Extracto
Los xenoinjertos de cáncer colorrectal humano (CRC) en ratones inmunodeficientes tienen un gran potencial para acelerar el estudio de la biología del tumor y la terapia. Evaluamos xenoinjertos establecidos en ratones NOD /SCID /IL2Rγ ratones nulos de los tumores primarios o metastásicos de 27 pacientes con CCR para estimar su capacidad de expansión de las células tumorales para
in vitro
estudios en y para evaluar la fidelidad con que recapitulan la el perfil transcripcional de sus tumores parentales. análisis de RNA-seq de CRC tumores humanos parentales y sus derivados xenoinjertos demostró que los cambios transcripcionales reproducibles caracterizan el tumor humano a la transición de xenoinjerto murino. En la mayoría, pero no todos los casos, el estroma, la vasculatura, y elementos hematopoyéticos humanos se sustituyeron sistemáticamente por análogos murinos mientras que el componente carcinoma persistió. Una vez establecida como xenoinjertos, CRC células humanas que podrían ser propagados por el trasplante de serie se mantuvo estable transcripcionalmente. Tres xenoinjertos histológicamente atípicos, establecidas a partir de pacientes con metástasis peritoneales, contenían elementos del estroma abundante humanos y los vasos sanguíneos además de las células tumorales humanas. La transcriptomes de estos xenoinjertos de tumores /estromales mezcladas no se parecen mucho a las de sus tumores parentales, y los intentos de propagar tales xenoinjertos de trasplante de serie no tuvieron éxito. La expresión estable de numerosos genes previamente identificados como objetivos de alta prioridad para la inmunoterapia se observó en los linajes más de xenoinjertos. También se observó la expresión aberrante en las células de CRC de los genes humanos que normalmente sólo se expresan en células hematopoyéticas. Nuestros resultados sugieren que las células expandidas CRC humanos en xenoinjertos murinos tienen gran utilidad para los estudios de inmunología tumoral y terapias dirigidas, como inmunoterapia, sino también identificar posibles limitaciones
Visto:. Chou J, Fitzgibbon MP, Mortales C-LL, Towlerton AMH, Upton MP, Yeung RS, et al. (2013) y fenotípica de la transcripción Fidelidad de Colon-derivados de los pacientes xenoinjertos de cáncer en ratones inmunodeficientes. PLoS ONE 8 (11): e79874. doi: 10.1371 /journal.pone.0079874
Editor: Tim Cheung Siu, Universidad de Hong Kong, Hong Kong
Recibido: 22 de abril de 2013; Aceptado: September 26, 2013; Publicado: noviembre 20, 2013
Derechos de Autor © 2013 Chou et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por una beca postdoctoral en la inmunología del cáncer del Instituto Irvington del Instituto de Investigación del cáncer (JC) (www.cancerresearch.org), el Fondo de Edson J. Orin para la inmunoterapia, un premio científico clínico en la investigación translacional (# 1007475) a partir de el Fondo Burroughs Wellcome (EHW) (www.bwfund.org), una subvención del Departamento de Defensa (W81XWH-12-0349) (MPF y MWM) (cdmrp.army.mil), y subvenciones del NCI /NIH: SAIC contrato#HHSN261200800001E (MPF y MWM), U01 CA176270 (MWM y EHW), y DK56465 P30 (a B. Torok-Storb) (www.nih.gov). Los proveedores de fondos no tiene función alguna en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
recién resecados cánceres colorrectales primarios y metastásicos (CRC) [1], [2], al igual que muchos otros tipos de hematológicas y tumores sólidos humanos, se pueden establecer como xenoinjertos en ratones inmunodeficientes, como el NOD /
SCID
/IL2Rγ - /- (NSG) cepa y propagado a largo plazo a través de un trasplante de serie. xenoinjertos CRC proporcionan un sistema modelo atractivo en el que estudiar la biología del tumor y la terapia. En contraste con la CRC líneas celulares establecidas a partir de tejidos quirúrgicos frescas a menudo pierden sus características importantes de los tumores humanos de los padres una vez que se han adaptado a, y se han propagado en,
in vitro Francia culture, los pacientes derivados de xenoinjertos CRC reproducen muchas de las características fenotípicas y genotípicas de los tumores parentales de los que se derivan [1] - [17]. Análisis de xenoinjertos CRC derivados del paciente ha avanzado profundamente nuestra comprensión de la arquitectura del tumor, la heterogeneidad, y otros aspectos críticos de la biología del tumor. xenoinjertos CRC también tienen un excelente potencial para su uso como sistemas modelo en el cual explorar la terapia con agentes quimioterapéuticos [9] - [13], [17], así como nuevas formas de tratamiento CRC objetivo, tales como la inmunoterapia [11], [17], [18]. Además, la capacidad de propagar CRC humano en ratones inmunodeficientes potencialmente puede proporcionar un suministro renovable de células de CRC para el uso en
in vitro
estudios en.
