Extracto
Antecedentes
transición epitelial a mesenquimal (EMT) inducida por la hipoxia es una de las causas fundamentales de fracaso del tratamiento en diferentes tipos de cánceres humanos. NF-kB está estrechamente asociada a la progresión de la EMT. En comparación con HIF-1α, la correlación entre el NF-kB y EMT durante la hipoxia ha sido menos estudiada, y aunque se observó el fenómeno en el pasado, los mecanismos moleculares implicados sigue sin estar claro.
Metodología /Principales conclusiones
a continuación, mostramos que la hipoxia o la sobreexpresión del factor-1α inducible por hipoxia (HIF-1α) promueve la EMT en las células de cáncer de páncreas. En la inhibición farmacológica molecular o de NF-kB, las células hipóxicas recuperaron la expresión de E-cadherina, perdieron la expresión de N-cadherina, y atenúan su fenotipo invasivo y altamente resistente a los medicamentos. La introducción de un pcDNA3.0 /HIF-1α en células de cáncer de páncreas en condiciones de normoxia Una mayor actividad de NF-kB, phenocopying efectos producidos por la hipoxia EMT. A la inversa, la inhibición de la actividad de NF-kappa B aumentado en esta configuración atenúa el fenotipo EMT.
Conclusiones /Importancia
Estos resultados sugieren que la hipoxia o la sobreexpresión de HIF-1α induce la EMT que es en gran parte dependiente el NF-kB en las células de cáncer de páncreas
Visto:. Cheng ZX, Sun B, Wang SJ, Gao Y, Zhang YM, Zhou HX, et al. (2011) del factor nuclear kappa B-dependiente epitelial a mesenquimal transición inducida por la activación de HIF-1α en células de cáncer de páncreas en condiciones hipóxicas condiciones. PLoS ONE 6 (8): e23752. doi: 10.1371 /journal.pone.0023752
Editor: S. K. Batra, Universidad de Nebraska Medical Center, Estados Unidos de América
Recibido: 20 Abril, 2011; Aceptado: 23 de julio de 2011; Publicado: 22 Agosto 2011
Derechos de Autor © 2011 Cheng et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por becas de la Fundación New Century Soporte para elitista del Ministerio de Educación de china (NCET-07-0248), la Fundación Científica de la prominente Juvenil de la provincia de Heilongjiang, china (JC200717), el Proyecto Científico y Tecnológico de la provincia de Heilongjiang, china (GC09C407-2), y la Fundación Nacional de Ciencia Natural de China (30571808, 30872987). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de páncreas, que es uno de los cánceres más agresivos y letales en todo el mundo, es altamente resistente a la quimioterapia [1]. Incluso la terapia sistémica con gemcitabina, un tratamiento de primera línea actual para el cáncer de páncreas avanzado sólo ofrece beneficios modestos debido a la quimio-resistencia intrínseca o adquirida [2], [3]. Además, los estudios clínicos recientes indican que sólo el 12% de los pacientes con cáncer de páncreas avanzado tiene una respuesta a la gemcitabina [4]. La tasa de respuesta pobres sugiere que el cáncer de páncreas o bien se desarrolla rápidamente o tiene la quimio-resistencia gemcitabina. Los mecanismos por los cuales surge la quimio-resistencia en el cáncer de páncreas son desconocidos; por lo tanto una mejor comprensión de cómo surge la resistencia y qué alteraciones moleculares causar o se correlacionan con la resistencia es probable que conduzca a nuevas estrategias terapéuticas para el cáncer de páncreas.
La hipoxia es un estímulo ambiental que desempeña un papel clave en el desarrollo y progresión del cáncer . hipoxia tumoral o la expresión de HIF-1 (factor inducible por hipoxia-1) se ha relacionado con un fenotipo agresivo que se correlaciona con una mala respuesta a la quimioterapia y una peor supervivencia global de pacientes de cáncer [5], [6]. HIF-1 es una proteína heterodimérica que consiste en HIF-1β, una subunidad expresada constitutivamente, y HIF-1α, una subunidad inducible sensible al oxígeno. En condiciones normóxicas, la proteína HIF-1α es hidroxilado por una familia de prolil hidroxilasas dependientes de oxígeno (PHD1-3); este se dirige a él para polyubiquitination por un complejo de proteínas que contiene la proteína de von Hippel-Lindau (pVHL) y después la degradación. Bajo condiciones de hipoxia, prolil hidroxilasas son inactivados, y la degradación de HIF-1α se bloquea; esto permite HIF-1α se acumule y asociarse con HIF-1β para formar un complejo de transcripción funcional que activa la transcripción de una serie de genes inducibles por hipoxia [7].
