Extracto
plasticidad celular regulado por el equilibrio entre el mesénquima de la transición epitelio (MET) y el programa opuesto, EMT, es fundamental en la cascada metastásica. Se conocen varios factores de transcripción (TFS) para regular EMT, aunque los mecanismos de MET no están claros. Demostramos una nueva función de dos TFS, OVOL1 y OVOL2, como inductores críticos del MET en los cánceres humanos. Nuestros hallazgos indican que el control OVOL-TFS conoció a través de un circuito de retroalimentación de reglamentación con EMT-inducir TF ZEB1, y la regulación de mRNA de empalme mediante la inducción de la proteína epitelial que empalma Reguladora 1 (ESRP1). Utilizando modelos de tumores de próstata de ratón nos muestran que la expresión de OVOL-TFS en células de cáncer de próstata mesenquimales atenúa su potencial metastásico. El papel de OVOL-TFS como inductores de MET está respaldada por análisis de expresión en 917 líneas celulares de cáncer, lo que sugiere su papel como reguladores cruciales de la plasticidad de las células epitelio-mesénquima en el cáncer
Visto:. Roca H, J Hernandez , Weidner S, McEachin RC, Fuller D, Sud S, et al. (2013) Factores de Transcripción OVOL1 y OVOL2 inducen la mesenquimal epitelial de transición en el cáncer humano. PLoS ONE 8 (10): e76773. doi: 10.1371 /journal.pone.0076773
Editor: Rakesh K. Srivastava, la universidad del centro médico de Kansas, Estados Unidos de América
Recibido: 12 Abril, 2013; Aceptado: 28 Agosto 2013; Publicado: 4 de octubre 2013
Derechos de Autor © 2013 Roca et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo recibió el apoyo de U54-CA163124, CA143055-U01, P50-CA69568 y CA093900-PO1 de los Institutos nacionales de Salud. KJP se admite como Profesor de Investigación Clínica Sociedad Americana del Cáncer y como Taubman de Investigación Académico de la Universidad de Michigan. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Más del 90% de las muertes relacionadas con el cáncer resultan de metástasis [1]. En consecuencia, debemos mejorar nuestra comprensión de los mecanismos que impulsan la progresión del cáncer y la metástasis. Transición epitelial a mesenquimal (EMT), y el proceso inverso de MET, son programas cruciales que participan en la cicatrización de heridas y el desarrollo de órganos temprana [2]. EMT y MET también pueden desempeñar un papel fundamental tanto en la progresión del cáncer y el establecimiento de colonias metastásicas [3]. Cuando las células cancerosas se someten a EMT, adquieren la capacidad de disociar del tumor primario y entrar en la circulación. Estas células circulantes son entonces capaces de difundir y sometidos a MET, lo que resulta en tumores metastásicos. La comprensión de esta plasticidad fenotípica es una clave para impedir la progresión del cáncer [4].
EMT está vinculado a alteraciones en la expresión génica y la morfología y se asocia con la regulación a la baja de las proteínas de adhesión celular, tales como E-cadherina (E-cad ). Este proceso permite que las células de cáncer para disocian de sus vecinos al tiempo que aumenta su motilidad [5]. Se ha propuesto que la EMT está regulada por bucles de retroalimentación recíproca entre ZEB1 /ZEB2 TFS y los miembros de la familia microARN miR-200 [6,7]. En concreto, ZEB1 puede inducir EMT por la represión de las proteínas epiteliales y por la regulación negativa de sus propias miR-200 represores. Al mismo tiempo, miR-200 reprimen ZEB1 así como los factores de células madre y los reguladores epigenéticos implicados en la EMT. Se cree que estos bucles de retroalimentación recíproca son responsables, en parte, por la plasticidad fenotípica exhibida en el cáncer y la metástasis [4].
Otras proteínas pueden servir como reguladores /inductores de la EMT o biomarcadores potenciales para las células mesenquimales. La inducción de EMT se ha asociado con la expresión de TGF [8]. En parte, esto se produce a través de la regulación positiva de ZEB1 /2, que, a su vez, inhibe las proteínas reguladoras de empalme epiteliales (ESRP) [9]. Regulación a la baja de ESRP, y la represión resultante del splicing alternativo, se ha demostrado ser crucial en EMT. Por ejemplo, en el cáncer de mama, la represión de ESRP resulta en un cambio en la expresión de isoforma de CD44 que es crítica en la inducción de EMT y la progresión del cáncer [10].