Las diferencias entre los tumores CRC humanos y su derivado xenoinjertos, sin embargo, sí existen. Lo más significativo es la observación constante que xenoinjertos CRC son apoyados por murina, en lugar de ser humano, estroma [7], [9], [15], [16]. En consecuencia, los xenoinjertos CRC ofrecen la oportunidad de evaluar el transcriptoma de células de carcinoma humano separado de la de su estroma humano de apoyo. transcripcional análisis profundo de xenoinjertos de CRC, por tanto, puede ayudar con la interpretación de los análisis publicados de la transcripción CRC tumores humanos recién resecados, que representan una mezcla de ambos estroma humano y carcinoma [19], [20]. La medida en que la interacción con estroma murino y las influencias vasculatura el perfil transcripcional de las células tumorales humanas en el xenoinjerto no se ha examinado hasta la fecha con los métodos que permiten la discriminación inequívoca entre las transcripciones humanos derivadas de las células tumorales y las transcripciones murinos derivados de la estroma y vasculatura. Por ello, realizó un estudio exhaustivo de los perfiles de la morfología y de la transcripción de un panel de xenoinjertos establecidos en ratones GSN de los cánceres de colon humanos primarios y metastásicos recién resecados, para evaluar la fidelidad con que los xenoinjertos recapitulan los perfiles de transcripción y las características moleculares únicas del parental tumores humanos de la que se derivaron. El análisis de la transcripción se realizó con ARN-seq, que permite la determinación del origen humano o murino de las transcripciones con un alto grado de confianza. Para evaluar la estabilidad de estas características a través de trasplante de serie, también se realizó el análisis de la transcripción detallada de un linaje de xenoinjerto que se estableció a partir de un solo tumor de colon humano primario y, posteriormente, se ha propagado a través de diez generaciones de receptores GSN. Se determinó que los xenotrasplantes de tumores de colon humanos se caracteriza por biológico reproducible y cambios transcripcionales que caracterizan a la humana a la transición murino, que en la mayoría de los casos seleccionar para una población tumor transcriptionally estable con el apoyo de estroma murino y la vasculatura. Además, hemos identificado conjuntos de genes expresados selectivamente en las células epiteliales (carcinoma) o componentes del estroma de xenoinjertos de CRC.
Materiales y Métodos
Declaración de Ética
muestras quirúrgicas de primaria o cáncer colorrectal metastásico se obtuvieron de donantes sin identificación a través de la Red Cooperativa de Tejidos Humanos (CHTN, Universidad de Vanderbilt, Nashville, TN), o de sujetos que se está tratando en la Universidad de Washington (UW) Medical Center (Seattle, WA) que dieron su escrito el consentimiento informado de acuerdo con un protocolo aprobado por el Comité de Revisión Institucional del Centro de Investigación del cáncer de la UW /Fred Hutchinson (FHCRC) Consorcio de cáncer. La investigación de muestras humanas se llevó a cabo de acuerdo con los principios expresados en la Declaración de Helsinki. Este estudio se llevó a cabo en estricta conformidad con las recomendaciones que se encuentran en la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio, 8
ª edición (Consejo Superior de Investigaciones Científicas, National Academies Press). El protocolo fue aprobado por el Comité de Cuidado y Uso de Animales institucional del FHCRC. Toda la cirugía se realizó bajo anestesia tribromoetanol, y se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento.