transición epitelial a mesenquimal (EMT) es el proceso por el cual las células epiteliales adherentes se convierten en células mesenquimales móviles y es esencial en el desarrollo embrionario. EMT ahora se sabe que también se producen en una variedad de enfermedades, incluyendo la progresión del cáncer [8]. En el reciente estudio, se aportan pruebas que sugiere que las condiciones de hipoxia moderada pueden desencadenar, como un factor independiente, que conduce un programa de EMT diferentes células de cáncer humano para aumentar significativamente la invasividad [9]. Mientras tanto, algunos estudios también informaron de que la activación de NF-kB está estrechamente implicada en la progresión de la EMT [10] - [13]. exámenes detallados de las múltiples facetas del programa EMT han puesto de manifiesto su implicación en algo más que la invasión y la metástasis; estudios recientes demostraron que el fenotipo de EMT se asocia con la quimiorresistencia en tumores sólidos diversos [14] - [17]
factor nuclear kappa B (NF-kB) representa una familia de factores de transcripción que modulan la expresión de. genes con diversas funciones. La actividad de NF-kappa B está regulada por la proteína inhibidora de NF-kappa B (I? B), que se une a y secuestra miembros de la familia NF-kB en el citoplasma. Cuando se activa la ruta de NF-kappa B, I? B es fosforilado por I? B quinasa (IKK), que fosforila I? B. Fosforilada I? B se somete a la ubiquitinación y la degradación mediada por proteasoma, lo que resulta en la translocación de NF-kB al núcleo. NF-kappa B es un factor de transcripción ubicuo regulada por muchos estímulos, incluyendo la hipoxia, citoquinas y fármacos quimioterapéuticos, y recientemente ha surgido como una diana para el cáncer. NF-kappa B se activa constitutivamente en la mayoría de las células de cáncer de páncreas humano y las muestras de tumor primario, pero no en tejidos pancreáticos normales o líneas celulares nontumorigenic [18] - [20]. Algunos estudios recientes mostraron que la hipoxia puede activar NF-kappa B e inducir la resistencia de las células de cáncer de páncreas a gemcitabina [21] - [23]. Anteriormente, se informó de que el uso de dihidroartemisinina o pequeños ARN de interferencia (siRNA) inactiva la NF-kB y potencia el efecto antitumoral de la gemcitabina en el cáncer de páncreas, tanto in vitro como in vivo [24], [25].
En este estudio, hemos tratado evidencias de que las células de cáncer de páncreas (PANC-1, BxPC3) bajo condiciones de hipoxia se someten al proceso de EMT y adquieren fenotipos invasivos y resistentes a los medicamentos de una manera NF-kB-dependiente. En esto, hemos demostrado que la hipoxia o la sobreexpresión de HIF-1α activan NF-kB y promovieron la EMT en las células de cáncer de páncreas. En la inhibición farmacológica molecular o de NF-kB, las células hipóxicas recuperaron la expresión de E-cadherina, perdieron la expresión de N-cadherina, y atenúan su fenotipo invasivo y altamente resistente a los medicamentos. La introducción de un pcDNA3.0 /HIF-1α en células de cáncer de páncreas en condiciones de normoxia Una mayor actividad de NF-kB, phenocopying efectos producidos por la hipoxia EMT. Por el contrario, la inhibición de la actividad de NF-kB aumentado en este entorno invierte el fenotipo EMT. Tomados en conjunto, estos resultados sugieren que la hipoxia o la sobreexpresión de HIF-1α inducir la EMT que depende en gran medida de NF-kB en las células de cáncer de páncreas.
Resultados
Resultados de la hipoxia en el estudio morfológico y celular cambios biológicos característicos de EMT en células de cáncer pancreático
para recapitular los efectos de la hipoxia como ocurre en el cáncer de páncreas, expusimos 55-60% de células de cáncer de páncreas subconfluentes (PANC-1, BxPC-3) a condiciones de hipoxia (1% O
2, 5% de CO
2, y 94% de N
2) hasta las 48 h. Presentó grandes diferencias en la morfología y la tendencia a formar nidos celulares o clusters entre las células del cáncer pancreático en condiciones hipóxicas y sus homólogos de normoxia (95% de aire y 5% de CO
2). Las células de normoxia exhibieron una forma poligonal y hojas de adoquines similar, indicativo de un fenotipo epitelial. En contraste, las células hipóxicas comenzado a perder los contactos de células, grupos de células dispersas desde y adquirieron una morfología fusiforme alargada con procesos dendríticos, en consonancia con una transición mesenquimal (Fig. 1B).
