Extracto
Antecedentes
caja forkhead L1 (FOXL1), considerado nuevo supresor tumoral candidato, suprime la proliferación e invasión de ciertos tipos de cáncer. Sin embargo, la regulación y la función de FOXL1 en cáncer de vesícula biliar (GBC) sigue siendo poco clara.
Métodos
FOXL1 expresión en ARNm y los niveles de proteína en los tejidos y líneas celulares GBC fueron examinados por RT-PCR, inmunohistoquímica y ensayo de western blot. FOXL1 expresión en líneas celulares GBC fue hasta reguladas por transfección con pcDNA-FOXL1. Los efectos de la sobreexpresión FOXL1 sobre la proliferación celular, la apoptosis, la migración y la invasión se evaluaron in vitro o in vivo. Además, el estado de los mediadores implicados en la migración, invasión y apoptosis se examinó mediante transferencia de Western después de la transfección con pcDNA-FOXL1.
Resultados
FOXL1 se downregulated con frecuencia en los tejidos GBC y líneas celulares. Su expresión más alta se asocia con un mejor pronóstico, mientras que su menor expresión se correlaciona con el estadio TNM avanzada y diferenciación de los pobres. la sobreexpresión en células FOXL1 NOZ suprime significativamente la proliferación celular, la migración y la invasión in vitro y la tumorigenicidad en ratones desnudos. sobreexpresión FOXL1 interrumpido el potencial transmembrana mitocondrial y desencadenó la apoptosis mediada por mitocondrias en las células NOZ. Además, la sobreexpresión FOXL1 suprimida ZEB1 expresión y la expresión de E-cadherina inducida en células NOZ.
Conclusión
Nuestros hallazgos sugieren que FOXL1 desregulada está implicada en la tumorigénesis y progresión de GBC y puede servir como una predictor del resultado clínico o incluso una diana terapéutica para pacientes con GBC
Visto:. Qin y, W Gong, Zhang H, J Wang, Tang Z, Z Quan (2014) forkhead caja L1 es downregulated frecuentes en la vesícula biliar cáncer e inhibe el crecimiento celular por apoptosis inducción de la disfunción mitocondrial. PLoS ONE 9 (7): e102084. doi: 10.1371 /journal.pone.0102084
Editor: Alejandro H. Corvalan, Pontificia Universidad Católica de Chile, Facultad de Medicina, Chile
Recibido: 10 Enero, 2014; Aceptado: June 14, 2014; Publicado: 10 de julio 2014
Derechos de Autor © 2014 Qin et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Nº 81272747 y Nº 81372642). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
cáncer de la vesícula biliar (GBC), que representa el tipo más común y agresivo de los tumores malignos del tracto biliar se caracteriza por la presentación no específica, el diagnóstico tardío y la falta de un tratamiento eficaz. A pesar de los avances recientes se han realizado en el diagnóstico y el tratamiento, los resultados de las terapias actuales, como la cirugía, la quimioterapia y la radioterapia (solos o combinados) han demostrado ser triste. Se asocia con un mal pronóstico, con una duración mediana de supervivencia de 4 meses [1] y la tasa de supervivencia a 5 años inferior al 10% [2]. Por lo tanto, existe una necesidad urgente de desarrollar nuevos y eficaces pautas de tratamiento de los pacientes GBC. Sin embargo, el conocimiento limitado sobre la tumorigénesis del cáncer de vesícula biliar dificulta el desarrollo del diagnóstico y tratamiento de GBC. Una mejor comprensión de la biología molecular y mecanismos carcinogénicos desarrollo y progresión de GBC subyacentes puede ayudar a establecer tratamientos más eficaces.
cuadro de Forkhead (Fox), las proteínas son una superfamilia de factores de transcripción que comparten un muy conservadas de unión a ADN dominio (la caja forkhead o dominio hélice alada) controlar una variedad de procesos biológicos, incluyendo el metabolismo, la diferenciación, la proliferación y la apoptosis [3]. Dado que las proteínas FOX regulan estos procesos vitales en el crecimiento y desarrollo, una ganancia o pérdida de la función FOX como era de esperar causante de enfermedades genéticas humanas, incluyendo el cáncer. La desregulación de varias subfamilias FOX como FOXO, FOXM, FOXP, FOXC y FOXA está implicada en la tumorigénesis y la progresión de ciertos tipos de cáncer [4]. Aunque las proteínas FOX comparten el dominio de unión a ADN altamente conservado, su regulación y función varían significativamente entre las familias. proteínas FOX tienen diversas funciones y actuar como supresores de tumores u oncogenes durante la tumorigénesis y la progresión de diversos cánceres. Por ejemplo, FoxO1 actúa como un supresor de tumor, que podría inducir la apoptosis y detención del ciclo celular en las células cancerosas [5]. En contraste con FoxO1, FOXM1 muestra actividades oncogénicas y la orientación FOXM1 induce la apoptosis en células de cáncer [6]. Un creciente cuerpo de evidencia ha demostrado de manera convincente que las proteínas FOX pueden representar objetivos atractivos para la intervención terapéutica contra muchos tipos de cáncer.