A pesar de nuestro conocimiento cada vez mayor con respecto a EMT, los mecanismos de mediación MET son mucho menos entendido. El uso de dos modelos de próstata y cáncer de mama células mesenquimales, descubrimos que TFS OVOL1 (OVO-como 1, Entrez Gene ID 5017) y OVOL2 (Identificación de genes 58495) se asocian con MET en nuestros modelos, así como en otros tipos de cáncer. OVOLs son TFS de dedos de zinc que actúan como reguladores de la embriogénesis [11-13]. Primero analiza cómo OVOLs control de la expresión de la EMT que inducen TFS y PRAS. Luego estudió cómo se conocieron, inducida por el OVOL-TFS, se correlaciona con los factores clave del desarrollo de las células epiteliales en las líneas celulares 917 cancerosas que se ajusten a la célula cancerosa humana Enciclopedia [14], y se investigaron las implicaciones de MET en la regulación de las células del cáncer invasión y metástasis.
resultados
células mesenquimales estables aisladas de las células epiteliales de cáncer de próstata estables co-cultivadas con macrófagos
Para estudiar los mecanismos de la EMT en la metástasis del cáncer de próstata en primer lugar generado un modelo de línea celular epitelial derivada de células epiteliales positivas luciferasa PC3 de cáncer de próstata. Hemos aislado una subpoblación de células que expresan luciferasa que mostró un fenotipo epitelial estable en la cultura y los designó PC3-Epi. Se seleccionaron estas células en base a dos criterios: la intensidad bioluminiscente y la morfología de las células epiteliales. Coherente con el estado del epitelio, las células PC3-Epi mantiene alta E-cad, bajo vimentina, y la expresión indetectable de la ZEB1 EMT-activador (Figura 1A y 1B)
(A) en fase brillante microscopia:. Morfología cambios en las células mesenquimales PC3-EMT1, PC3-EMT12 y PC3-EMT14 en comparación con las células de cáncer de próstata PC3-Epi epiteliales. Las barras de escala son 200 micras
(B) por inmunotransferencia:.. La expresión de marcadores de EMT en líneas celulares de cáncer mesenquimal PC3-EMT1, -EMT2, -EMT12, -EMT14 y -EMT17 comparación con epitelial PC3-Epi
(C) de microarrays: La expresión génica análisis comparando mesenquimal a epitelial líneas celulares de cáncer. Diagrama de Venn-I (VD-I) representa una firma EMT-asociado común expresado en las líneas de cáncer mesenquimal PC3-EMT1, -EMT12 y -EMT14 comparación con epitelial PC3-Epi. VD-II -. Génica firma del VD-I se cruzó con la firma de ZEB1 células silenciadas PC3-EMT1 y -EMT14 utilizando el shRNA-sh4, con relación a trepar (SCR) de control shRNA
(D) Brightness la microscopía de fase: las células PC3-EMT14 transfectadas con ZEB1-shRNAs: SH2, sh4 o SCR. Las barras de escala son 100 micras
(E) por inmunotransferencia:.. La expresión de marcadores de EMT en PC3-EMT1 y -EMT14 transfectadas con shRNA ZEB1-Scr en comparación con los controles o no transfectadas
(F ) mapa de calor: 50 genes identificados en la firma VD-II (grupo C). upregulated genes están en rojo, regulado por disminución en azul. Plegables cambios en las células de cáncer mesenquimales son en relación con epitelial PC3-Epi, y en las células transfectadas SH4 son en relación con el control Scr.
Las inmunotransferencias mostrados son representativos de dos experimentos independientes con resultados similares. Véase también la figura S1 y el cuadro S1.
A continuación desarrollamos un modelo mesenquimales a partir de células PC3-Epi, a través de la interacción con los macrófagos. La hipótesis de que esto sería posible debido a que los macrófagos representan uno de los principales celulares infiltrados inflamatorios en el microambiente tumoral y que han sido implicados en la metástasis [15,16]. Co-cultivo de monocitos CD14 + tratados con IL-4 (M2-macrófagos) con PC3-Epi durante cuatro días indujo fuertes alteraciones morfológicas consistentes con la EMT, con disminución concomitante en la expresión de E-cad y el aumento de vimentina (Figuras S1A y S1B). A partir de estas células se aislaron subpoblaciones mesenquimales designados como PC3-EMT1, PC3-EMT2, PC3-EMT12, PC3 y PC3-EMT14-EMT17. Estas células mesenquimales demostraron una alteración sorprendente fenotípica y la expresión de ZEB1, que se mantuvo de forma estable en cultivo (Figura 1A y 1B). En comparación con los PC3-Epi las células mesenquimales epiteliales parentales expresadas niveles más bajos de la adhesión celular epitelial EpCAM molécula; sin embargo, todavía alrededor de 45% de las células expresó EpCAM en la superficie celular como se demostró por citometría de flujo (Figura S1C).