(A) análisis de transferencia de Western de marcador epitelial (e-cadherina) y marcadores mesenquimales (vimentina, N-cadherina) y HIF-1α de PANC-1, BxPC-3 células en condiciones de normoxia (N) o hipoxia (h) las condiciones de 48 h. Se mostró una blot representativo de tres experimentos independientes. El histograma muestra la densidad media de volumen corregido para el control de carga (β-actina). *,
p Hotel & lt; 0,05. análisis (B) de contraste de fase (magnificación original, × 100) de los cambios morfológicos detectados en las células de cáncer de páncreas en condiciones de normoxia o condiciones de hipoxia de 48 h. (C) Immuofluorescence tinción de E-cadherina y vimentina en PANC-1, BxPC-3 células en condiciones de normoxia o condiciones de hipoxia durante 48 h. El verde representa la tinción de E-cadherina, mientras que el rojo representa la tinción de vimentina. El azul representa la señal de la tinción de ADN nuclear DAPI. (D) La viabilidad de las células fue evaluada por el Cell Counting Kit-8 de ensayo y se usa para calcular el índice de viabilidad. células PANC-1 y BxPC-3 fueron expuestos a la gemcitabina (0 mmol /L) durante 48 h como la línea de base. *,
p Hotel & lt; 0,05. (E) La proliferación de las células se midió mediante el ensayo de cristal violeta. Las figuras fueron seleccionados como escenas representativos de tres experimentos independientes. ensayo de invasión (F) Matrigel. Izquierda, fotomicrografías de las células que han pasado a través de Matrigel en condiciones de normoxia o hipoxia durante 48 h (aumento original, × 100). Derecho, la cuantificación de la invasión. *,
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. & Lt; 0,05
Para confirmar si las células de cáncer de páncreas se sometieron a EMT expuesto a hipoxia, también se determinó la expresión de marcadores epiteliales y mesenquimales de fenotipos por Western blot . Como se muestra en la Fig. 1A, células hipóxicas se sometió a un "interruptor de cadherina," por el que manifiestan la expresión de E-cadherina reducida y el aumento de expresión de N-cadherina. Además, la expresión de HIF-1α, un marcador importante de la vía de la hipoxia, se encontró expresado intensamente bajo condiciones hipóxicas durante 48 h (Fig. 1A). La tinción de inmunofluorescencia se empleó para confirmar aún más la EMT cambios fenotipo de las células de cáncer de páncreas bajo condiciones hipóxicas. Se demostró que la expresión de E-cadherina disminuye y la expresión de vimentina se incrementó en comparación con los de las células normóxicas (Fig. 1C).
Las células cancerosas que se han sometido a EMT tienden a exhibir mayor resistencia a los medicamentos y la invasividad . Como tal, se examinaron estas propiedades en normoxia células frente a las células hipóxicas en Cell Counting Kit-8 de ensayo, ensayo de cristal violeta y ensayo de invasión de Matrigel. No se observaron diferencias notables. Cell Counting Kit-8 de ensayo se utilizó para evaluar la tasa de viabilidad de las células. células PANC-1 y BxPC-3 fueron expuestos a dosis de gradiente de gemcitabina (0-200 mol /L) durante 48 h. Los datos se muestran en la Fig. 1D, cuando se tratan con concentración de gemcitabina más grande que 100 nmol /L, células hipóxicas mostró tasa de viabilidad celular significativamente mayor que las células de normoxia. Estos resultados se confirmaron adicionalmente por ensayo de violeta cristal (Fig. 1E), cuando las células se trataron con gemcitabina (10 mmol /L de PANC-1 y 500 nmol /L de BxPC-3) bajo condiciones hipóxicas o normóxicas durante 48 h, hipóxicas células mostraron tasa de viabilidad celular significativamente mayor que las células de normoxia. ensayo de invasión de Matrigel se utilizó para evaluar la invasividad de las células. Tanto PANC-1 y BxPC-3 células en condiciones hipóxicas durante 48 h fácilmente migrado a través de la cámara de Matrigel en cantidades relativamente altas, mientras que sus socios de normoxia exhiben una marcada reducción en la invasión (Fig. 1F).
