Extracto
Von Hippel-Lindau supresor de tumores (VHL) se pierde en la mayoría de células claras carcinomas de células renales (ccRCC) . Folliculin (FLCN) es un supresor de tumores cuya función se perdió en el síndrome de Birt-Hogg-Dubé (BHD), un trastorno que se caracteriza por el cáncer renal de varios tipos histológicos incluyendo el carcinoma de células claras, fibrofoliculoma cutánea y neumotórax. Aquí hemos explorado si existe conexión entre la BVS y FLCN en líneas celulares de carcinoma de células renales y tumores. Se demuestra que la BVS regula la expresión de FLCN en los niveles de ARNm y de proteína en líneas celulares de RCC, y que la expresión de proteínas FLCN se reduce en tumores humanos con ccRCC
VHL
pérdida, en comparación con el tejido renal normal correspondiente. Desmontables de resultados FLCN en aumento de la formación de tumores por células de RCC con de tipo salvaje BVS en xenoinjertos ortotópico en ratones desnudos, una indicación de que FLCN juega un papel en la actividad supresora de tumor de VHL. Curiosamente, FLCN, de manera similar a VHL, es necesario para la actividad de programa autophagic LC3C mediada que hemos caracterizado previamente como una contribución a la actividad supresora de tumor de VHL. Los resultados muestran la existencia de interferencia funcional entre dos grandes supresores tumorales en el cáncer renal, BVS y FLCN, que convergen en la regulación de la autofagia
Visto:. Bastola P, Y Stratton, Kellner E, O Mikhaylova, Yi Y, Sartor MA, et al. (2013) folliculin Contribuye al tumor VHL supresión de la actividad en el cáncer renal mediante la regulación de la autofagia. PLoS ONE 8 (7): e70030. doi: 10.1371 /journal.pone.0070030
Editor: Rajvir Dahiya, UCSF /VA Medical Center, Estados Unidos de América
Recibido: 16 de abril, 2013; Aceptado: June 14, 2013; Publicado: July 29, 2013
Derechos de Autor © 2013 Bastola et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Myrovlytis Confianza , Beca de investigación; NIH /NCI CA122346; BLR & amp; D VAmerit AwardB101BX0011100-02; UC-P30 ES006096CEG. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
El cáncer renal supone un 2% a un 3% de todos los tumores malignos de adultos en los EE.UU.. En 2011 se registraron más de 64.770 nuevos casos y 13.000 muertes, y la incidencia está aumentando de manera constante en un 2,5% por año. ccRCC representa la mayoría (85% a 90%) de los cánceres de riñón adultos y es la forma más maligna. Este tipo de cáncer se caracteriza por una pérdida temprana de supresor de tumor VHL en el brazo corto del cromosoma 3 en la mayoría de los tumores (80%). Está bien establecido que la pérdida de los resultados de la BVS en aumento de la acumulación y la actividad del factor de transcripción inducible por hipoxia (HIF), que a su vez activa la expresión de genes que promueven el crecimiento del tumor. Entre ellas se encuentran los factores angiogénicos, que conducen a un aumento del flujo sanguíneo a través de los tumores, mejorando así el suministro de nutrientes y oxígeno a las células cancerosas. Los genes que estimulan la glucólisis anaeróbica también se activan, y esto apoya la adaptación a la reducción de la disponibilidad de nutrientes y los cambios de las células cancerosas hacia las vías metabólicas que promueven el crecimiento del tumor. Recientemente, hemos descubierto que otra vía supresor de tumores está regulada por VHL. Se encontró que el VHL es un regulador importante del proceso de macroautofagia (autofagia) [1]. Se determinó que VHL, mediante la inducción de microRNA-204, inhibe la autofagia LC3B mediada por la cual es necesaria para el crecimiento tumoral ccRCC. Por otra parte, VHL, mediante la inhibición de HIF, de expresión y actividad de una paralog LC3B, LC3C inducida. En contraste con LC3B, LC3C actúa como un supresor de tumores [1].