Para evaluar la expresión de genes relacionados con cambios EMT se realizó tres análisis de microarrays, comparando PC3-EMT1, PC3 y PC3-EMT12-EMT14 a la PC3-Epi. Se identificaron una firma de 867 genes que muestran cambios en la expresión (por 2 veces o más) en las tres comparaciones, (VD-I, la Figura 1C). Utilizamos Ingenuity Pathway Analysis (Ingenuity Systems, www.ingenuity.com) para determinar las funciones moleculares más enriquecidos significativamente asociados con esta firma: 'movimiento celular "," el crecimiento celular y la proliferación', 'la señalización y la interacción célula-célula y la muerte celular 'son consistentes con la EMT (Tabla S1). ZEB1, que fue upregulated en las tres comparaciones, ha sido ampliamente implicado en EMT y el mantenimiento del estado mesenquimales [2,7]. Otros EMT inductor de factores de transcripción como caracol, barra o TWIST1, frecuentemente implicados en la tumorigénesis y metástasis [2], no fueron identificados entre la firma EMT común de 867 genes descrito anteriormente. Por lo tanto para entender el papel de ZEB1 en el programa de células EMT, transfectadas dos líneas mesenquimales (PC3 y PC3-EMT1-EMT14) con uno de los dos vectores de lentivirus ZEB1-shRNAs: SH2 y SH4, más el control mezclado (SCR). En concordancia con el papel de ZEB1 en EMT y el mantenimiento del estado mesenquimales, el silenciamiento de ZEB1 inducida MET en PC3-EMT1 y PC3-EMT14, con los cambios correspondientes en la morfología celular (Figura 1D). Por otra parte, SH2 y SH4 indujo una disminución notable en ZEB1, correspondiente a la regulación positiva de E-cad (Figura 1E). Estos experimentos sugieren fuertemente un papel esencial de ZEB1 en el estado EMT de estas células. Cuando el conjunto de genes expresados diferencialmente en células SH4 transfectadas se corresponde con la firma EMT (VD-I), encontramos los cambios de expresión en 50 genes que se correlacionan con MET transformación (VD-II, la Figura 1C). Esta firma mostró regulación opuesta cuando las células fueron transfectadas con sh4 ZEB1-shRNA, en relación con el control mezclado (Figura 1F). Este enfoque también identificó un conjunto de 4 TFS regulación a la baja de manera significativa en las células mesenquimales y regulados positivamente por ZEB1-shRNA:. IRF6, ANKRD22, EHF y OVOL2
OVOL1 y OVOL2 regular MET en el modelo de cáncer de próstata
Teniendo en cuenta los cambios observados en la expresión de IRF6, ANKRD22, EHF y OVOL2 en EMT, así como la retroalimentación observada entre ZEB1 y estos TFS, especuló que las características de EMT estable que se mantiene durante la propagación de PC3-EMT1 y células PC3-EMT14 son el resultado de un bucle de retroalimentación reguladora. Igualmente, dado que estos genes se downregulated en la EMT, la sobreexpresión de ellos puede inducir MET. Se evaluó el papel de cada uno de los 4 TFS upregulated individualmente por la transducción de células PC3-EMT14 con construcciones que sobreexpresan lentiviral. La expresión de estos 4 TFS en las células EMT demostró que OVOL2 apareció para regular MET, como se observa por un cambio en la morfología celular. Dados los fuertes paralelismos entre OVOL2 y OVOL1, así como aparente papel de OVOL2 en MET, que considera, además, si OVOL1 puede tener un papel en la economía de mercado. Aunque OVOL1 no cumplió con el umbral de 2 veces para ser incluido en la firma microarrays de genes de las células desmontables ZEB1, el análisis qPCR mostraron que es altamente aumentada en las células PC3-Epi epiteliales y siguiendo ZEB1 silenciamiento en comparación con el PC3- mesenquimales EMT14 (Figura 2A y la Figura S2A). Por lo tanto, también se examinó la expresión de OVOL1 en las células PC3-EMT14 mesenquimales. La sobreexpresión tanto de OVOL1 y OVOL2 indujo una marcada transformación de la morfología celular y un aumento paralelo en la expresión de E-cad (Figura 2B y 2C). Además, ambos OVOLs aumento de expresión de ESRP1 (Figura 2C, panel izquierdo) [17]. Por qPCR que luego analizaron los cambios en la expresión de varios factores de transcripción que induce EMT: ZEB1, ZEB2, caracol, barra y TWIST1 (Figura 2 C, panel derecho). Entre estos factores ZEB1, ZEB2 y Slug revelaron una disminución significativa en la expresión, que se correlaciona con MET. Se confirmó que los cambios de expresión observados en OVOL1 y OVOL2 corresponden a cambios en los niveles de proteína por Western blot (Figura 2D). Por último, comparamos lisados celulares de