Tomados en conjunto , nuestros datos indican cambios en la morfología, patrón de crecimiento, la expresión de proteínas, resistencia a los medicamentos y la invasión apoyan la noción de que la hipoxia conduce a la EMT en las células de cáncer de páncreas.
cáncer de páncreas células en condiciones hipóxicas exhibición acentúan la actividad de NF-kB
Algunos estudios han demostrado previamente que los resultados de la hipoxia en la activación de NF-kappa B [19], [20]. Por lo tanto, hemos tratado de determinar si la EMT observado en células de cáncer de páncreas en condiciones de hipoxia era atribuible a la actividad de NF-kB mayor. En primer lugar, documentamos que las proteínas p65 NF-kB y la actividad de unión a ADN de NF-kB se aumentaron de hecho en las células de cáncer de páncreas de hipoxia en comparación con las contrapartes de normoxia según lo determinado por análisis de transferencia de Western y EMSA. Mientras tanto, HIF-1α también se analizó mediante análisis de transferencia Western (Fig. 2A). células PANC-1 y BxPC-3 se incubaron bajo condiciones hipóxicas para diferentes períodos de tiempo (24 h, 48 h, 72 h). Después de cada periodo de incubación indicado, las células se recogieron, y se extrajeron las proteínas totales o nucleares. Como se muestra en la Fig. 2 A y B, NF-kB p65 proteínas y la actividad de unión a ADN de NF-kB se incrementaron 24 h después del inicio de la hipoxia y mantienen niveles altos. La especificidad de bandas de gel desplazada de la EMSA fue documentado por experimentos de competición en frío, en el que el exceso de tipo salvaje frío, pero no la sonda kappa B mutante frío abrogaron las señales de las bandas pasado.
PANC-1 y BxPC- 3 células se cultivaron en condiciones de normoxia (N) o condiciones de hipoxia (H) para varios períodos (24 h, 48 h, 72 h). Después de cada periodo de incubación indicado, las células se recogieron. Se prepararon extractos nucleares y los extractos de proteínas totales. (A) NF-kappa B p65 y HIF-1α se analizaron mediante análisis de transferencia Western a partir de homogeneizado de células respectiva. El histograma muestra la densidad media de volumen corregido para el control de carga (β-actina). *,
p Hotel & lt; 0,05. (B) EMSA para la actividad de NF-B-ADN vinculante sobre los respectivos extractos nucleares. ensayo competitivo confirmó la especificidad de NF-kB de unión al ADN (véase Materiales y métodos para más detalles). Derecha dos carriles, en peso, de tipo salvaje; m, mutante. (C) VEGF se analizó por análisis de transferencia Western a partir de homogeneizado de células respectiva. El histograma muestra la densidad media de volumen corregido para el control de carga (β-actina). *,
p Hotel & lt; 0,05. (D) Análisis de transferencia Western. Efectos de la siRNA p65 NF-kappa B en la expresión de VEGF de PANC-1 y células BxPC-3 en condiciones de hipoxia durante 48 h. El histograma muestra la densidad media de volumen corregido para el control de carga (β-actina). *,
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. & Lt; 0,05
Mientras tanto, HIF-1α también se analizó por Western blot. Como se muestra por Western Blot (Fig. 2A), los niveles de proteína HIF-1α en células de cáncer de páncreas fueron reguladas durante la hipoxia. El aumento en el nivel de proteína HIF-1α fue posiblemente debido a los efectos de estabilidad de proteínas como estudiado anteriormente [7]. Dado que la expresión de HIF-1α VEGF gen diana, un factor de crecimiento que puede promover la EMT, está mediada por NF-kB, que también determinan si la hipoxia estimula la expresión del VEGF. Como se muestra en la Fig. 2C, la transferencia Western mostró que la expresión de proteína VEGF aumentó significativamente después de 24 h de hipoxia y mantenido altos niveles. Por el contrario, la sobre regulación de VEGF fue suprimida por silenciamiento de la expresión de p65 NF-kB en las células de cáncer de páncreas hipóxicas utilizando el siRNA-p65 específico de NF-kB, mientras que no se observó efecto en las células transfectadas con el ARNsi de control (Fig. 2D) .