En el proceso de búsqueda de nuevos genes de la BVS-inducida que podrían participar en la actividad supresora de tumores de VHL, descubrimos que la reconstitución de la naturaleza -type BVS en RCC células con perdida
BVS
inducida enriquecimiento específico y significativo para los genes expresados a partir del locus de Smith-Magenis (SM) en el brazo corto del cromosoma 17p11.2. síndrome de Smith-Magenis es un trastorno neuroconductual caracterizado por deterioro intelectual, anomalías craneofaciales y esqueléticas y trastornos del sueño [2]. Curiosamente, este locus contiene otro riñón gen supresor de tumores, foliculina (FLCN), cuya actividad se pierde en el trastorno autosómico dominante genética, el síndrome de Birt-Hogg-Dubé (BHD) [3]. BHD se caracteriza por fibrofoliculomas piel, quistes pulmonares y neumotórax espontáneo, así como el cáncer renal de tipos histológicos mixtos, incluyendo cromófobo, célula oncocítico, claro, y el tipo papilar [3]. El propósito de este trabajo fue determinar si FLCN contribuye a la actividad supresora de tumores de VHL. Se demuestra que FLCN contribuye a la supresión de la BVS mediada por el crecimiento del tumor al afectar LC3B y autofágicos LC3C vías.
Materiales y Métodos
Cultivo Celular métodos y tratamientos
Nuestro método para generando charcos de VHL humano (-) y BVS (+) 786-O, A498 y células Caki-1 fueron descritos por nosotros antes de [1], [4], [5]. RCC4 células fueron obsequio del Dr. Jamie Cairo (Jefferson University) y fueron descritos por nosotros antes [6]. Se llevaron a cabo los flujos de autofagia como se describe antes [1]. Por proteína o la extracción de ARN, se sembraron las células, 24 horas más tarde medio se cambió a que, ya sea con 10% o 0,1% de suero, y se recogieron las células 48 horas más tarde. Las células se lisaron en tampón RIPA con proteasa, fosfatasa y los inhibidores de proteasomal para el análisis de página, o en el reactivo TRI para la extracción de RNA. Para los experimentos de ARNi, shRNA construye a base de pLKO.1 para FLCN (TRCN0000005969, TRCN0000005970, y TRCN0000010979; Abrir Biosystems) fueron VSV-G sobre de empaquetado (Niños de Cincinnati Hospital Medical Center viral vector Core) y ha infectado a las células, que luego fueron tratados con reactivos de selección plásmido apropiado. BVS construcciones shRNA fueron descritos antes [5]. Transductions con partículas de lentivirus se realizaron con 2 mg /ml de polibreno.
Humano RCC tumores
Las muestras frescas congeladas de tumores ccRCC (n = 128) y muestras de riñón normales emparejados (n = 114 ) se obtuvieron y se analizaron para
VHL
secuencia y expresión de la proteína, como se describe antes [4]. Las muestras se analizaron para la expresión de la proteína y ARNm, también como se ha descrito antes.
RT-PCR cuantitativa
Para el análisis de ARNm, las muestras fueron primero a transcripción inversa utilizando el kit TaqMan microARN transcripción reversa (Applied Biosystems), y cuantificado con PCR en tiempo real en una Applied Biosystems 7900HT Fast real-Time CRSystem. QRT-PCR se realizó como se ha descrito antes, y utilizando los cebadores descritos en la Tabla S4. Descripción de los microarrays de ARN se proporciona en Métodos Complementarios.
Western blot
Un total de lisados celulares se obtuvieron por lisis de células en tampón RIPA que contienen inhibidores de proteinasa y fosfatasa. 5 a 30 g de extractos fueron separados en 4% a 12% o 10% geles de poliacrilamida y se transfirieron a membranas de PVDF. inmunotransferencia semi-cuantitativa de los tumores humanos RCC y los riñones normales de la misma se llevó a cabo como se describe anteriormente [4]. Los siguientes anticuerpos policlonales se obtuvieron de Señalización Celular Tecnología (Danvar, MA): anti-FLCN, anti-S6 quinasa 1 y T
389 fosforilación; anti-S6 y S
240/244 fosforilación; anti-4EBP y T
37/46 o fosforilación S
65. Se utilizaron anticuerpos policlonales anti-LC3B (Abcam, Cambridge, MA) y anti-LC3C (Abgent, San Diego, CA). La siguiente ratón se utilizaron anticuerpos monoclonales: anti-VHL (Pharmingen; San Jose, CA), anti-hemaglutinina (Boehringer Ingelheim, Austria); y anti-GAPDH (Abcam, Cambridge, MA).