OVOL1 y las células que sobreexpresan a OVOL2-PC3-Epi, PC3-EMT14-EV, y las células que sobreexpresan el TFS IRF6 y ANKRD22, también regulado por ZEB1 (Figura 1F). Rescate de E-cad y la pérdida de vimentina fueron inducidos en las células que sobreexpresan OVOL, mientras que ningún cambio significativo se observó en las células que expresan otra TFS (IRF6 y ANKRD22) (Figura 2E). Aunque qPCR refleja un cambio significativo en la expresión de Slug, el occidental no mostró un cambio en el nivel de proteínas en las células que sobreexpresan OVOL, lo que sugiere que la regulación de traducción podría desempeñar un papel en los niveles de Slug. De los cinco TFS ensayados, estos resultados indican que OVOL1 y OVOL2 son inductores clave de MET en estas células
(A) qPCR:.. La expresión de ARNm en PC3-EMT14-sh4 en relación con PC3-EMT14-Scr
(B) en fase brillante microscopía: las células PC3-EMT14 expresan OVOL1 y OVOL2 exhiben un fenotipo epitelial en comparación con la parental PC3-EMT14. Las barras de escala son 100 micras
(C) qPCR:. La expresión de los marcadores de células epiteliales E-cad y ESRP1, y las células PC3-EMT14 EMT inductores de TFS ZEB1, ZEB2, Slug, caracol, y en TWIST1 expresando OVOL1 y OVOL2 en relación con el vacío de control de vectores (EV)
(D) por inmunotransferencia:.. OVOL1 y OVOL2 expresión de la proteína en las células transfectadas se confirmó mediante el uso de OVOL1 o V5-anticuerpos específicos, respectivamente
(e) por inmunotransferencia: Expresión de marcadores epiteliales e-cad y marcadores mesenquimales ZEB1 y vimentina. Los cambios en la expresión de Slug fueron mínimas y no se correlacionaron con el primero. células PC3-EMT14 que expresan IRF6 o ANKRD22, EV y epitelial PC3-Epi son controles
(F) La invasión de ensayo /migración:. Representante imágenes y gráficos de invasión de células cancerosas usando un ensayo de cámara de Boyden. Los gráficos de barras de OVOL1 y OVOL2 que expresan las células PC3-EV EMT14 relativa. Porcentaje invasión representa la relación invasor /migración de las células. La gráfica es representativa de uno de cada tres experimentos independientes
(G) qPCR:. La expresión de células PC3-Epi-transfectadas con OVOL1 shRNAs (a, b, c) o OVOL2-shRNA (d, e, f), en relación con el control no silenciar PC3-Epi-NS (representado por la línea discontinua)
(H) por inmunotransferencia:.-células PC3 transfectadas con Epi tanto OVOL1 y OVOL2 shRNAs (sh-OVOL1 /2) demuestran una disminución de la e-cad y aumento de la vimentina, lo que sugiere una transformación parcial EMT
(I) Esquema:. el promotor ZEB1 con los posibles sitios de unión OVOL2 (triángulos de color naranja) de acuerdo con el consenso general: 5'-A (A /T) (T /A) (C /A) (T /C) GTTA (T /A). TaqMan diseñado pares de cebadores se muestran como flechas negras. Numeración es respecto al sitio de inicio de la transcripción (+1). La secuencia de un sitio de unión putativo OVOL2 que corresponde al DNA chip en las células que expresan OVOL2 está en 320
(J) ChIP qPCR:. (Izquierda) muestra la cromatina de entrada de PC3-EMT14-OVOL2 en relación con EV, y demuestra que se utilizaron cantidades similares de ADN (derecha). representa el DNA chip usando anticuerpo OVOL2. Los cebadores se nombran después de su primer adelante (véase el panel I). Los resultados se normalizaron a los controles de entrada. El gráfico muestra un experimento representativo de tres con resultados similares.
Resultados
qPCR se normalizaron a ß-actina. Los gráficos muestran la media +/- SEM; los valores de p se representan como * p & lt; 0,05; ** P & lt; 0,01; *** P & lt; 0.001. Los qPCRs y inmunotransferencias son representativos de dos experimentos independientes con resultados similares. Véase también la figura S2.
Para entender la implicación de MET mediada por OVOL en el potencial invasivo de las células PC3-EMT14 mesenquimales, se utilizó cámara de Boyden ensayo sobre células que sobreexpresan OVOL1 /2. Ambos OVOLs afectaron significativamente la capacidad de invasión de PC3-EMT14. En el caso de OVOL1, se observó la migración reducida de células, que afectó a la relación de la invasión vs. migración (índice de invasión) (Figura 2F). las células que sobreexpresan OVOL2 demostraron una disminución significativa tanto en la invasión y la migración, con un índice de invasión muy reducido. Estos resultados apoyan el papel de OVOL1 y OVOL2 en la disminución de la migración y la invasión, como se esperaba para MET reprogramado células.