la inhibición de la actividad de NF-kB en las células de cáncer de páncreas en condiciones de hipoxia media EMT
Una vez establecido que la hipoxia en la elevada actividad de NF-kB en las células de cáncer de páncreas, el próximo investigó el potencial de la inhibición de NF-kB para atenuar las características mesenquimales de células hipóxicas. Con este fin, hemos utilizado tanto por medios moleculares y farmacológicos de la inhibición de NF-kappa B en estas células hipóxicas y luego comparamos el fenotipo resultante con células de control tratadas. la inhibición molecular se realizó mediante siRNA para regular a la baja la subunidad p65 de NF-kB. También se utilizó un inhibidor de IKK BAY 11-7082 para farmacológicamente bloque de la actividad de NF-kB disponible en el mercado. La inhibición de la actividad de NF-kappa B ya sea por el siRNA p65 NF-kappa B o BAY 11-7082 en condiciones de hipoxia durante 48 h dio como resultado un cambio en la expresión de la proteína que se caracteriza por el aumento de E-cadherina y reduce la expresión de N-cadherina como se determina por análisis de transferencia Western (Fig. 3A), coherente con la reversión a un fenotipo epitelial. Es importante destacar que, la inhibición de NF-kB por cualquiera de siRNA p65 NF-kappa B o BAY 11 a 7082 condujo a una marcada disminución de la invasividad de las células hipóxicas en comparación con las células tratadas de control en ensayo de invasión de Matrigel en condiciones de hipoxia durante 48 h (Fig. 3B) . Cuando las células se trataron con gemcitabina (10 mmol /L de PANC-1 y 500 nmol /L de BxPC-3) durante 48 h con la inhibición de la actividad de NF-kB por cualquiera de siRNA p65 NF-kappa B o un inhibidor de IKK en condiciones de hipoxia, se también mostraron significativamente más baja tasa de viabilidad que sus respectivos controles en el ensayo de cristal violeta (Fig. 3C) y Cell Counting Kit-8 de ensayo (Fig. 3D). A pesar de estos cambios en la expresión de proteínas, de invasión y la resistencia a los fármacos atribuibles a NF-kB bloqueo, no observamos ningún profundos cambios en la morfología o patrones de crecimiento de células de cáncer de páncreas en condiciones de hipoxia, una observación que implica eventos bioquímicos NF-kappa B-independientes que también contribuyen al fenotipo de EMT en células de cáncer pancreático hipóxicas.
(a) análisis de transferencia de Western. Efectos de la siRNA NF-kB p65 e IKK inhibidor de BAY 11-7082 en la N-cadherina y la expresión de E-cadherina de PANC-1 y células BxPC-3 bajo condiciones de hipoxia durante 48 h. El histograma muestra la densidad media de volumen corregido para el control de carga (β-actina). *,
p Hotel & lt; 0,05. ensayos de invasión (B) de Matrigel. A la izquierda, después de microfotografías células fueron tratadas con NF-kB p65 siRNA o BAY 11-7082 (10 mmol /L) o controles apropiados respectivos. Aumento original, × 100. Derecho, la cuantificación del ensayo de invasión. *,
p Hotel & lt; 0,05. (C) La proliferación de las células se midió mediante el ensayo de cristal violeta. Las figuras fueron seleccionados como escenas representativos de tres experimentos independientes. (D) La viabilidad de las células fue evaluada por el Cell Counting Kit-8 de ensayo y se usa para calcular el índice de viabilidad. *,
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cáncer de páncreas células bajo condiciones de hipoxia regulación al alza de exposiciones NF-KB dependiente de Twist, reguladores de la transcripción del programa EMT
El programa de la expresión de genes que media la EMT está regulada por uno o más factores de transcripción, incluyendo Twist, ZEB1, Zeb2, y el caracol [26]. Estos factores de transcripción influyen en la expresión de cadherinas y metaloproteinasas, entre otras proteínas implicadas en la EMT. Que estos factores de transcripción se inducen transcripcionalmente por vías de señalización aguas arriba, incluyendo NF-kappa B [26] nosotros, se le pide que observar su expresión diferencial en células de cáncer de páncreas en condiciones de hipoxia en comparación con condiciones de normoxia por análisis de transferencia de Western. células de cáncer pancreático hipóxicas exhibieron upregulation sustancial de Twist, Snail, ZEB1, y Zeb2 en comparación con las células normóxicas (Fig. 4A). la inhibición farmacológica de IKK por BAY 11-7082 en las células hipóxicas resultó en una disminución dependiente de la dosis en la expresión de la torcedura, pero no hay cambios notables en ZEB1, Zeb2 o la expresión de Snail, un hallazgo que acusa la mayor estado de NF-kappa B como una fuerza bioquímica etiológico la sobreexpresión de la torcedura subyacente en las células de cáncer de páncreas en condiciones de hipoxia (Fig. 4B). Estos hallazgos indican que la expresión aumentada de giro que se produce en el entorno de las células de cáncer de páncreas en condiciones de hipoxia está mediada por la actividad de NF-kB aumentada.