Los experimentos de ratón con xenoinjerto
Para las inyecciones intra-renales, se volvieron a suspender las células en Matrigel 30.000 a un volumen final de 30 l, y luego lentamente inyectado unos pocos milímetros bajo la capsula renal de 4 a 5 semanas de edad ratones desnudos atímicos. Después de los ratones fueron sacrificados 10 a 12 semanas, se recogieron los tumores con los riñones y se fijaron en paraformaldehído al 4%, embebidos en parafina, y H & amp; E teñidos o tratados para S6 tinción /S6P en el Histopatología Core en el Departamento de Patología en CCHMC
análisis estadístico de datos cuantificados de
normalización y el análisis de microarrays de ARN Los datos se describen en los métodos suplementarios. Los datos fueron depositados a la Expresión Génica Omnibus con el número de acceso GSE47106. Para la estadística descriptiva, los datos se expresan como media ± SEM a menos que se indique lo contrario. El análisis de la expresión diferencial se realizó mediante t-test o análisis unidireccional de la varianza (ANOVA), seguido de pruebas de comparación múltiple de Tukey-Kramer. Para la cuantificación de los experimentos de inmunotransferencia los valores normalizados de los niveles de abundancia de proteínas se transforman log2 robusta para facilitar el análisis, valores atípicos y minúsculas. diagramas de caja y bigotes estándar se utilizaron para comparar las distribuciones de la medida de la abundancia normalizado para las proteínas individuales. Las diferencias entre los niveles medios en dos tipos de muestras se evaluaron mediante el uso de (a doble cara) t-test y validado mediante la prueba de Wilcoxon más. Las diferencias resultantes en P & lt; 0,05 se consideraron estadísticamente significativa
Declaración de Ética
Todos los experimentos con ratones se llevaron a cabo en estricta conformidad con el protocolo aprobado por la Universidad de Cincinnati Institucional Cuidado de Animales y el empleo. (Número de protocolo: 06-07-21-01). Toda la cirugía se realizó bajo anestesia con isoflurano y se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el dolor. Todas las muestras fueron anónimas humanos y exentos de los requisitos del protocolo de la Universidad de Cincinnati de la Junta de Revisión Interna.
Resultados
Expresión de FLCN es inducida por la BVS
Para identificar los genes inducidos por la BVS que podrían participar en la actividad supresora de tumores de VHL, hemos realizado experimentos de microarrays de ARNm en los que se compararon la expresión génica en humanos RCC 786-O BVS (-) las células y las mismas células con reconstituida, de tipo salvaje BVS (786-O BVS (+)). El análisis estadístico identificó 1.310 transcritos expresados diferencialmente en los dos tipos de células (FDR & lt; 0,1 y & gt; 50% de cambio en el nivel de expresión). (Tabla S1)
Curiosamente, entre los 588 transcripciones inducidos por la reconstitución de VHL, hemos encontrado un enriquecimiento significativo de genes localizados en el brazo corto del cromosoma 17 (10,71% de todos los genes inducidos de manera significativa), y en particular en 17p11.2 cytoband, que contiene el locus SM (1,7% de todos los genes inducidos de manera significativa) (Tabla 1 y S2). También había una concentración de genes inducidos por VHL en el cromosoma 14 (7,85% de todos los genes inducidos de manera significativa) con los principales 14q22.1 ser cytoband. inducción VHL mediada de varios de los genes SM se confirmó adicionalmente mediante RT-PCR cuantitativa (Fig. S1). En contraste, los genes que fueron reprimidos por la BVS se enriquecieron en el cromosoma 7 (63 genes, 9.75% de todos los genes reprimidos significativamente) y el cromosoma 9 (42 genes, el 6,5% de todos los genes reprimidos) (Tabla S3).