transporte y procesamiento de muestras de tejido
especímenes de cáncer colorrectal metastásico recién resecado del tumor y /o tumores primarios obtenidos de la CHTN (23 pacientes únicos, 24 especímenes) o localmente (27 pacientes únicos, 33 muestras) se colocaron en medio de transporte que consta de medio DMEM /F12 (Hyclone) suplementado con 10 g /ml de ciprofloxacina (Bayer), 1% de penicilina /estreptomicina ( 10000 U /ml de penicilina, 10 mg /ml de estreptomicina) (Invitrogen), y 0,5 mg /ml de anfotericina B (Invitrogen). Ellos fueron enviados durante la noche en hielo para procesar el día siguiente (tumores CHTN) o transportado dentro de una hora para el procesamiento en el mismo día (tumores UW). Pequeñas porciones de cada tumor se congelaron rápidamente o se colocan en RNAlater (Life Technologies) y también colocado en formalina. El saldo de cada tumor se enjuagó con solución salina tamponada con fosfato (Invitrogen), después se redujo a una suspensión de células individuales a través de disrupción mecánica, y la digestión enzimática durante 1-2 horas en el medio de transporte DMEM /F12 basado en suplementado con 4,66 mg /ml de heparina de sodio (Sigma), 2% de suplemento B27 (Invitrogen), y 5% de reemplazo KnockOut suero (Invitrogen), 1 mg /ml de colagenasa I (Sigma), 0,1 mg /ml de hialuronidasa, y 0,1 mg /ml de ADNasa I (Worthington Biochemical) . células digeridas se lavaron con medio libre de enzima y se resuspendieron en 30 a 50 l de Matrigel (BD Biosciences) antes de la inyección.
xenoinjertos primarios se establecieron mediante la inyección de suspensiones de células individuales (1 × 10
4-2 × 10
6 células) preparadas a partir de especímenes de cáncer colorrectal, ya sea bajo la cápsula renal [21] (a partir de n = 14 pacientes únicas) y /o por vía subcutánea en los flancos (n = 46 pacientes) de 6 a 12 semanas de edad o γ-irradiados subletalmente femenina (250 cGy en 20 cGy /min) NSG ratones criados en el Centro de Investigación del cáncer Fred Hutchinson. El intervalo entre la resección quirúrgica y la inyección de ratón era de 24-30 horas para los tumores de colon obtenidos de la CHTN y 3-6 horas para los tumores obtenidos localmente. Cinco muestras de tumores digeridos fueron enriquecidos para CD133
+ células antes de la inyección, el uso de perlas magnéticas conjugadas con anticuerpo anti-CD133 (Miltenyi Biotec) según las instrucciones del fabricante. Los ratones que llevan progresivamente se les permitió tumores ampliación para sobrevivir hasta que los tumores alcanzaron un diámetro de 2 cm, que manifiestan signos de sufrimiento, o que sufrieron 20% de pérdida de peso, momento en el que se sacrificaron para la cosecha tumor. Piezas de xenoinjerto cosechadas fueron inmediatamente se congelaron rápidamente o se colocan en RNAlater, colocado en formalina para histología posterior, y se colocan en medio de transporte y se procesan de una manera idéntica al tumor humano original para el trasplante en serie en otro host NSG.
la inmunohistoquímica y microscopía
fijados con formalina, secciones de tejidos embebidos en parafina de las muestras de cáncer de colon resecado o xenoinjertos se prepararon para microscopía de tinción con hematoxilina y eosina o con anticuerpos contra el antígeno leucocitario humano (HLA) de clase I (MBL Corporation), antígeno carcinoembrionario (CEA) (Novus), citoqueratina 20 (CK20) (Dako), Ki-67 (Dako), CD31 (Dako), células epiteliales molécula de adhesión (EPCAM) (Novus), E-cadherina (Cell Marque ), muerte programada-1 (PD1) (Cell Marque), vimentina (Dako), fibronectina (Dako), CD4 (Novacastra), CD8 (Novacastra), y CD3 (Novacastra) según las instrucciones de los fabricantes. Los controles positivos y negativos se realizaron para cada anticuerpo. Las láminas fueron vistos en un microscopio Nikon E800 Eclipse, y las imágenes fueron adquiridas con una cámara Olympus SP Magnafire y el software Magnafire (Optronics).