Se utilizó próxima shRNAs para OVOL1 (shOVOL1-A, -B, -C) y OVOL2 (shOVOL2- d, e, f), para reducir su expresión en células PC3-Epi epiteliales (Figura 2G). Ninguno de los shRNAs afectó la expresión de E-cad. Sin embargo, en las células con expresión disminuida OVOL2, se observó una regulación positiva significativa (hasta 3 veces) de ZEB1 mRNA. Estos resultados sugieren que un cambio 3 veces en la expresión ZEB1 no es suficiente para inducir EMT en células PC3-Epi. Por otra parte, como se observa por qPCR, la expresión de ZEB1 es más de 20 veces mayor en PC3-EMT14 comparación con las células PC3-Epi (Figura S2A). Por otra parte, dada la función similar de OVOL1 y OVOL2 en la inducción de MET es tentador especular que podrían sustituir uno por el otro. Esto puede explicar por qué una caída de tan sólo uno de los OVOL no es suficiente para inducir un cambio significativo en E-cad. Para probar esta posibilidad se realizó un doble caída con shRNAs para cada uno de los OVOL-TFS. Aunque no selección de las células transfectadas fue posible (ambas construcciones shRNA expresan GFP), una población total de células transfectadas con shOVOL1-a y shOVOL2-d (shOVOL1 /2-a /d) demostró una regulación positiva significativa de la vimentina y una disminución parcial en E-cad en comparación con las células de control PC3-Epi-NS (Figura 2H). En general, estos resultados sugieren un papel crítico de ambos OVOLs en el mantenimiento del estado epitelial de estas células y por lo tanto, una doble caída sería requerida para inducir y mantener el estado mesenquimales. En consecuencia, una mayor caída de OVOL1 y OVOL2 induciría una transformación más completa EMT en las células cancerosas.
Otros experimentos en células de cáncer de próstata inducidos a someterse a EMT llevaron a conclusiones similares en relación con la regulación de la OVOL y ZEB1 TFS. Por ejemplo, la proteína transmembrana Tetraspanin-8 (TSPAN8) fue identificado en la firma se muestra en la Figura 1F como un gen upregulated en células EMT y downregulated por ZEB1-shRNA. La sobreexpresión de TSPAN8 en las células PC3-Epi y DU145 epiteliales condujo a la transformación parcial EMT caracterizado por la regulación al alza de ZEB1 y la regulación a la baja de la TFS OVOL en ambas líneas celulares (Figura S2 B-E).
Un represor transcripcional función de OVOL2 se había demostrado en los queratinocitos, donde OVOL2 reprimida c-Myc y Notch1 [18]. Dado que la expresión ZEB1 aumentó significativamente en las células con una disminución de OVOL2 (Figura 2G), hemos probado si OVOL2 interactúa directamente con el promotor ZEB1. Se realizó la inmunoprecipitación de la cromatina (CHIP) de orientación del promotor ZEB1 en las células control PC3-EMT14-OVOL2 y con dos anticuerpos, anti-OVOL2 y anti-V5-tag. Hemos diseñado cebadores 7 TaqMan y sondas que abarcan el promotor -4848 a 530 pb (Figura 2I) y encontramos varios posibles sitios de unión OVOL2: 5'-A (A /T) (A /T) (C /A) (T /C) GTTA (T /A) [18]. Con ambos anticuerpos, se observó sobre el enriquecimiento de 50 veces para el mismo /sonda de posición de imprimación (+ 382 /+ 530) al comparar OVOL2 que expresan y las células control (Figura 2J y la Figura S2B). Por el contrario, la cromatina de entrada de ambos tipos de células mostró amplificación similar con todos los pares de cebadores. Estos resultados indican la unión específica de OVOL2 al promotor ZEB1 en la región 325, donde se identificó un sitio consenso OVOL2 (Figura 2I). Además, puesto que ningún fragmento de la cromatina específica se amplificó con -115 /+ 29 cebadores, es poco probable que OVOL2 se une al sitio 115, otro sitio potencial en la región proximal (Figura 2I). Fragmento 123 - (- 115) = 238 pb es significativamente menor que 530 - (115) = 415 pb; pero aproximadamente el mismo tamaño como + 530 - (325) = + 205 pb. Por lo tanto, una unión al sitio 115 implicaría un menú desplegable específica de un fragmento de la cromatina que debe ser detectada con los -115 /+ 29 cebadores. Junto con los datos de expresión de shRNA y, estos hallazgos sugieren que OVOL2 actúa como un represor transcripcional directa de ZEB1.