(A) análisis de transferencia de Western de la expresión basal de transcripción EMT-mediación factores: Twist, Caracol, ZEB1, y Zeb2 en las células de cáncer de páncreas en condiciones de normoxia (N) frente a la hipoxia (h) las condiciones de 48 h. El histograma muestra la densidad media de volumen corregido para el control de carga (β-actina). *,
p Hotel & lt; 0,05. (B) Análisis de transferencia Western. efectos dependientes de la dosis de una exposición de 48 h de la IKK inhibidor BAY 11-7082 sobre la expresión de Twist, Caracol, ZEB1, y Zeb2 en condiciones de hipoxia. Se mostró una blot representativo de tres experimentos independientes. El histograma muestra la densidad media de volumen corregido para el control de carga (β-actina).
La sobreexpresión de HIF-1α en las células de cáncer de páncreas en condiciones de normoxia induce EMT en forma NF-KB dependiente
Los informes recientes han establecido un vínculo causal entre la expresión de HIF-1α a la supresión de la e-cadherina y la adquisición de un fenotipo mesenquimal [27]. Por lo tanto, la hipótesis de que la EMT que las células de cáncer de páncreas se someten en respuesta a la expresión de HIF-1α se produce, al menos en parte, debido a la activación de HIF-1α mediada de la vía de NF-kB. En primer lugar, hemos introducido una forma transitoria pcDNA3.0 /HIF-1α en PANC-1 en condiciones de normoxia (HIF-1
+ /N) utilizando un LipofectamineTM 2000. Mientras que HIF-1α fue casi indetectable en PANC-1 en condiciones de normoxia transducidas con el control de vector vacío (pcDNA3.0 /N), los niveles de HIF-1α en HIF-1α
+ células /N fueron comparables con los de las células bajo condiciones de hipoxia durante 48 h (Fig. 5A). A continuación, se confirmó que la actividad de NF-kB hizo en aumento hecho en estos HIF-1α células
+ /N que las células pcDNA3.0 /N. De hecho, HIF-1α
+ /N células exhibido la actividad de NF-kB mayor tal como se determina por análisis de Western blot y EMSA (Fig. 5A y B).
(A) análisis de transferencia de Western de NF-kB p65 y HIF-1α expresión de las células PANC-1 en condiciones de hipoxia durante 48 h (h /48 h), las células PANC-1 transducidas con pcDNA3.0 vector vacío (pcDNA3.0 /N) y pcDNA3.0 /HIF-1α (HIF-1α
+ /N) en condiciones de normoxia durante 48 h. El histograma muestra la densidad media de volumen corregido para el control de carga (β-actina). *,
p Hotel & lt; 0,05. (B) EMSA para NF-kB actividad de unión al ADN en H /48 h, HIF-1α
+ /N, y pcDNA3.0 /N PANC-1 en las células. Justo dos carriles, cold concurso EMSA.
Una vez establecido que HIF-1α
+ células /N manifiesta aumentada la actividad de NF-kB, se evaluó el próximo estas células para la evidencia de la EMT. En comparación con pcDNA3.0 /N células, HIF-1α
+ /N células mostraron un aumento en la expresión de N-cadherina y la supresión de E-cadherina en condiciones de normoxia durante 48 h como se determinó por análisis de transferencia Western (Fig. 6A) . Se empleó la tinción de inmunofluorescencia para confirmar aún más un EMT inducida por HIF-1α en condiciones de normoxia, la expresión de E-cadherina se redujo y aumentó vimentina en el HIF-1α
+ /N células en comparación con las células pcDNA3.0 /N en condiciones de normoxia condiciones de 48 h (Fig. 6B). Este interruptor cadherina también se asoció con un aumento de Twist, Snail, ZEB1, y la expresión Zeb2 (Fig. 6A), hallazgos que recuerdan a los observados en las células de cáncer de páncreas en condiciones de hipoxia (Fig. 4A). El papel de NF-KB en la modulación de estos de expresión de proteínas cambios se ilustra por los efectos de la inhibición de NF-kappa B en HIF-1α
+ células /N por la exposición al inhibidor de IKK BAY 11-7082 (0-10 mmol /L), que invierte el fenómeno de conmutación cadherina, así como la reducción de la expresión de la torcedura en una dosis-dependiente, pero no hay cambios notables en ZEB1, Zeb2 o la expresión de Snail (Fig. 6C). La invasión y la gemcitabina resistencia de HIF-1α