Citometría de Flujo
una única suspensión celular preparada a partir de un xenotrasplante deriva de D61540.T2 se tiñó con Qdot 525 nanocristal (Invitrogen) para la diferenciación de células vivas y muertas, isotiocianato de fluoresceína (FITC) y conjugado con anti-PD-1 de anticuerpos (BD Biosciences), y ficoeritrina (PE) conjugado con anti-CTLA-4 anticuerpos (BD Biosciences). Los datos fueron adquiridos en un flujo FACSCanto II citómetro (BD Biosciences) y se analizaron con el software de Kaluza (Beckman Coulter).
RNA-seq Preparación de la muestra y secuenciación
ARN fue extraído de muestras usando RNeasy Plus Mini o AllPrep RNA /kits de ADN (QIAGEN). La calidad del ARN se evaluó en un Agilent 2100 Bioanalyzer. Las muestras con número integridad del ARN (RIN) superior a 7 se diluyeron a 50 ng /l para la preparación de la biblioteca de secuenciación con el Kit de Preparación de la muestra TruSeq (iluminación). A partir de aproximadamente 1 g de ARN total, el ARNm se aisló con perlas de captura oligo-dT, a continuación, fragmentados y se convirtió a cDNA con transcripción inversa cebada con hexámeros al azar y el segundo capítulo de síntesis. Los ADNc resultantes se fragmentaron mediante ultrasonidos y tamaño-seleccionados para las moléculas de ~ 300 pb. a continuación, se realizó la ligadura de los adaptadores de secuenciación con código de barras de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Las muestras de cDNA se sometieron a secuenciación multiplex, con uno a cuatro muestras por carril, en el Illumina HiSeq 2000 para producir secuencias de fin de emparejado 50 pb. Este proceso produjo entre las secuencias de 54,6 M y 367,0 M pasar los Illumina filtros de control de calidad predeterminados.
PCR cuantitativa
células criopreservadas de P2726.Ov se procesaron con un kit de eliminación de Dead Cell (Miltenyi Biotec) y luego ordenados en EPCAM
- y EPCAM
+ fracciones con perlas magnéticas conjugadas con anticuerpo EpCAM humano específico (Miltenyi Biotec). Se extrajo ARN de cada fracción, y el ADNc se preparó utilizando oligo-dT y cebadores hexámeros aleatorios del kit de síntesis de ADNc de primera cadena (Roche). Los cebadores 5 'y 3' para la PCR cuantitativa (qPCR) fueron diseñados utilizando ya sea qPrimerDepot [22] o Primer-BLAST [23] (Tabla S1 en S4 File). Standard SYBR Green (Roche) qPCR realizado en un ABI Prism 7900HT se utilizó para detectar las transcripciones de genes. Los datos de fluorescencia fueron analizados en LinRegPCR [24], y la concentración de partida estimada (N
0) de cada gen se normalizó frente a la de limpieza de genes
GAPDH
. El origen humano de los amplificados de PCR de xenoinjertos fue verificada por análisis de la curva de disociación.
ARN-ss Análisis de Datos
Para cada muestra, todo se combina lee pasa por los filtros de calidad fueron procesados con el splice- TopHat conscientes corto alineador de lectura [25]. Para las muestras de xenoinjertos, que empleó una estrategia simple filtrado conservadora para separar humana lee, que surge de las células tumorales humanas injertadas, a partir de lecturas espera que sea muestreado del tejido de sostén murino ratón. En esta estrategia, se utilizó TopHat para alinear lee a los conjuntos de referencia del genoma de ratón (mm9) humana (hg19) y. Lee que hacía juego con el genoma humano con mayor fidelidad (menor número de bases no coincidentes) fueron retenidos como lee humano. Aquellos que hacía juego con el genoma del ratón con la mayor fidelidad se retuvieron como murino. Lee búsqueda de ambos genomas con la misma fidelidad se colocaron en una tercera clase "ambigua" y no se considera aún más. Para permitir la comparación útil entre muestras tumorales humanos (clasificado por la construcción de la contaminación de las secuencias del ratón) y xenoinjertos derivados, se procesaron las muestras humanas a través de la misma tubería de filtrado. Menos del 0,2% de lecturas de estas muestras exclusivamente humanos fueron marcados erróneamente como productos originarios de ratón, lo que sugiere que nuestra estrategia de filtrado tiene una tasa de errores de clasificación baja. La Tabla 1 resume el rendimiento de la secuenciación, que van desde por lo menos 5 a más de 30 GB GB por muestra, junto con el porcentaje de lecturas en cada muestra clasificado como humano, ratón, o ambigua. son los datos de secuenciación disponibles en el NCBI secuencia de lectura del archivo (# de acceso: SRP028952).
