Extracto
Desde hace tiempo se acepta que las inmunoglobulinas (Igs) fueron producidos por las células linfoides B solamente. Recientemente Igs se han encontrado que se expresa en diversas células de cáncer humano y promover el crecimiento del tumor. La recombinación de genes de activación 1 (RAG1) y RAG2, que son enzimas esenciales para iniciar variable diversidad de unión de recombinación segmento, también se han encontrado que se expresa en células de cáncer. Sin embargo, el mecanismo de activación RAG en estas células de cáncer no se ha dilucidado. A continuación, se investigó el mecanismo de regulación de la expresión de RAG en cuatro líneas celulares de cáncer humano mediante el análisis de los factores de transcripción que inducen la activación de RAG en las células B. Por RT-PCR, transferencia de Western e inmunofluorescencia, se encontró que los factores de transcripción E2A, FoxO1 y FOXP1 se expresaron y se localizan en los núcleos de estas células de cáncer. La sobreexpresión de E2A, FoxO1 o Foxp1 aumento de la expresión del GAR, mientras que la interferencia de ARN de E2A, FoxO1 o disminución de la expresión de FOXP1 RAG en las células cancerosas. experimentos de inmunoprecipitación de cromatina mostraron acetilación de RAG potenciador (ERAG) y E2A, FoxO1 o FOXP1 fueron obligados a ERAG in vivo. Estos resultados indican que en estas células de cáncer de los factores de transcripción E2A, FoxO1 y regulan la expresión de FOXP1 RAG, que inicia el reordenamiento del gen Ig mucho en la forma similar a los linfocitos B
Visto:. Chen Z, Y Xiao, Zhang J , Li J, Liu Y, Zhao Y, et al. (2011) factores de la transcripción E2A, FoxO1 y regular la expresión de FOXP1 recombinación Activación de genes en las células cancerosas. PLoS ONE 6 (5): e20475. doi: 10.1371 /journal.pone.0020475
Editor: Sumitra Deb, Virginia Commonwealth University, Estados Unidos de América
Recibido: 21 Marzo, 2011; Aceptado: April 26, 2011; Publicado: 31 de mayo de 2011
Derechos de Autor © 2011 Chen et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por becas (81.001.199 de ZC, 81030033, 30971150 a JG, 30950110335 KC) de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China, y otorgar a LYM10079 ZC del Programa de talento innovador de Guangdong colegios y universidades. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Desde hace tiempo se acepta que las inmunoglobulinas (Igs) sólo pueden ser expresados en los linfocitos B maduros y células plasmáticas. Sin embargo, recientemente varios grupos informaron que las Ig también podría ser producida por células de estirpe no linfoides [1], incluyendo las células [2], [3], las células suaves tumorales del tejido [4], neuronas y células gliales del centro y de cáncer humano sistema nervioso periférico [5], oculares epiteliales y células ganglionares [6], las células de espermatogénesis testicular de ratón y células epiteliales del epidídimo [7] y el ratón lactantes células epiteliales de la glándula mamaria [8]. La mayor parte de la investigación se ha centrado hasta ahora en la expresión de Ig en las células cancerosas. La recombinación activación de gen (GAR) también se ha encontrado expresado en células de cáncer tanto en el ARNm y los niveles de proteína y se supone que desempeñar un papel importante en la síntesis de Ig por estas células de cáncer [2], [3], [ ,,,0],9]. Sin embargo, el mecanismo de regulación de la expresión de RAG en células de cáncer aún no ha sido determinada.
Las regiones variables de genes de Ig se componen de una variable (V), una diversidad (D), y una unión (J) segmento de gen, la disposición de que resulta de V (D) J recombinación [10]. Se requiere endonucleasa RAG para la iniciación de la fase de escisión de V (D) J recombinación [11]. RAG consta de dos genes adyacentes, RAG1 y RAG2, que inducen sinérgicamente V (D) J recombinación [12]. Estudios anteriores han demostrado que los ratones deficientes en cualquiera RAG1 o RAG2 fallidos para iniciar V (D) J reordenamiento [13], [14]. proteínas RAG1 y RAG2 juntos se encontró que eran suficientes para escindir sustratos de recombinación en sistemas libres de células [15], [16]. En la expresión en el desarrollo de células B murina RAG se produce en dos ondas y está regulada por una red de factores de transcripción, incluyendo E2A, Ikaros, Pax5β, FoxO1, Foxp1, y NF-kappa B [17]. La primera ola se traduce en la reordenación de la cadena pesada de inmunoglobulina en células pro-B. Y la segunda oleada de expresión RAG conduce al conjunto de la cadena ligera de inmunoglobulina en células pre-B.
