smad3 en células de GC se incrementaron significativamente después de cocultivos (
P
& lt; 0,05), que fueron mayores en el cocultivo directo que aquellos en el indirecto, pero no había ninguna estadística diferencia en los niveles de Smad4. (F) Cell-IQ mostró que la adición exógena de TGF-β1 (25 ng /ml) a las células GC suprimió el crecimiento y la división de las células tumorales, pero sin diferencias significativas. Ocho imágenes de diferente campo visual se analizaron para cada grupo. (G) Cell Counting Kit-8 (CCK-8) de ensayo mostró que el TGF-β1 (25 ng /ml) inhibió la viabilidad de PBMC significativamente a las 72 h. La línea muestra la relación entre la inhibición de las células TGF-beta 1 estimulado en comparación con los controles no tratados.
GC:
cáncer gástrico;
PMBC:
células mononucleares de sangre periférica;
Dir-co:
cocultivo directo;
Ind-co:
cocultivo indirecto;
Mono:
monocultivo;
FBS:
suero bovino fetal.
ns, España no es significativo; *,
P Hotel & lt; 0,05; **,
P
. & Lt; 0,05
posteriormente investigó el efecto de suero sobre la interacción entre las células tumorales y PBMCs. Sorprendentemente, TGF-beta 1 y TGF-beta 2 concentraciones en el grupo indirecta, en comparación a la de la condición FBS-libre, fueron inversamente mayor que los del grupo directa después de la adición de FBS. Por otra parte, las concentraciones de TGF-β1 y TGF-β2 en el sobrenadante celular se incrementaron significativamente en los grupos indirectos (
P
& lt; 0,05), pero fueron sólo ligeramente aumentados en los grupos directos (
P & gt;
0,05), mediante la adición de FBS (Figura 3C). Esto sugiere que un ambiente enriquecido puede facilitar la producción de citoquinas en indirecta no en comunicación directa.
Además, para determinar el origen de las citoquinas, los niveles de TGF-beta 1 y TGF-β2 de mRNA se midieron en células de GC y PBMCs respectivamente . En comparación con el monocultivo, los niveles de TGF-β1 mRNA se incrementaron aproximadamente 3 veces en el grupo directa y 2 veces en el grupo indirecta en células de GC después de cocultivo con PBMCs; los niveles de TGF-β2 de ARNm se incrementaron significativamente en células de GC después de cocultivo directo pero no cambiaron estadísticamente después de cocultivo indirecto. Mientras tanto, los niveles de TGF-β1 de ARNm se redujo significativamente y los niveles de TGF-β2 de ARNm se aumentaron más de 5 veces en PBMCs después de cocultivos (
P
& lt; 0,05) (Figura 3D). Estos resultados indican que los niveles elevados de TGF-beta 1 en el sobrenadante de células podrían originarse a partir de células de GC, mientras que TGF-β2 puede originarse a partir de PBMCs. Además, se encontró que los niveles de mRNA de Smad2 y Smad3 en células GC también se incrementaron significativamente después de co-cultivos, que eran más altos en el cocultivo directo que los del otro indirecto, pero no hubo diferencia estadística en los niveles de Smad4 (Figura 3E). En general, estos resultados sugieren que las citoquinas producción principalmente depende de la interacción directa entre las células cancerosas y PBMCs, y TGF-β //3 de señalización podría ser promovido durante este proceso Smad2.
Finalmente, para explorar más TGF-β1 papeles en células GC y PBMCs, la capacidad de crecimiento de las células de los dos tipos de células se detectaron mediante la adición exógena de TGF-β1 a los monocultivos de PBMCs o células GC. Cell-IQ mostró que los recuentos medios de ambas células totales y de división se redujeron; reconstituida TGF-β1 inhibe el crecimiento de células de GC a las 72 h, pero la diferencia no fue significativa (Figura 3F), mientras exógeno TGF-β1 afectada significativamente la viabilidad de las PBMC (Figura 3G). Este hallazgo indica que la elevación de TGF-β1 inhibe principalmente la función de las células mononucleares, pero no de las células tumorales.