El locus SM contiene un gen que codifica otro supresor de tumor renal renal, FLCN. Análisis de FLCN ARNm y proteínas reveló aumento de la expresión tanto en células 786-O y A498 con VHL reconstituido, en comparación con VHL parental (-) de las células (Fig. 1A y B). Además, FLCN ARNm y la expresión de la proteína fueron reprimidos en las células de cáncer renal Caki1 en el que derribó la expresión endógena mediante el uso de la BVS shRNA (Fig. 1C y 1D). El cambio en la expresión de ARNm FLCN estaba en el intervalo de 1,5 a 2 veces, similar a otros genes SM (comparar Fig. S1). Sin embargo, la inducción en el nivel de proteína estaba en el intervalo de 3 a 4 veces, una indicación de que los mecanismos posttranscriptional juegan un papel en esta regulación. En estos estudios también se observó la inducción BVS mediada por p53, otro gen localizado en el cromosoma 17p13.1 en la proximidad del locus SM, validando así un hallazgo que ha sido previamente descrito por otros [7].
Reconstitución de VHL en las células 786-O y A498 condujo a la inducción de la FLCN y mRNAs de p53 (a) y las proteínas (B). Desmontables de la BVS en las células Caki-1 resultó en una disminución FLCN ARNm (C) y los niveles de proteína (D); *** P & lt; 0,001, ** P & lt; 0,01. virus de control de mezcla aleatoria scr-.
Debido a que la BVS se pierde en el carcinoma renal de células claras esporádico (ccRCC), que mide la expresión de FLCN en lisados de tumores humanos ccRCC en comparación con el tejido renal adyacente en muestras cuando se conoce la
BVS
de estado. Hemos descrito previamente la población de pares de riñón normal ccRCC humanos que hemos utilizado para este análisis [4]. La proteína FLCN se analizó por inmunotransferencia semi-cuantitativa tal como se describe anteriormente [4] y el ARNm se determinó mediante RT-PCR cuantitativa. Expresión de la proteína FLCN se redujo marcadamente en los tumores ccRCC en comparación con los riñones normales en la población de ccRCC con el
VHL
borrado (Fig. 2A y 2B). Por el contrario, no hemos visto diferencias significativas en los niveles FLCN al comparar ccRCC con el tipo salvaje
BVS
al tejido renal normal correspondiente (Fig. 2C). Es interesante que los niveles de ARNm FLCN no difirieron entre los pares de tumores renales en ninguno de los grupos de tumores (Fig. 2D), apoyando el papel de los mecanismos posttranscriptional en la regulación de la expresión FLCN.
Análisis de proteínas FLCN (A -C) y el ARNm (D) en muestras de ccRCC humana conocida con
BVS
estado, en comparación con el tejido renal adyacente. A. Un Western blot representativo de la proteína FLCN en pares de riñón (K) y el tumor con perdida
BVS gratis (BVS-DEL) se separaron en PAGE al 10%. La banda inferior puede representar una modificación postraduccional de degradación o FLCN. B y C. La cuantificación de la expresión de la proteína FLCN en tumores que habían perdido
BVS gratis (BVS-DEL) y con tumores de tipo salvaje
BVS gratis (BVS-WT). Las cajas representan los cuartiles superior e inferior separadas por la mediana (línea gruesa horizontal) y los bigotes se extienden hasta los valores mínimo y máximo, sin contar los que están fuera del rango intercuartil 1.5 de la caja (marcado como círculos). Media ± desviación estándar de cada distribución se indican con puntos cerrados y cruces en los bigotes, respectivamente. D. medición RT-PCR cuantitativa de los niveles de mRNA en FLCN riñones y ccRCC BVS-DEL y tumores VHL-WT.