Además de los promotores RAG1 y RAG2, el gen RAG tiene también otros elementos reguladores, tales como el potenciador proximal (Ep), el potenciador distal (Ed) y el potenciador del GAR (ERAG) [17], [18], [19], [20], [21], [22]. Se cree que los factores de transcripción mencionados regulan la expresión de RAG mediante la unión a sus secuencias reguladoras correspondientes en las células B. ERAG es la expresión más fuerte promotor de RAG regulación. Orientados supresión de ERAG en la línea germinal de ratón resultó en una disminución de 5 veces a 10 veces en la expresión RAG y un bloque parcial en el pro-B para pre-B de transición [22]. E2A, Ikaros, FoxO1, Foxp1 y NF-kB se muestran todos para activar la expresión del GAR mediante la unión a ERAG en las células B murinas [22], [23], [24], [25], [26]. Pax5β se informó para activar promotor RAG2 en las células B inmaduras [27]. Si estos factores de transcripción se expresan también en las células cancerosas y si tienen funciones de regulación en la expresión de RAG en tales células es digno de investigación.
En este estudio, se analizaron primero las expresiones de proteína y ARNm de los que la transcripción factores que se han encontrado para ser esencial para la activación RAG en las células B, incluyendo E2A (E47 y E12), FoxO1, FOXP1, Ikaros, NF-kappa B, y PAX5β, en cuatro líneas celulares de cáncer. a continuación, se estudió la localización de un número de estos factores de transcripción (E2A, FOXP1, NF-KB y FoxO1) por inmunofluorescencia (IF). Se encontró que E2A, FoxO1 y FOXP1 se expresaron en células de cáncer y localizados en los núcleos de estas células. La sobreexpresión de estos tres factores de transcripción aumentado significativamente la expresión de RAG. la inactivación funcional de los genes de cualquiera de estos tres factores de transcripción de ARN de interferencia disminución de la expresión RAG. En la inmunoprecipitación de la cromatina in vivo (CHIP) ensayo mostró que la histona H3 de ERAG se acetiló y que E2A, FoxO1, FOXP1 se une a ERAG en estas células cancerosas. Estos resultados indican que los factores de transcripción E2A, FoxO1 y FOXP1 activan la expresión de RAG, que es fundamental para V (D) J recombinación, en el cáncer.
Materiales y Métodos
Declaración de Ética
no usamos ningún tejidos humanos o animales en nuestro estudio. Así que no nos pareció que la aprobación ética fue necesario.
Cultivo de células
El cáncer de pulmón humano A549 línea celular, línea celular de cáncer de próstata PC3, las líneas celulares de cáncer de mama MCF-7, MDA- MB-231 y línea celular de linfoma de Burkitt Raji se obtuvieron de la American Type Culture Collection (ATCC). A549, PC3, MCF-7 y MDA-MB-231 células se cultivaron en Dulbecco medio de Eagle modificado (DMEM) con 10% de FBS (Hyclone /Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA). células Raji fueron cultivadas en RPMI 1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA) con 10% FBS a 37 ° C en una atmósfera humidificada con 5% de CO2.
extracción de RNA y RT-PCR
Total se extrajo ARN de las células tumorales utilizando el reactivo Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA) y se trató con RNasa libre de DNasa (Invitrogen) para eliminar el ADN genómico. La transcripción inversa del ARN se realizó utilizando el primer sistema de superíndice ™ III Strand Synthesis (Invitrogen, Carlsbad, CA) siguiendo las instrucciones del fabricante. Para el control negativo, la transcriptasa inversa no se añadió a la mezcla de reacción. PCR convencional o anidada se realizó y los cebadores utilizados en este estudio se enumeran en la Tabla 1. Para Ikaros, que tiene varias isoformas diferentes, PCR anidada se utiliza para aumentar la sensibilidad y para caracterizar mejor las isoformas Ikaros específicos [28]. Las dos isoformas de E2A, E47 y E12 fueron tanto amplificado por PCR.