Las células mesenquimales forman tumores mesenquimales in vivo
Para determinar el potencial tumorigénico de PC3-EMT12 y PC3-EMT14, se inoculó por vía subcutánea ratones inmunodeficientes GSN. Ambas líneas celulares de cáncer mesenquimales forman predominantemente de tipo mesenquimal tumores caracterizados por una baja E-cad y de alta ZEB1, mientras que los tumores PC3-Epi mostraron una alta E-cad y expresión ZEB1 baja (Figura S3 A). Vimos diferencias significativas en las tasas de crecimiento del tumor entre los grupos (Figura S3B). Para evaluar el potencial metastásico de las células mesenquimales, se utilizó el modelo de ratón de la inyección intracardíaca (ICI) de la metástasis del cáncer [19]. Hemos observado más ratones con metástasis en múltiples sitios en los grupos inyectados con células PC3-EMT14 (Figura 3A) o PC3-EMT12. También mostraron una mayor carga tumoral total (aproximadamente un orden de magnitud) y disminución de la supervivencia de los ratones, en comparación con los ratones inyectados con células PC3-Epi parentales (Figura 3B y la Figura S3C). La tinción simultánea con E-cad y ZEB1 anticuerpos demostró que los tumores PC3 y PC3-EMT12-EMT14 metastásicos muestran características típicas mesenquimales (baja E-cad y de alta ZEB1), mientras que los tumores metastásicos de células PC3-Epi muestran predominantemente características epiteliales (alta E- cad y baja ZEB1) (Figura 3C y Figura S3D-e). Nuestros hallazgos sugieren que las células mesenquimales (PC3 y PC3-EMT12-EMT14) forman metástasis que mantienen el fenotipo mesenquimal. Notablemente, algunos tumores metastásicos de células PC3-Epi exhibieron tanto mesenquimales y epiteliales características, aunque la mayoría de los tumores PC3-Epi demostró el fenotipo epitelial (Figura 3C). La Figura 3C muestra un ratón inyectado con células PC3-EPI, donde un tumor en el fémur izquierdo fue predominantemente de tipo mesenquimal, mientras que el tumor en la derecha muestra un fenotipo altamente epitelial. Es importante destacar que, encontramos plasticidad de las células mesenquimales-epitelial similar en un tumor metastásico aislado del fémur de un paciente con cáncer de próstata avanzado. IHC tinción de secciones de tumores con E-cad y ZEB1 anticuerpos mostró regiones con tanto altamente epitelial (E-cad alta, baja ZEB1) y con características mesenquimales (baja E-cad y de alta ZEB1) (Figura 3D).
(a) Metástasis:. El porcentaje de ratones inoculados-ICI con múltiples señales de luciferasa a los 21 y 35 días
(B) La carga tumoral: Los ratones recibieron ICI y se obtuvieron imágenes de la semana durante 35 días. La expresión de luciferasa se representa como regiones de interés (ROI-fotones /s)
(C) IHC:. simultánea ZEB1 y tinción E-cad de metástasis detectadas en el fémur y el hígado de PC3-Epi o PC3-EMT14 los ratones inyectados. células Tenga en cuenta el mesenquimales (ZEB1
alta /E-cad
bajos) (flechas negras) y epiteliales (ZEB1
baja /E-cad
alto) (flechas verdes) de cáncer, que representa la EMT /plasticidad se reunieron en subpoblaciones de PC3-Epi y PC3-EMT14. Las barras de escala son 100 micras (negro) y 20 micras (rojo)
(D) IHC:. ZEB1 o E-cad tinción de la metástasis del fémur de un paciente con cáncer de próstata avanzado. Tenga en cuenta el mesenquimales-como (ZEB1
(flechas negras altas) /E-cad
(flechas amarillas bajas)) y epitelial (ZEB1
baja /E-cad
altas (flechas verdes)) el cáncer Células. Las barras de escala que se muestran representan 100 micras (barra de color negro) y 50 m (barra roja)
(E) Metástasis:.. El porcentaje de ratones inoculados-ICI con múltiples señales de luciferasa a los 21 y 35 días
(F) La carga tumoral: Los ratones recibieron ICI y se obtuvieron imágenes por semana durante 35 días. La expresión de luciferasa se representa como regiones de interés (ROI-fotones /s)
(G) IHC:. ZEB1 o E-cad tinción de metástasis en ratones-ICI. Tenga en cuenta la mayor E-cad y expresión ZEB1 menor en las células metastásicas expresan OVOL1 o ZEB1-shRNA (SH4). La barra de escala representa 100 micras
Los gráficos muestran la media +/- SEM.; los valores de p fueron calculados y representados como * p & lt; 0,05; ** P & lt; 0.01. Todas las imágenes IHC son representativos de una de cada tres secciones que muestran resultados similares. Ver también la figura S3.