Gene nivel leer conteos se generan a partir de humanos y de ratón alineado lee utilizando el paquete HTSeq (http: //www- huber.embl.de/users/anders/HTSeq). Leer los recuentos se generaron con el guión htseq recuento para cada locus del gen humano y el ratón en una unión de la RefSeq y UCSC KnownGenes colecciones asociado con el hg19 humanos y asambleas MM9. Lea completamente contenida dentro de cualquier exón del gen de un modelo fueron atribuidas a ese gen. Los recuentos de lectura para cada gen se normalizaron dividiendo por el número total de lecturas, en millones, obtenido para esa muestra.
Análisis estadístico
El análisis estadístico se llevó a cabo en el entorno R de estadística la informática y Microsoft Excel. Sin supervisión análisis de agrupamiento jerárquico de los datos de expresión génica se realizó utilizando el entorno de R estadística. La bordeadora paquete 3.0.2 [26] se utilizó para identificar los genes que son expresados diferencialmente en dos o más muestras. dispersiones Tagwise se calcularon para cada gen utilizando el método de modelo lineal generalizado, y pruebas de coeficiente de probabilidad se calcularon entre pares de conjuntos de la muestra. Los genes con tasas de falso descubrimiento de & lt; 0,05 después del ajuste Benjamini-Hochberg [27] para comparaciones múltiples se definieron como diferencialmente expresado. conjuntos de genes sobre o sub-representados entre los genes expresados diferencialmente se identificaron utilizando el paquete R goseq 1.10.0 [28], con la vía canónica y química y perturbaciones genéticas conjuntos de genes de la base de datos de firmas moleculares (MSigDB) v3.0 [29] . El método de distribución hipergeométrica Wallenius no central se utiliza para aproximar la distribución de los miembros del conjunto de genes entre los genes expresados diferencialmente.
curvas de crecimiento de los tumores se ajustaron a la ecuación con el tiempo de duplicación define como y bondad de ajuste medido por el coeficiente de determinación R
2. Se utilizó la prueba exacta de Fisher de dos colas para las comparaciones de los datos categóricos entre dos grupos, mientras que dos colas se utilizó la prueba t de Student para la comparación de datos cuantitativos entre los dos grupos.
Resultados
Experiencia con la generación de CRC y Difusión de xenoinjertos
una de las ventajas de los xenotrasplantes es que potencialmente proporciona un método para propagar células CRC indefinidamente y fielmente reproduce el tumor humano de los padres originales. Hemos tratado de desarrollar un protocolo que lograría lo más eficientemente posible este objetivo. Subletal ratones irradiados NSG fueron inyectados con suspensiones de células individuales preparadas a partir de muestras tumorales sin intervenir prolongada
in vitro Francia culture que potencialmente podrían ser seleccionados para ser adaptaciones que no están presentes en el tumor humano original. Un total de 33 de 57 muestras quirúrgicas obtenida a partir de 27 de los 50 pacientes individuales, ya sea con locorregional y /o metastásico CRC (Tabla S2 en S4 de archivos) se establecieron con éxito como xenoinjertos.