Tomados en conjunto, estos hallazgos en la sección demostraron que la interacción entre las células tumorales y las PBMCs se produce principalmente a través de celular directa contacto -to-celular, pero con alguna contribución de contacto de citoquinas-dependiente. Además, las condiciones enriquecidos promueven la producción de citoquinas tales como TGF-β1 y TGF-β2. TGF-β1 actuó principalmente mediante la inhibición de la función de las PBMC, pero no de las células GC.
Discusión
Las anomalías en el factor de crecimiento y la secreción de citoquinas, especialmente TGF-β, desempeñan un papel clave en el desarrollo del cáncer [ ,,,0],3], [32]. Sin embargo, a lo mejor de nuestro conocimiento, la proteína y los estados de ARNm de TGF-β1 y TGF-β2 en el precáncer no han sido bien estudiados, y la producción de citocinas durante la interacción entre las células tumorales y PBMCs sigue sin estar claro. Por consiguiente, el estudio actual determinado los perfiles de TGF-β1 y TGF-β2 en el precáncer gástrico y el cáncer, y exploró la naturaleza de la interacción (directa o indirecta) entre las células y PBMCs de cáncer y su efecto sobre la producción de citoquinas.
estudios anteriores encontraron que el aumento de los niveles de expresión de proteínas TGF-beta 1 y TGF-beta 2 se asocian con un peor pronóstico [5], [11], y los niveles de ARNm de TGF-β1 y proteínas se incrementaron en los tejidos displásicos y GC en comparación con los tejidos gástricos normales [33], [34]; En contraste, los niveles de TGF-β2 de ARNm en los tejidos de GC fueron comparables con los controles [33]. Los resultados de este estudio confirmaron y ampliaron las observaciones anteriores; los niveles de TGF-β1 de mRNA fueron significativamente mayores en AGC, mientras que los niveles de TGF-beta 2 fueron más altos en la displasia y EGC. Además, los niveles de TGF-β1 de ARNm eran más altas en el tumor que en peritumoral, mientras que TGF-β2 demostró la tendencia opuesta. los niveles de proteína TGF-β1 mostradas por IHC fueron consistentes con estos resultados. Estos hallazgos sugieren que la transformación neoplásica podría ser un evento temprano que implica el aumento de TGF-β1, junto con la pérdida de TGF-β2.
Aunque un estudio anterior demostró que el 80% de las muestras de GC de tipo intestinal expresó TGF -β1 en comparación con sólo el 43% de los difusa de tipo [10], no se encontraron diferencias en la expresión de TGF-β1 en relación con
Hp
la infección, la clasificación de Lauren, o afectación de los ganglios linfáticos. Activado TGF-β1 era abundante en la mucosa de los
Hp
pacientes infectados, sin embargo, no hubo diferencia significativa en comparación con
HP
pacientes negativos al [35]. Además, nuestros resultados también mostraron que algunas células del estroma se tiñeron positivo para TGF-β1. Del mismo modo, se informó de células mononucleares en la lámina propia que es la principal fuente de TGF-β1 [36]. Comerci
et al
[37] reveló que el TGF-β1 secretado en o producido mediante el apoyo a los elementos del estroma podría promover indirectamente la progresión del tumor. Ottaviano
et al
[38] mostró que la diafonía entre las células cancerosas y elementos del estroma mediadas por TGF-β1 influido en superficie celular y pericellular degradante de la matriz potencial de
in vitro
. Por consiguiente, concluimos que la secreción de TGF-β por las células tumorales y las células del estroma podría desempeñar papeles importantes en la que ocurre y el mantenimiento de microambiente tumoral.
Los resultados revelaron que el TGF-β también se manifestó en el sistema periférico, ya las concentraciones séricas de TGF-β1 y TGF-β2 en pacientes GC fueron más altos que los de los controles. Sin embargo, la relación entre las concentraciones séricas de TGF-β1 y caracteres clinicopathological es controvertido. Estudios anteriores encontraron que las concentraciones séricas de TGF-β1 en pacientes GC fueron significativamente más altos que los de los controles, y se correlacionaron positivamente con la masa tumoral, invasión, metástasis y estadio clínico [39], [40].