FLCN Contribuye a la BVS mediada tumor represión
Para determinar si existía una relación funcional entre FLCN y la actividad supresora de tumores de VHL, derribaron la expresión de FLCN en 786 BVS-O (+) las células mediante el uso de tres diferentes shRNA (Fig. 3A). A continuación, inyectamos estas células bajo las cápsulas renales de ratones desnudos, lo que resultó en un aumento de la incidencia de tumores y el tamaño del tumor más grande, en comparación con tumores derivados de las células de control inyectadas que fueron transducidas con lentivirus que contenían secuencia de scramble (Fig. 3B). Los tumores con FLCN caída tenían un alto grado de malignidad, fenotipo indiferenciado (Fig. 3C).
caída inducida por ShRNA de FLCN promueve la formación de tumores de células 786-S con VHL reconstituida. A. transferencia de Western que demuestra una disminución en la expresión de la proteína FLCN en células que expresan establemente tres diferentes FLCN shRNAs en comparación con las células transfectadas con control de mezcla aleatoria (SCR). B. Cuantificación de incidencia y el peso de los tumores formados por las líneas celulares indicadas en xenoinjertos ortotópico. peso medio NK de los riñones normales. C. H & amp; E tinción de secciones representativas de tumores cultivados por la BVS (+) células /scramble de control y las células de la BVS (+) con caídas FLCN. Las barras de escala = 50 micras.
Debido a FLCN ha demostrado inhibir la actividad de la vía mTORC1 en UOK257 células y modelos de ratón de cáncer de riñón BHD [8], [9], se analizaron los efectos de FLCN desmontables en la actividad de esta vía en las células usadas para estos xenoinjertos ortotópico. Es importante destacar que, desmontables de FLCN dio lugar a disminución de la actividad mTORC1 (Fig. 4A), como se mide por la fosforilación de S6K, S6 y 4EBP, en células cultivadas. También hemos determinado la expresión de S6 y S6-P es secciones de tumores xenoinjertos formados por BVS (+) /células transfectadas revueltos contra tumores formados por estas células con FLCN derribados. Consistentemente con los resultados obtenidos a partir de experimentos de cultivo de células, secciones de VHL (+) /tumores FLCNKD mostraron tinción inferior para S6-P en comparación con los tejidos de control, mientras que la tinción para el total S6 era similar (Fig. 4B). Este resultado sugiere que la actividad aumentada de la vía mTORC1 no contribuye a un aumento del crecimiento tumoral en estas células.
A. Western blot de mTOR abajo objetivos en 786 BVS-O (+) las células que expresan de forma estable ya sea scramble o dos FLCN shRNAs diferente. El control de carga GAPDH se muestra para cada grupo de inmunotransferencias procesados desde el mismo gel. B. Secciones representativas de tumores indicadas teñidas para S6 y S6P. Barra de escala = 50 micras.
Recientemente hemos descrito que suprime la BVS LC3B mediada por la autofagia pro-oncogénica, mientras que estimula una novela supresor de tumores programa de autofagia, mediada por LC3C [1]. LC3s están bien establecidos reguladores autofágicas necesarios para la formación de los autofagosomas de membrana doble y para la adquisición de la carga. De este modo se investigó si FLCN puede ejercer su actividad supresora de tumores aguas abajo de la BVS regulando LC3C o LC3B autofagia. LC3C es inducida por el hambre en la BVS (+) las células, por lo que en estos experimentos, las células de la BVS (+) 786-O y RCC4 se mueren de inanición en 0,1% de suero durante 48 horas y después se trataron durante 1 hora con cloroquina, un inhibidor lisosomal con el fin para inhibir el flujo de autofagia y la acumulación de la forma que migra más rápido, lipidada (LC-II) de LC3B y LC3C se midió por el Western Blot. Se encontró que desmontables de FLCN dio lugar a una disminución sustancial de la acumulación de LC3C con un aumento en líneas LC3B tanto de células (Fig. 5). El cambio en LC3B en células de RCC BVS (+) no se asoció con cambios consistentes en el miR-204 (datos no mostrados). Este resultado indica que la autofagia FLCN regula de manera similar a la BVS, y por lo tanto los efectos sobre la autofagia puede ser parcialmente responsable de la contribución de FLCN al tumor actividad de supresión de la BVS
.