SDS-PAGE y Western blot
Los lisados celulares se prepararon utilizando tampón RIPA. Alrededor del 40 g de proteína celular total se separó el 5% al 10% en gel de SDS-PAGE. Después de la electroforesis, las proteínas separadas se transfirieron a una membrana de difluoruro de polivinilideno. Los anticuerpos primarios utilizados incluyen RAG1 (K-20), RAG2 (D-20), GAPDH (0411), E2A (Yae), FOXP1 (D35D10), p65 NF-kappa B (F-6), y FoxO1 (H-128 ). FOXP1 anticuerpo se obtuvo de Señalización Celular Tecnología y los otros anticuerpos fueron adquiridos de Santa Cruz Biotechnology. Después de la incubación con los anticuerpos secundarios (de cabra anti-IgG de ratón-HRP o anticuerpo de cabra anti-IgG de conejo-HRP, Santa Cruz), las inmunotransferencias se desarrollaron usando el reactivo de Super ECL Plus de Detección (Applygen Technologies, Beijing) y se expusieron a película de rayos X de acuerdo con el protocolo del fabricante.
inmunofluorescencia
las células se cultivaron en portaobjetos en placas de 6 pocillos y se fijaron en paraformaldehído al 4% durante 15 min a temperatura ambiente. A continuación, los portaobjetos se incubaron con 0,5% de Triton X-100 durante 10 minutos, y se bloquearon durante 1 hora en PBS que contenía 4% de albúmina de suero bovino (BSA). Los anticuerpos primarios incluyen E2A (Yae), FOXP1 (D35D10), p65 NF-kappa B (F-6) y FoxO1 (H-128). La información detallada de estos anticuerpos se muestran en la tabla 2. Isotipo controles se realizaron con el ratón normal o IgG de conejo a la misma concentración que los anticuerpos primarios. Después de incubación a 4 ° C durante la noche y el lavado, los portaobjetos se incubaron con el anticuerpo secundario de cabra anti-IgG de ratón-FITC (señal verde) o de cabra anti-IgG de conejo-TRITC (señal roja) a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de un lavado final, los portaobjetos se montaron con medio de montaje con DAPI (Vector Laboratories, Burlingame, CA) y se examinan bajo un microscopio de fluorescencia (Carl Zeiss).
Plásmidos construcción y transfección
los fragmentos E47 y E12 humanos fueron clonados en un plásmido pIRES2-EGFP mediante la enzima de restricción BglII y EcoRI a partir de plásmidos MigR1-hE47 y MigR1-HE12, respectivamente, que fueron regalos de tipo Dr. Barbara Kee de la Universidad de Chicago. El plásmido pCDNAI /NEO-5'HA-Foxp1A que codificaba la proteína murina Foxp1A fue proporcionado generosamente por el Dr. Philip Tucker, de la Universidad de Texas en Austin [29]. La proteína FOXP1 fue muy conservadas entre las especies humana y murina (más del 90% de identidades), por lo que utilizó este plásmido para nuestro estudio. El pcDNA3-GFP-FoxO1; plásmido AAA se obtuvo de Addgene y fue preparado en el laboratorio del Dr. William Sellers 'como se describe anteriormente [30]. Este plásmido contenía una mutación phosphosite de FoxO1, que como resultado de esto ya no se fosforila por Akt y todavía podría localizarse en el núcleo y activar la transcripción en células transfectadas [31]. Ensayos de transfección transitoria de A549 y células de cáncer de MCF-7 se realizaron utilizando el reactivo de transfección Fugene HD (Roche) según las instrucciones del fabricante.