+ células /N y su dependencia de la actividad de NF-kB mayor fueron evaluados en el ensayo de invasión Matrigel, cristal violeta y ensayo Cell Counting Kit-8 ensayo. Por ejemplo, la invasividad de HIF-1α
+ /N células a través de una cámara de Matrigel fue significativamente mayor que la de las células pcDNA3.0 /N bajo condiciones de normoxia durante 48 h (Fig. 6D). Del mismo modo, cuando las células se trataron con gemcitabina (10 mmol /L) durante 48 h en condiciones de normoxia, significativamente más alta tasa de viabilidad celular se mostró en HIF-1α
+ /N células en comparación con células de pcDNA3.0 /N como se determina por ensayo de cristal violeta (Fig. 6E) y Cell Counting Kit-8 de ensayo (Fig. 6F). La invasión y gemcitabina mejora la resistencia de HIF-1α
+ /N células fueron abrogadas por el NF-kB mediante el bloqueo de la exposición al inhibidor de IKK BAY 11-7082 (10 mmol /L) en condiciones de normoxia durante 48 h (Fig . 6D, e y F). Por lo tanto, el aumento en la invasividad y la resistencia gemcitabina en PANC-1 que se caracterizan por la hipoxia se produce como resultado de la activación de la vía de NF-kB inducida por HIF-1α.
(A) análisis de transferencia de Western de los niveles de de las proteínas indicadas en las células PANC-1 transducidas con el vector vacío pcDNA3.0 (pcDNA3.0 /N) y pcDNA3.0 /HIF-1α (HIF-1α
+ /N) en condiciones de normoxia durante 48 h. El histograma muestra la densidad media de volumen corregido para el control de carga (β-actina). *,
p Hotel & lt; 0,05. (B) fenotipo cambia EMT se confirmó con microscopía Immuofluorescence tinción de E-cadherina y vimentina. El verde representa la tinción de E-cadherina, mientras que el rojo representa la tinción de vimentina. El azul representa la señal de la tinción de ADN nuclear DAPI. (C) Análisis de transferencia Western. efectos dependientes de la dosis de una exposición de 48-h a la IKK inhibidor BAY 11-7082 en las proteínas indicadas. El histograma muestra la densidad media de volumen corregido para el control de carga (β-actina). ensayos de invasión (D) de Matrigel. Efectos de un 48-h BAY 11-7082 (10 mmol /L) en la invasión de células PANC-1 en condiciones de normoxia. A la izquierda, microfotografías en aumento original del × 100; Derecho, histograma para ilustrar los resultados del ensayo de invasión. *,
p Hotel & lt; 0,05. ensayo de violeta (E) de cristal. Efectos de un 48-h BAY 11-7082 (10 mmol /L) en la susceptibilidad de gemcitabina de células PANC-1 en condiciones de normoxia. Las figuras fueron seleccionados como escenas representativos de tres experimentos independientes. (F) Los efectos del inhibidor de IKK sobre la susceptibilidad de gemcitabina de células PANC-1 en condiciones de normoxia También se midió contando Cell Kit-8 de ensayo y se utilizaron para calcular el índice de viabilidad. *,
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Discusión
En los últimos años, se ha vuelto cada vez más claro que la EMT juega un papel importante en la progresión del cáncer y es también responsable del fenotipo resistente de las células cancerosas a agentes quimioterapéuticos convencionales [8]. Varios factores, incluyendo la hipoxia, han sido acusados como la inducción de este fenómeno a través de la inducción de la torcedura, Caracol, ZEB1, y Zeb2 en función de los contextos celulares [11], [26] - [28]. Un microambiente hipóxico se encuentra comúnmente en la región central de los tumores sólidos. La conexión entre la hipoxia y la EMT se ha informado anteriormente, y HIF-1α ha sido acusado como la mediación de este fenómeno. Sin embargo, las bases moleculares de la regulación de HIF-1α inducida por estos factores de transcripción EMT-inducir han sido en gran medida sin definir, aunque la evidencia en apoyo de la capacidad de HIF-1α para inducir directamente la transcripción de la torcedura se ha descrito recientemente en células de riñón de embriones humanos [27].