Desmontables de FLCN (shRNA 3) en 786- o (A) o RCC4 (B) de la BVS (+) células reduce la acumulación de supresor tumoral LC3C-II, pero induce la expresión de oncogénico LC3B-II. Las transferencias Western se sondaron con anticuerpos indicados. C. Cuantificación de 3 experimentos independientes, como se muestra en el panel A y los niveles de proteína B. LC3 medidos por la densidad óptica se normalizaron primero a GAPDH. A continuación, se calculó la relación de LC3 entre los niveles de LC3 medidos en las muestras tratadas con cloroquina en las células con FLCN derribado y las células de control (comparar los carriles 6 con el carril 3 en los paneles A y B). D. Modelo del reglamento propuesto.
Discusión
A continuación, se informó de que la BVS regula la expresión de FLCN y que, a su vez, FLCN participa en la actividad supresora de tumores de VHL. Los efectos observados de FLCN caída en el crecimiento del tumor son consistentes con el efecto negativo de FLCN sobreexpresión en la formación de tumores por 786-O VHL (-) de las células, como se observa por otros [10]. Es importante destacar que, FLCN regula programas LC3B y autofágicas LC3C de una manera similar a VHL, es decir, inhibe FLCN LC3B y estimula la actividad autophagic LC3C (Fig. 5D). Debido a que hemos demostrado que ambas LC3B y ejercicio LC3C efectos importantes y opuestos sobre el crecimiento de los tumores ccRCC [1], se propone que la contribución de FLCN a la actividad supresora de tumores de los resultados de la BVS, al menos parcialmente, a partir de sus efectos sobre la autofagia (Fig . 5D). La regulación de LC3B por FLCN probablemente representa un mecanismo adicional al descrito previamente por nosotros inhibición mediada por la BVS de LC3B través de miR-204, ya que no medimos los efectos persistentes de FLCN en el miR-204. Al mismo tiempo ambos supresores tumorales podrían inducir la expresión de LC3C través de la represión de HIF, ya LC3C es un gen HIF-inhibido. VHL es bien reconocido por su capacidad para inhibir la expresión de la proteína HIF-aS y actividad. Recientemente, FLCN También se ha informado a disminuir la actividad de HIF, a pesar de que no afecta a la acumulación de subunidades HIF-aS [11].
El papel específico de FLCN en la regulación de la autofagia se ve apoyado por el recientemente presencia identificado de dominio DENN en la región carboxi-terminal de FLCN [12]. Este motivo está presente también en folicullin asociada a la proteína-1 y 2 (FNIP1 y FNIP2 [13]), y, curiosamente en otra proteína expresada a partir del locus SM, SMCR8 [13], que también nos pareció ser inducida por la BVS (Fig . S1). Estas proteínas actúan como factores de intercambio de GDP-GTP (GEFs) para GTPasas Rab, potencialmente necesarias para el tráfico y la fusión [11] autofagia asociado, [13].
El locus SM no ha sido relacionado con ccRCC. Anteriormente, sólo un gen de este locus, TNFSF13 (miembro de la superfamilia del factor de necrosis tumoral 13), se ha estudiado en este sentido. Se encontró a exhibir niveles de mRNA disminuido en ccRCC en comparación con el riñón normal. Además, se muestran los niveles más altos de este receptor que se correlaciona con una mejor supervivencia global y libre de enfermedad [14]. Sin embargo, es posible que un análisis más detallado revelará las funciones relacionadas con la autofagia adicionales de genes expresados por SM locus.