ARN de interferencia
pequeños ARN de interferencia (siRNA) dirigido contra FoxO1 [32], FOXP1, E2A y control no específica siRNA (GenePharma, Shanghai, china) se transfectaron en A549 y células de cáncer de MCF-7 usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante. Las secuencias de siRNA se enumeran en la Tabla 1.
chip
La cromatina reticulación e inmunoprecipitación se realizaron como se describe anteriormente [23]. Se utilizó el H3 anti-acetil-histona (06-599, Upstate Biotechnology), E2A (Yae), E47 (N-649), FOXP1 (D35D10) o FoxO1 (H-128). Tanto el E2A (Yae) y E47 (N-649) de anticuerpos fueron utilizados en chip para E2A. IgG de conejo normal (sc-2027, Santa Cruz) o IgG de ratón normal (sc-2025, Santa Cruz) se usó como un control negativo. Las secuencias de ADN inmunoprecipitadas se analizaron con PCR y los cebadores se enumeran en la Tabla 1.
Resultados
E2A, FoxO1, FOXP1 y NF-kappa B se expresaron en líneas celulares de cáncer de
RT-PCR mostraron que FoxO1, FOXP1, NF-kB p65 subunidad y ambas de las dos isoformas de E2A (E47 y E12), se expresaron en la A549 células cancerosas, PC3, MCF-7 y MDA-MB-231 (Figura 1). Sin embargo, se detectó ni Ikaros ni PAX5β en estas líneas celulares de cáncer, mientras que ambos pudieran ser amplificadas a partir de células Raji. A nivel de proteínas, E2A, FoxO1, FOXP1 y NF-kB p65 subunidad fueron detectados en las células de cáncer con ensayo de transferencia Western (Figura 2). Basado en el peso molecular, se encontró el FOXP1 longitud completa siendo la principal isoforma de FOXP1 se expresa en las células cancerosas. También confirmó la expresión de RAG1 y RAG2 en estas líneas celulares de cáncer (Figura 2).
18S se utilizó como control interno. Raji se utilizó como control positivo. RNA tratado con DNasa sin añadir transcriptasa inversa se utilizó como control negativo. Se utilizó
celular
Raji como control positivo. GAPDH se utilizó como control interno.
E2A, FoxO1 y FOXP1 se localiza en el núcleo de las células cancerosas
Para estudiar la localización de E2A, FoxO1, FOXP1 y NF-kB en las células cancerosas, SI se realizó con los anticuerpos correspondientes en las cuatro líneas celulares de cáncer. Los resultados mostraron que E2A y FOXP1 se localizaron predominantemente en el núcleo, mientras que NF-kB se localizó exclusivamente en el citoplasma de las células cancerosas (Figura 3). FoxO1 se encontró que trasladar entre el núcleo y el citoplasma, con la ubicación en función de las condiciones de cultivo y el crecimiento. Cuando fueron confluentes de las células, FoxO1 se encuentra principalmente en el núcleo, mientras que era principalmente presente en el citoplasma cuando las células eran escasos. Dado que los factores de transcripción deben ser localizada en el núcleo con el fin de regular la expresión génica, que sólo centramos en E2A, FoxO1 y FOXP1 en la segunda parte de nuestro estudio.
A, se utilizó IgG normal de ratón en lugar de la anticuerpo primario. B, el anticuerpo primario fue de ratón anti-E2A. C, el anticuerpo primario fue de ratón anti-NF-kB p65. De A a C, el anticuerpo secundario fue de cabra anti-IgG de ratón-FITC. D, IgG normal de conejo se utilizó en lugar del anticuerpo primario. E, el anticuerpo primario fue de conejo anti-FoxO1. F, el anticuerpo primario fue de conejo anti-FOXP1. D a F, el anticuerpo secundario fue de cabra anti-IgG de conejo-TRITC. Se obtuvieron resultados similares para el A549, PC3 y líneas de células MDA-MB-231 (datos no mostrados).