estudio anterior mostró que la hipoxia conduce a la activación de NF-kB y tal activación fue mediada por la fosforilación de I? B? en residuos de tirosina [28]. la activación de NF-kB es un componente crítico en la respuesta transcripcional a la hipoxia. Nuestros datos presentados en este informe indican que la activación de NF-kB se incrementa en condiciones de hipoxia, así como transitoriamente transfectadas con un pcDNA3.0 /HIF-1α en las células de cáncer de páncreas en condiciones de normoxia. Mientras tanto, la actividad de NF-kappa B mayor en condiciones de hipoxia es inhibida por IKK inhibidor BAY-11 a 7082, que puede inhibir la fosforilación y degradación de I? B?, Y evita la translocación de p65 /p50. Tanto nuestros datos y estudios anteriores mostraron que las vías bioquímicas que conducen a la activación de NF-kB se reunieron en el complejo IKK en condiciones de hipoxia. Recientemente, se informó de que NF-B induce transcripcionalmente la expresión de HIF-1α en macrófagos murinos, el hígado y el cerebro [29]. También se encontró que la inhibición farmacológica de NF-kappa B, IKK inhibidor BAY-11-7082, dio lugar a una expresión reducida HIF-1α tanto en las células PANC-1 y BxPC-3 en condiciones de hipoxia (datos no mostrados). Estos resultados sugieren la existencia de un bucle de bioquímica, con lo que HIF-1α activa NF-kappa B y viceversa. La interrupción de este bucle en las células de cáncer de páncreas en uno o más de los muchos pasos bioquímicos que enlazan HIF-1α a NF-kB es apta para tener un efecto significativo en el crecimiento del cáncer de páncreas. Sin embargo, la relación entre HIF-1α y NF-kappa B en el proceso de desarrollo del tumor es particularmente complejo y requiere más exploración. Además, hemos demostrado que el programa EMT atribuible a la hipoxia o la sobreexpresión de HIF-1α se largly impulsado por activación de la vía clásica NF-kB. Este programa EMT se caracteriza por vimentina y N-cadherina expresión y supresión de E-cadherina, sorprendentes cambios morfológicos, un fenotipo mesenquimal altamente invasiva y gemcitabina-resistente.
El estudio reciente demostró que la expresión de HIF-1α objetivo gen VEGF, un factor de crecimiento que puede promover EMT en el cáncer de próstata [30]. En este estudio, los datos también mostraron que la expresión de proteína de VEGF aumentó significativamente en las células de cáncer de páncreas en condiciones de hipoxia y la sobre regulación de VEGF, inducidas por la hipoxia, fue abolida por NF-kB p65 siRNA. También se encontró que estas células se incubaron bajo condiciones hipóxicas o transfectadas con pcDNA3.0 /HIF-1α en condiciones de normoxia exposición acentúan la actividad de NF-kappa B, la inhibición de la que resulta en la reversión del interruptor de cadherina a la de un fenotipo epitelial tipificado por reducido invasión y aumento de la sensibilidad gemcitabina, hallazgos que implican a NF-kB como mediador principal del programa EMT HIF-1α inducida en las células de cáncer de páncreas en condiciones hipóxicas
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Otros estudios han identificado previamente ZEB1, Zeb2, y Caracol como reguladores centrales de la supresión de la e-cadherina y EMT en células de cáncer de páncreas [11], [31]. Sin embargo, la expresión de Twist no se detectó en condiciones de normoxia y el gen de la torcedura se activó después de la exposición a la hipoxia en cinco líneas celulares de cáncer de páncreas [32]. En este estudio, hemos demostrado que la EMT inducida por la hipoxia o sobreexpresión de HIF-1α se asoció con un aumento de la torcedura, la expresión de Snail, ZEB1, o Zeb2. También se encontró que la inhibición farmacológica de IKK por BAY 11-7082 en las células hipóxicas resultó en una disminución dependiente de la dosis en la expresión de la torcedura, pero no hay cambios notables en ZEB1, Zeb2 o la expresión de Snail, lo que sugiere que los factores de transcripción específicos que regulan la EMT dependen de la contexto celular y el estado específico de células. Esta transformación mesenquimal puede en gran parte ser atenuada mediante la inhibición de NF-kappa B a través de cualquiera de los enfoques moleculares o farmacológicos, aunque NF-kB bloqueo no promueve una reversión completa a un fenotipo epitelial, como se evidencia por el mantenimiento del caracol, ZEB1, o expresión Zeb2 en la cara de NF-kappa B siRNA p65 o la inhibición de IKK. Este último hallazgo sugiere la existencia de NF-KB-independiente EMT vías de regulación en las células de cáncer de páncreas en condiciones de hipoxia que aún no se ha definido.