Según los resultados que se muestran en la Figura 2B-E, el efecto de la sobreexpresión OVOL1 es similar a OVOL2. Ambos inducen MET y ZEB1 regulación a la baja. Además ZEB1-shRNA induce la expresión de tanto OVOL1 y OVOL2 y MET en las células PC3-EMT14 mesenquimales (Figura 2A). Para dilucidar el papel de OVOL TFS en el potencial metastásico de las células, se inocularon los ratones a través de ICI con células epiteliales que sobreexpresan OVOL1 (PC3-EMT14-OVOL1), ZEB1-shRNA (PC3-EMT14-sh4) o el control mezclado (PC3- EMT14-SCR). Se evaluó la progresión tumoral mediante bioluminiscencia y observamos que el trato de economía inducida en células PC3-EMT14 reducido significativamente el potencial metastásico. Tanto ZEB1-shRNA y expresión OVOL1 redujeron el número de ratones con metástasis de tumores en múltiples sitios (Figura 3E). Además, la carga general del tumor se redujo significativamente en comparación con los ratones inyectados con las células control PC3-EMT14-Scr (Figura 3F). IHC tinción de los tumores metastásicos con E-cad y ZEB1 reveló que MET se había producido en las células tumorales que expresan OVOL1 o ZEB1-shRNA, como se indica por E-cad positivo y rebajado expresión ZEB1 en contraste con las células de control mesenquimales (Figura 3G). inducida por OVOL
MET reduce el potencial metastásico de las células cancerosas mesenquimales
Para investigar más a fondo el potencial metastásico de las células que expresan OVOL, se utilizó un modelo ortotópico murino de cáncer de próstata [20]. En el análisis de bioluminiscencia, vimos una carga semejante total del tumor (ROI) en todos los grupos (Figura 4A). Veintiocho días después de la inoculación, el número de ratones con metástasis fue significativamente menor en el grupo inyectado con las células que expresan OVOL (Figura 4B y 4C). Hemos resecado tumores primarios de los 42 días después de la inoculación, registraron sus pesos, y se analizaron las secciones del tumor por IHC. pesos de los tumores de próstata ortotópico fueron significativamente mayores en los ratones inoculados con PC3-EMT14-OVOL2, mientras que los ratones inyectados con células PC3-EMT14 control mostraron los pesos más bajos (Figura 4D). La disminución observada en el potencial metastásico de células que expresan OVOL en nuestro modelo se correlaciona con un informe anterior muestra que los ratones con tumores de próstata ortotópico más grande tenía una carga metastásica [20]
(A) La carga tumoral reducida:. La expresión de luciferasa se representa como regiones de interés (ROI-fotones /s) en ratones con inyecciones ortotópico
(B) Metástasis:. (izquierda) el porcentaje de ratones inoculados ortotópicamente con múltiples señales de luciferasa a los 21 y 28 días (derecho ). representa el número total de metástasis por grupo dividido por el número de ratones (n) por grupo a los 28 días
(C) Imaging:. Imágenes representativas de la expresión de luciferasa en ratones 28 días después de recibir inyecciones ortotópico. . Metástasis de cada grupo se encierran en un círculo rojo en cualquiera de las imágenes ventral o dorsal y la exclusión de las personas sospechosas de corresponder a un mismo tumor
(D) Peso del tumor: El peso medio de los tumores ortotópico (próstata) resecados a los 42 días (n = 4)
(e) IHC:. e-cad, y la tinción ZEB1 de los tumores metastásicos en ratones que recibieron inyecciones ortotópico de cada grupo inoculado con las células que expresan OVOL o el control PC3-EMT14. Tenga en cuenta la mayor E-cad y expresión ZEB1 menor en las células cancerosas que expresan OVOL. La barra de escala representa 100 micras. La IHC muestra una tinción representativa de uno de cada tres secciones con resultados similares
Los gráficos muestran la media +/- SEM.; los valores de p fueron calculados y representados como ** p & lt; 0.01. Véase también la figura S4.
IHC tinción de los tumores reveló que los tumores PC3-EMT14 (ortotópico y metástasis) son predominantemente mesenquimales y son en su mayoría negativos para la expresión de E-cad y positivo para ZEB1 (Figura 4E y Figura S4A). Estas células mesenquimales pueden proliferar y formar metástasis. Esto se demuestra además por Ki67 tinción positiva de las células negativas E-cad en secciones de tumores metastáticos de ratones PC3-EMT14 (Figura S4B). Aunque no podemos excluir la posibilidad de MET transitoria seguida de la EMT, estos hallazgos sugieren que las células mesenquimales no necesitan someterse a MET para colonizar el tumor. En contraste, las células que expresan OVOL formaron tumores ortotópico y metástasis con un fuerte fenotipo epitelial, caracterizados por una alta expresión de E-cad y bajaron ZEB1; lo que sugiere fuertemente que el OVOL-TFS inducir y estabilizar MET en estas células (Figura 4E y la Figura S4A).