El exceso de expresión de E2A, FoxO1 o Foxp1 hasta reguladas expresión RAG
para explorar el efecto de los factores de transcripción E2A, FoxO1 y FOXP1 en la expresión RAG, A549 y células MCF-7 se transfectaron con el vector de expresión para E47, E12, Foxp1A o FoxO1. El vector vacío se utilizó como control negativo. Cuarenta y ocho horas después de la transfección, la proteína total fue extraído para el análisis de E2A, FOXP1, FoxO1 y expresión RAG por ensayo de transferencia Western. Los resultados mostraron que la transfección con el vector de expresión para E47, E12, Foxp1A o FoxO1 aumentó tanto expresiones RAG2 (Figura 4) y RAG1. Estos datos indican que la sobre-expresión de E2A, FoxO1 o Foxp1 regulado hasta la expresión de RAG1 y RAG2 en células MCF-7. Se obtuvieron resultados similares utilizando la línea celular A549 (datos no mostrados).
células MCF-7 se transfectaron con el vector o la expresión factor de transcripción vector vacío pIRES2-EGFP-hE47, pIRES2-EGFP-HE12, pcDNA3- GFP-FoxO1; AAA o pCDNAI /NEO-5'HA-Foxp1A. 48 horas más tarde se recogió la proteína total de células MCF-7 y se analizó por transferencia Western. GAPDH se muestra como un control de carga. Los experimentos fueron repetidos tres veces con resultados similares. Se obtuvieron resultados similares para la línea celular A549 (datos no mostrados).
ARN de interferencia de E2A, FoxO1 o FOXP1 abajo-regulado expresión RAG
Para estudiar más a fondo la función reguladora de E2A, FoxO1 y FOXP1 en la expresión de RAG, las secuencias de siRNA para E2A, FoxO1 o FOXP1 se transfectaron en células A549 y MCF-7. El siRNA no específica se utilizó como control negativo. 48 horas después de la transfección, se extrajo la proteína total para el análisis de E2A, FOXP1, FoxO1 y expresión RAG por el ensayo de Western blot. Transfección se encontró con la secuencia de siRNA para E2A, FOXP1 o FoxO1 para disminuir la expresión de tanto RAG1 y RAG2 (Figura 5), lo que sugiere que el silenciamiento E2A, FoxO1 o genes FOXP1 regula a la baja RAG1 y RAG2 expresiones en células MCF-7. Se obtuvieron resultados similares cuando se utiliza la línea celular A549 (datos no mostrados).
MCF-7 células fueron transfectadas con siRNA de control no específica o secuencia de siRNA para E2A, FoxO1 o FOXP1. 48 horas más tarde se recogió la proteína total de células MCF-7 y se analizó por transferencia Western. GAPDH se muestra como un control de carga. Los experimentos fueron repetidos tres veces con resultados similares. Se obtuvieron resultados similares para la línea celular A549 (datos no mostrados).
E2A, FoxO1 y FOXP1 obligado a ERAG in vivo
En murino células B factores de transcripción E2A, y FoxO1 FOXP1 regular la expresión del GAR mediante la unión a ERAG, el potenciador de regular la expresión génica RAG. Con el fin de investigar si estos factores de transcripción se comportan de manera similar en las células cancerosas, ChIP se realizó en A549 y las células MCF-7. La región ERAG 1 contiene tres sitios de unión para E2A y un sitio de unión para FoxO1 o FOXP1, mientras que la región ERAG 3 no contiene ningún sitio de unión para E2A y un sitio de unión para FoxO1 o FOXP1 [25]. resultados de chip mostraron que la histona H3 de ambos región ERAG 1 y 3 se acetiló, lo que indica que ERAG estaba en un estado abierto o activado. Además, factores de transcripción E2A, FoxO1 y FOXP1 se demostraron estar ligado a la región ERAG 1 pero no a la región 3 (Figura 6). Para ambas líneas celulares se obtuvieron resultados similares.
A, la cromatina reticulado aislado a partir de células MCF-7 se inmunoprecipitó ya sea con IgG de control de isotipo o anticuerpo anti-H3 acetil-histona. Los fragmentos de ADN cromosómicas asociadas se amplificaron con cebadores para la región ERAG 1 y 3. B, el anticuerpo para la inmunoprecipitación era anti-E2A, FoxO1 o FOXP1. Los experimentos fueron repetidos tres veces con resultados similares. Se obtuvieron resultados similares para la línea celular A549 (datos no mostrados).