FLCN contribuye a la supresión de tumores VHL inducida por un mecanismo que no parece involucrar la activación de la vía mTOR. De hecho, en las células 786-O con VHL reconstituido y FLCN derribado, que en realidad mostraron una fuerte reducción en varios eventos de fosforilación que se utilizan como indicadores de la actividad mTOR. En consonancia con la inhibición de mTOR que medirse por el aumento de la acumulación LC3B, una lectura de autofagia ampliamente utilizado, y este aumento de la autofagia mediada por LC3B puede contribuir al crecimiento del tumor. Los efectos observados de FLCN sobre la actividad de mTOR son consistentes con varias publicaciones de informes una correlación positiva entre los niveles de FLCN y mTOR en U251, HEK293, HK-2, ACHN, 786-O BVS - células [15] (). Sin embargo, la comprensión actual de la conexión canónica FLCN-mTOR es que FLCN regula negativamente la vía mTOR [8], [9], [16]. A este respecto, la línea celular humana UOK257 derivada de un paciente BHD, que no expresa la BVS, muestra un alto nivel de actividad de mTOR, y los ratones knockout con FLCN demuestran altos niveles de fosforilación S6 [8], [9]. La razón de esta discrepancia no se entiende actualmente, pero tal vez los datos apuntan a un efecto compartimentada de FLCN de mTOR que se ve afectado por el contexto celular, tales como la actividad de la BVS. Sin embargo, la conexión de VHL a un supresor de tumores que regula una vía metabólica en el cáncer renal puede revelar un aspecto novedoso de la actividad supresora de tumor VHL que es complementaria a sus papeles en la regulación de la angiogénesis y la autofagia.
Es importante destacar , los niveles de proteína FLCN están disminuidos en ccRCC humano con
BVS
pérdida, más el apoyo a un papel de este gen supresor tumoral en el crecimiento de ccRCC. Hasta el momento, no hay mutaciones FLCN o cambios en los niveles de mRNA se han medido en ccRCC. Esta convergencia en las funciones de la BVS y FLCN es de especial interés teniendo en cuenta el hecho de que el carcinoma de células claras puede ser parte del tipo de multihistological de cáncer renal que se produce en el síndrome de BHD.
La naturaleza del mecanismo molecular de particular BVS, que induce FLCN supresores de tumor renal que queda por determinar, pero es probable que la participación de múltiples mecanismos. Debido a que mide un efecto de la BVS en el estado de los niveles de mRNA FLCN en líneas celulares de RCC, esperamos un cierto nivel de inducción de la transcripción o la estabilización del ARNm FLCN. A este respecto, no hemos encontrado ningún efecto de caída de p53 en la expresión FLCN. Debido a que no se encontraron cambios en los niveles FLCN de ARNm entre pares de riñón tumorales humanas aunque encontramos diferencia en el estado estacionario de la proteína FLCN, proponemos que existe también un importante componente de traslación a esta regulación, posiblemente en función de la especificidad de diferentes poblaciones de células de riñón. Una explicación es que la BVS puede reprimir la expresión de microRNAs específicos, que a su vez reprimen la traducción FLCN.
En resumen, el presente estudio, hemos proporcionado primera evidencia de una conexión directa entre la BVS y FLCN tumor supresor vías que convergen en la regulación de la autofagia en el cáncer renal.
Información de apoyo
Figura S1.
VHL induce la expresión de varios genes expresados a partir de la locus Smith-Magenis en 786-0 y A498 células. La gráfica muestra los cambios en la expresión de ARNm individuales sobre la base de mediciones cuantitativas QRT-PCR. Doble cambio representa la diferencia en la expresión de los ARNm en la BVS (+) frente a VHL (-) las células. La secuencia de los cebadores se proporciona en
doi:. 10.1371 /journal.pone.0070030.s001 gratis (PDF) sobre Table S1. List de los genes reprimidos o inducida por la BVS en células 786-S de manera significativa. Doblar el cambio representa la BVS (+) /BVS (-) Relación de
doi:. 10.1371 /journal.pone.0070030.s002 gratis (DOCX)
Tabla S2.
genes inducidos de manera significativa por la BVS y enriquecidas para el cromosoma o cytoband específica
doi:. 10.1371 /journal.pone.0070030.s003 gratis (XLS) sobre Table S3. Los genes
reducido significativamente por la BVS y enriquecido para el cromosoma o cytoband específica
doi:. 10.1371 /journal.pone.0070030.s004 gratis (DOCX) sobre Table S4.
Secuencia de cebadores para los genes indicados utilizados en QRT-PCR
doi:. 10.1371 /journal.pone.0070030.s005 gratis (DOCX)
Reconocimientos
gracias G. Doerman para la preparación de las figuras y el Dr. M. Daston para la edición del manuscrito.