Inicialmente, la inyección de células tumorales CRC enriquecido antes de la implantación de células que expresan el putativo CRC vástago marcador de células CD133
+ se comparó con la inyección de mayor, las células tumorales no clasificados para el establecimiento de xenoinjertos porque el primero se ha asociado con una mayor probabilidad de injerto [1], [2] . Siempre que sea posible, el número máximo de CD133
+ - células clasificadas o mayor, se inyectó células no clasificadas que se pueden obtener a partir de un tumor, a una dosis de hasta 2 × 10
6 células. Aunque la inyección de 1 x 10
4 CD133
+ - células clasificadas eran en algunos casos suficiente para el establecimiento de un xenotrasplante (cuadros S2 y S3 en S4 de archivos), las tasas globales de injerto para CD133
+ - Ordenado las células no fueron significativamente mejores que para granel, células no clasificadas (2/5 vs. 25/45, respectivamente). Dado que tanto CD133
- y CD133
+ células de tumores CRC metastásico tienen el potencial para establecer xenoinjertos [6], y, con el fin de capturar la heterogeneidad del tumor humano original tanto como sea posible, la decisión fue hecho de utilizar células tumorales CRC sin clasificar con xenotrasplantes en todos los experimentos posteriores. También comparamos la implantación de células tumorales bajo la cápsula renal con la implantación subcutánea, en vista de los informes publicados de altas tasas de injerto de las células de CRC después de la inyección de la cápsula infra-renal [1]. Cuando las inyecciones simultáneas de un número igual de células de CRC de la misma tumor se realizaron en el flanco y bajo la cápsula renal de 3 ratones diferentes, los tumores subcutáneos resultantes eran mucho más grandes que los que se desarrolló en el riñón. Por otra parte, la inyección subcutánea de las células en el flanco se asoció con una mayor tasa de establecimiento de xenoinjerto de inyección subcapsular (3/14 vs. 26/45, p
= 0,03 por la prueba exacta de Fisher de dos colas) (Tablas S2 y S3 S4 en archivos), y se asoció con una menor morbilidad y la mortalidad temprana, con las muertes tempranas en ≤1 semana que ocurre en 14 de 30 ratones que recibieron inyecciones subcapsulares y 6 de 208 ratones que recibieron implantes subcutáneos sola (
p
= 0,0001).
sobre la base de estas observaciones preliminares, la inyección subcutánea de a granel, se utilizan células de CRC no clasificados en el flanco en todos los experimentos posteriores para establecer xenoinjertos de CRC. Los xenotrasplantes establecidos de esta manera se analizaron retrospectivamente las características que podrían estar asociados con el injerto preferido. No hubo correlación significativa entre el éxito y el injerto de las características clínicas de los pacientes de los que se obtuvieron los tumores (Tabla S4 S4 en archivos). el sexo del paciente de sexo masculino se asoció con una tendencia hacia el injerto superiores (
p
= 0,06). La media del número de células inyectadas en el éxito y los intentos fallidos de injerto fue significativamente diferente -1.2 × 10
6 (rango: 2 × 10
5-2 × 10
6) células en inyecciones exitosas vs. 8,8 x 10
5 (rango: 1 × 10
4-2 × 10
6) en los intentos fallidos (
p
= 0,04)
xenoinjertos de serie se establecieron a partir. 18, de 26 de primera generación, 11 de cada 14 de segunda generación, y 8 de cada 8 xenoinjertos de tercera generación. Algunos xenoinjertos no se hicieron pasar debido al pequeño tamaño (≤ 1 mm de diámetro), la muerte inesperada del ratón antes de la cosecha del tumor, o la falta de disponibilidad de los ratones receptores del GSN. De los 26 xenoinjertos de primera generación para la cual se intentó pasos en serie, los que habían demostrado un crecimiento exponencial mostraron una mayor tasa de injerto en la segunda generación de los que no lo hicieron (16/20 vs 2/6, respectivamente,
p
= 0,05), y ninguno de los xenoinjertos que no lograron mostrar un crecimiento exponencial podrían ser pasados con éxito más allá de la segunda generación. Todas las líneas de xenoinjerto que se hicieron pasar más allá de la segunda generación produjo considerables tumores & gt; 5 mm, y puede crecer hasta el tamaño máximo permitido tumor de 2 cm. Un tumor primario de colon (D55949) y un tumor metastásico (P2726) estaban ambos en serie trasplantado a través de 10 generaciones. La amplificación del número de células de tumor humano hecho posible por los xenoinjertos fue en la mayoría de los casos al menos 50 veces de la dosis de células original para cada generación, lo que permite la expansión rápida y eficaz de las células de CRC.