OVOL TFS orquestar un programa transcripcional y empalme-regulador que induce MET en células de cáncer humano
a continuación buscamos resultados consistentes utilizando matrices de ADNc de tejido a partir de secciones de tumores de cáncer de próstata humanos (n = 40), mediante la evaluación de la expresión de e-cad, OVOL1, y OVOL2. Para demostrar la correlación entre E-cad y OVOL-expresión se normalizó cada valor muestra el valor promedio de todas las muestras tumorales. Se observó fuerte correlación entre E-cad y OVOL1 (r = 0,66) y OVOL2 (r = 0,7) en todos los tejidos de tumor de próstata analizadas (Figura 5A)
(A) qPCR:. ADNc de cáncer de próstata primario humana tejidos (n = 40; Origene) se analizaron para la expresión de e-cad, OVOL1 y OVOL2. Los resultados se normalizaron a beta-actina y se muestran con relación a la media de todas las muestras de cáncer para cada gen como:.
log ((Valor del gen (X) para una muestra) /(valor del gen (X ) para el cáncer de media)). Los valores de la muestra se muestran en los gráficos de puntos y la correlación de OVOL1 o expresión OVOL2 con E-cad se calculó (r). El gráfico muestra un experimento representativo de dos con resultados similares
(B) diagrama de Venn:. Representa los resultados de RNA-seq de genes expresados diferencialmente comunes en el OVOL células y PC3-Epi que expresan, en relación con PC3- EMT14. La intersección de A y B representa una firma transcripcional epitelial común de 277 genes. Los datos de RNA-seq se analizó a partir de al menos dos repeticiones biológica para cada línea celular
(C) Punto de parcela:. Expresión análisis de correlación de los 277 genes identificados en la firma del epitelio del panel (B). La correlación se representa entre el PC3-Epi, PC3-EMT14-OVOL1 o PC3-EMT14-OVOL2
(D) diagrama de Venn:. Compara los resultados del panel (B) con los genes que se correlacionan con la expresión de la OVOLs en 917 líneas celulares de cáncer humano. De los 129 genes que se correlacionaron (r & gt; 0,5) con la expresión OVOLs en las líneas celulares de cáncer de 917, 67 genes son inducidos por la expresión de tanto OVOL1 y OVOL2 en PC3-EMT14 (C intersección D)
(E) mapa de calor: el análisis ConceptGen del 67-gen firma desde el panel (D) reveló una lista de 18 genes anotados con funciones relacionadas con el estado de las células epiteliales
Tabla (F): 45. genes correlacionados negativamente con la expresión OVOL2 (r & lt; -0,5) a través de 917 líneas celulares de cáncer. Entre estos 45 genes, el 10 se muestra también son downregulated por la expresión OVOL2 en PC3-EMT14. §§2.086.13/4.812.91/2.31+NM_016351ADAM221.000.400.4+NM_014324AMACR5.292.350.45+NR_036556ANKRD540.9900+NM_001010986ATP11C4.321.500.35+NM_174957ATP2A30.2600+NR_024597C11orf7300.46INF+NM_001001389CD440.395.1313.20+NM_001185177CES300.31INF+NM_203356CTAGE50.550.130.24+NM_001085460CTNND112.895.420.42+NM_133375DIS3L1.5000+NM_004432ELAVL21.450.370.26+NM_001135023ELMOD3*0.352.497.06+NM_001135022ELMOD3*3.761.850.49+NM_203343EPB4100.97INF+NM_001184939EPB41L5*1.493.662.47+NM_020909EPB41L5*1.740.620.36+NM_017848FAM120C1.860.920.5+NM_001015045FAM13A3.331.560.47+NM_001134456FAM55C5.552.650.48+NM_000802FOLR10.060.325.44+NM_001018100GCOM11.144.523.96+NM_001193322IKBKE0.9000+NM_016291IP6K26.1000+NM_177535_1MAGED4B9.113.070.34+NM_145687MAP4K422.7410.810.48+NM_001042453MST400.31INF+NM_022764MTHFSD1.670.750.45+NM_203318MYO18A2.385.782.43+NM_001098623OBSCN0.220.673+NM_001128629PAK63.016.252.07+NM_001166109PALLD1.846.803.69+NM_001146105PARP95.5311.412.06+NM_001184917PCYT21.103.142.85+NM_153321PMP2213.015.040.39+NM_182948PRKACB3.740.900.24+NM_001164758PRKAR1B*1.404.293.06+NM_001164759PRKAR1B*5.132.190.42+NM_002840PTPRF1.696.523.85+NM_144489RGS35.161.430.28+NM_138484SGOL100.41INF+NM_001135054SIGIRR15.506.130.4+NM_020428SLC44A2*5.8922.833.88+NM_001145056SLC44A2*28.715.320.19+NM_001104590SLFN111.800.600.33+NM_001184749SLITRK40.280.090.32+NM_001128210SPRED24.300.370.09+NM_001198531TCF7L22.050.740.36+NM_001167912VEPH14.4100+NM_014667VGLL42.556.172.41+NM_139119YY1AP12.084.912.36+NM_001145448ZNF2000.500.150.3+Table 0,01; 0.001.