Discusión
Recientemente, varios grupos de investigación informaron que V (D) J recombinación y expresión RAG se produjeron en las células cancerosas. Sin embargo, el mecanismo de control de estos fenómenos en las células epiteliales es actualmente desconocido. En este estudio, en analogía con el mecanismo molecular de la expresión RAG en las células B, hemos explorado el mecanismo de regulación de la expresión de RAG en las células cancerosas mediante el análisis de los factores de transcripción E2A, Ikaros, PAX5β, FoxO1, FOXP1 y NF-kB. De manera similar a su papel en la activación de la expresión RAG en las células B, se encontró que E2A, FoxO1 y FOXP1 expresión RAG regulado en las células cancerosas mediante la unión a ERAG.
E2A pertenece a la clase I hélice-bucle-hélice (HLH) las proteínas, también conocidas como proteínas E a causa de su capacidad de unirse con alta afinidad con respecto a la secuencia de ADN palindrómica CANNTG, que se refiere como un sitio de caja E [33], [34]. El gen E2A codifica para dos proteínas E, E12 y E47, que surgen a través de corte y empalme alternativo del exón que codifica para el dominio HLH [35]. E12 y E47 son activadores de la transcripción primaria que funcionan, en parte, mediante la contratación de coactivador p300 proteína /CBP, que a su vez recluta histona acetiltransferasas y ARN polimerasa II del promotor o potenciadores de genes diana [36], [37]. E2A se cree que es un regulador clave de la diferenciación de células B mediante la activación de la expresión de RAG y otros genes linfoides B [34]. La sobreexpresión de la E47 ha sido encontrado previamente para activar la expresión RAG1 y transcripción IgH de la línea germinal en los fibroblastos [38]. La expresión ectópica de E2A, junto con RAG1 y RAG2 promovió ambos reordenamientos del gen IGL IgH y en una línea celular de riñón embrionario no linfoide [39], [40]. Nuestra conclusión de que ambas proteínas RAG y E2A se expresaron en células de cáncer contribuye a la comprensión del mecanismo de V (D) J recombinación en células neoplásicas.
FoxO1 y FOXP1 pertenecen a la familia de las proteínas de la caja, que Forkhead contiene un dominio de unión a ADN común (DBD) denomina la caja forkhead o dominio hélice alada [41]. FoxO1 puede trasladar desde el núcleo hasta el citoplasma después de ser fosforilados por Akt. Murino Foxp1 tiene cuatro isoformas empalmados alternativamente, Foxp1A-Foxp1D [29]. La desregulación de la FOXO1 y FOXP1 se ha demostrado en muchos tipos de cáncer [41], [42]. Recientemente, dos estudios demostraron que FoxO1 y Foxp1 regulan la expresión de RAG en las células B murinas [24], [25]. Aquí hemos demostrado que FoxO1 y FOXP1 también tienen la función de regulador en la expresión RAG en las células cancerosas.
En este estudio, nos hemos centrado en un número seleccionado de factores de transcripción y encontraron que E2A, FoxO1 RAG y la expresión regulada en FOXP1 Células cancerígenas. Si existen otros factores de transcripción implicados en la expresión RAG que queda por determinar. Además, si hay más similitudes en la expresión génica entre las células B y las células de cáncer se pueden encontrar usando técnicas de alto rendimiento. Anteriormente, se informó de que la expresión de Ig promovido el crecimiento del tumor y la progresión [2], [43], [44]. En vista de nuestros resultados en los factores reguladores que activan la expresión del GAR, la expresión de Ig en las células cancerosas puede ser controlada por la orientación de los factores de transcripción aguas arriba para evitar que con el tiempo la progresión del tumor.
Reconocimientos
Agradecemos al Dr. Philip Tucker para proporcionar el plásmido pCDNAI /NEO-5'HA-Foxp1A, la doctora Barbara Kee para los plásmidos MigR1-hE47 y MigR1-HE12, y el Dr. William Sellers para el pcDNA3-GFP-FoxO1; plásmido AAA.