Histología de los tumores y CRC sus derivados xenoinjertos
la mayoría de los xenoinjertos de primera generación demostraron la morfología glandular de forma variable con componentes epiteliales y del estroma bien definidas, se asemeja a los tumores humanos parentales (PHTS) a partir del cual se derivaron (Figuras 1 y la figura S1 figura S2). expresión homogénea de clase I humano complejo mayor de histocompatibilidad se observó (MHC) en todas las muestras quirúrgicas CRC evaluados en este estudio, independientemente de su derivación de tumores primarios o de lesiones recurrentes /metastásicos. La expresión de la clase I humana MHC en xenoinjertos de primera generación, sin embargo, mostró dos patrones distintos. Todos los xenoinjertos de primera generación derivadas de los tumores de colon primarios y todos menos tres de los derivados de lesiones recurrentes /metastásicas mostraron expresión homogénea de clase I humana MHC en los componentes epiteliales, pero la ausencia de expresión en los componentes del estroma (Figuras 1 y Fig S1 Fig S2 ), lo que sugiere que el estroma en estos xenoinjertos era de origen murino, como ha sido previamente informado [7], [9]. Estos xenoinjertos serán referidos como xenoinjertos de carcinoma (CXS). En contraste, los xenoinjertos de primera generación derivan de tres pacientes diferentes (P2726, P2750 y P2825) eran predominantemente del estroma en la morfología y mostró la expresión de clase I humana MHC tanto en sus componentes epiteliales y del estroma, lo que demuestra que el estroma en estos xenoinjertos estaba en menos parcialmente compuesta de células humanas (Figuras 1 y Fig S3). Los tres de estos pacientes tenían propagación de la enfermedad peritoneal. Estos xenoinjertos de estroma (SXS) se derivaron de las metástasis peritoneales de pacientes P2750 y P2825 y del fluido ascitis maligna de P2726 paciente, de cuyo ovario metástasis múltiples linajes CX con la composición típica de tumor humano /murino estroma también se generaron. La tinción inmunohistoquímica con anticuerpos específicos para vimentina humana, una proteína del estroma, confirmó la presencia de abundante vimentina humana en los tres SxS, mientras que la tinción con anticuerpos E-cadherina-específicos humanos revelaron que las células tumorales epiteliales comprendían una pequeña fracción de células en estas SXS ( las figuras 1 y Fig S3)
Cada fila de (a) -. (C) comprende microfotografías de secciones de tejido de un solo tumor humano parental o de xenoinjerto murino. (A) la columna de la izquierda: las secciones de tejido teñidas con hematoxilina y eosina (H + E). Las columnas siguientes, de izquierda a derecha: secciones de tejidos teñidos para la clase humana antígeno leucocitario I (HLA-ABC), marcadores epiteliales E-cadherina, vimentina marcador mesenquimal, PECAM1 marcador endotelial, y el marcador de células T CD3. Las filas, de arriba a abajo, muestran las características histológicas de los tumores humanos de los padres de D61540, P2726, P2750 y, a la par con sus xenoinjertos de primera generación. La histología del xenoinjerto estroma predominante desarrollado a partir de fluido de ascitis P2726 se muestra también en la quinta fila; la flecha blanca en la micrografía E-cadherina en esta fila indica un pequeño foco de células tumorales. Las puntas de flecha en la micrografía PECAM1 para el xenotrasplante P2750.Tu.X1 indican áreas con células PECAM-1-inmunorreactiva. Todas las imágenes se obtuvieron a 200 aumentos. barra blanca escala en la micrografía superior izquierda representa 200 micras.
La inmunohistoquímica (IHC) también demostró que los vasculatures de CXS y SxS, al igual que con sus elementos estromales, eran de origen divergente. Un subconjunto de tumores humanos parentales emparejados con sus primeros xenoinjertos de generación se examinaron para la expresión de la molécula humana de plaquetas endoteliales de adhesión celular (PECAM-1; CD31), que se expresa selectivamente en las células endoteliales humanas y subconjuntos de células hematopoyéticas. se observó inmunoreactividad para PECAM-1 humano en todos los PHTS, como se esperaba, pero no en sus CXS derivados. Tanto de los SxS, sin embargo, demostraron expresión de PECAM-1 humano, aunque la distribución de células PECAM-1-inmunorreactivas humanos en el SXS era algo irregular y no recapitular perfectamente la distribución de este tipo de células que se observa típicamente en los PHTS ( las figuras 1 y Fig S3). La presencia de estroma humano en SxS, pero su ausencia en el CXS se reflejó en un patrón similar de expresión CD3 humano. IHC reveló que CXS no lo hizo, en general, contiene células que se tiñeron con anticuerpos frente a CD3 y CD8 humana, en consonancia con la pérdida de CD3 humano infiltrante
+ y CD8
+ células de xenoinjertos de sus derivados. Sorprendentemente, ambos de los SxS, sin embargo, las células que expresan CD3 humano y CD8 y eran células T humanas residuales más probables que habían sido co-inyectados con el inóculo de células tumorales contenida, persistió en los SxS, y se infiltró los xenoinjertos de manera más extensa que TIL de la PHT (Figuras 1 y Fig S3, y datos no mostrados).
las características histológicas de CXS secundarias y la posterior generación eran, en general, bastante similares a los de las anteriores CXS generación a partir de los cuales se derivaron . El componente epitelial de la mayoría de los linajes CX mantiene expresión robusta de ambos EpCAM y CEA a través del trasplante de serie y el número y distribución de las células que expresan Ki-67 estable igualmente mantenido (Figura S2A). El estroma y la vasculatura de estos linajes CX fueron consistentemente negativos para la expresión de clase I humana MHC (Figura S2A), lo que sugiere que estaban de forma estable con el apoyo de estroma y los vasos sanguíneos murinos.
Análisis transcripcional Global de tumores y xenoinjertos de cáncer colorrectal
RNA-seq se utilizó para definir la humana y, por xenoinjertos, perfiles murino de transcripción de muestras de cáncer de colon 4 -2 tumores primarios y 2 tumores metastásicos, 11 xenoinjertos establecen a partir de estas muestras de tumores, y una muestra de la normalidad de colon adyacente a uno de los tumores metastásicos (P2750) (archivos S1 y S2). Para evaluar la reproducibilidad de análisis de RNA-seq de muestras de cáncer de colon y sus derivados xenoinjertos, se compararon los perfiles de transcripción de las dos mitades de un tumor de colon primario dividido en dos desde D61540 paciente. Este análisis reveló estrecha correlación (Pearson coeficiente r = 0,985) entre los niveles de expresión de todos los genes humanos en las dos mitades de la muestra (Figura 2 A). Se observó una correlación parecida apretado (r = 0,975) entre los perfiles de transcripción de las metástasis de ovario y de epiplón sincrónicamente resecados pero no contiguas de P2726 paciente (Figura 2A).
Gráficos de dispersión muestran los recuentos normalizados de transcripción (en conteos por millón) para los genes humanos individuales en las dos muestras que se indican en el
x CD - y
y
-axes. cruces rojas indican los genes de limpieza de consenso [50]. genes de limpieza no se indican por círculos violeta o triángulos amarillos: círculos violeta representan los genes expresados en un cierto nivel en ambas muestras, y triángulos amarillos a lo largo de los ejes representan los genes expresados en una muestra pero no el otro. El coeficiente de correlación de Pearson en todos los genes para cada comparación por pares se indica en negro encima de la esquina superior izquierda de cada parcela; la correlación para el subconjunto de genes de limpieza se indica en rojo. La línea diagonal es el lugar geométrico de los puntos por los que x = y. (A) Las comparaciones del nivel de expresión de genes humanos en las dos mitades de la tumor colorrectal bisecado de D61540 (panel izquierdo) y en la metástasis de ovario y omental de P2726 (panel derecho). (B) Las comparaciones del nivel de expresión de los genes humanos en tres tumores humanos parentales (D61540.T2, P2726.Ov, y P2750.Tu, de izquierda a derecha) y en sus xenoinjertos de primera generación (D61540.T2.X1, P2726 .Ov.X1, y P2750.Tu.X1). (C) Comparación de los niveles de expresión de genes humanos en el xenoinjerto estroma predominante atípica establecido a partir de P2750 y en su xenoinjerto de primera generación. (D) Media cinética de crecimiento de CXS (n = 5) derivado de las metástasis de ovario y de epiplón de P2726 (P2726.Mets.X1) están indicadas por los diamantes negros conectados por la línea gruesa, en comparación con la cinética de crecimiento de la SX derivados de el líquido ascítico de P2726 (P2726.As.X1) indicada por los cuadrados grises conectados por la línea gris. Todos los xenoinjertos se establecieron mediante la inyección de 2 × 10
6 células en el flanco de un ratón GSN. Tabla S1. Tabla S2. Mod. Tabla S3. Mod. Tabla S4. Tabla S5.