FOXL1 proteína es un miembro de la superfamilia FOX que fue descubierto inicialmente en el mesénquima del tracto gastrointestinal. Hasta el momento, la relación entre FOXL1 y el cáncer gastrointestinal, incluyendo el estómago, colon y páncreas se ha investigado en varios estudios [7] - [8]. Sin embargo, la función biológica de FOXL1 en GBC que queda por esclarecer. En el presente estudio, se investigó el significado de la expresión FOXL1 en pacientes con GBC en relación con las características clínicas y el pronóstico. También llevamos a cabo estudios funcionales para evaluar los efectos de la sobreexpresión FOXL1 sobre la proliferación, la apoptosis, la migración y la invasión de las células del GBC in vitro o in vivo. Además, nos preliminar investigó la expresión de E-cadherina y zinc-finger caja E unión homeobox 1 (ZEB1), lo que puede contribuir a los efectos inhibitorios de FOXL1 sobreexpresión de GBC.
Materiales y Métodos
Ética declaración
los experimentos con animales humanos y fueron aprobados por el Comité Ético del hospital de Xinhua, Shanghai Jiaotong University School of Medicine. consentimientos informados escritos fueron obtenidos de todos los pacientes.
colección Pacientes y tejidos
35 de los pacientes con GBC (13 hombres y 22 mujeres, rango de edad 51-71 años, edad media de 61,9 ± 5,4 años ) tratados con colecistectomía radical (sin radioterapia o quimioterapia previa) entre 2008 y 2013 en el Departamento de cirugía general, Xinhua hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine se inscribieron en este estudio. Las muestras tumorales (n = 35) y las muestras no tumorales adyacentes (n = 12) fueron recogidos inmediatamente después de la cirugía y se sumergen en nitrógeno líquido. De acuerdo con el sistema TNM (AJCC, 7
ª, 2010), se llevaron a cabo los tumores (4 estadio I, 12 en estadio II, 14 en estadio III y IV etapa 5). El grado de diferenciación de acuerdo a criterios de la OMS fue el siguiente: 13 casos fueron bien diferenciados (WD), 15 moderadamente diferenciado (MD) y 7 pobremente diferenciado (PD). El diagnóstico histológico de todos los GBC fue confirmada por dos patólogos.
La inmunohistoquímica
Congelado muestras de tejidos fueron incorporados en el compuesto temperatura óptima de corte (OCT). 5-micras de espesor secciones de tejido de tumores y tejidos no tumorales fueron cortadas de los bloques de tejido, y después se fijaron en acetona fría a 4 ° C durante 20 minutos. Las secciones de tejido se incubaron con 3% (v /v) H
2O
2 en metanol para eliminar la actividad peroxidasa endógena y después se bloquearon con suero de cabra normal. Después, las secciones se procesaron para inmunohistoquímica usando anticuerpos contra FOXL1 (dilución 1: 100; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) y el anticuerpo secundario (dilución 1: 500; Santa Cruz Bio). Por último, las secciones se incubaron con el complejo de peroxidasa y se visualizaron mediante tetracloruro de 3,3'-diaminobencidina (DAB). Todas las secciones immunostained fueron revisados a ciegas por dos patólogos independientes. La intensidad se evaluó usando un sistema de 3-escala (0, negativo; 1, débil; 2, moderado; 3, fuerte). La positividad por ciento también se evaluó usando un sistema de 3-escala (0, & lt; 5%; 1, 5% -25%; 2, 25% -50%; 3, & gt; 50%). La cuantificación global de la puntuación inmunohistoquímica se calcula multiplicando la puntuación de la intensidad de la tinción y la puntuación de porcentaje de células positivas. los niveles de expresión foxl1 se clasificaron de la siguiente manera: - (puntuación 0-1), + (puntuación 2-3), ++ (puntuación 4-6) y +++ (score & gt; 6). De acuerdo con los resultados de la inmunotinción FOXL1, los pacientes GBC se clasificaron en dos grupos: baja expresión (- o +) y alta expresión (++ o +++)
Líneas celulares y condiciones de cultivo
cuatro líneas celulares GBC humanos GBC-SD, SGC-996, NOZ y OCUG-1 se utilizaron en este estudio. línea celular GBC-SD se adquirió de Banco de Células de la Academia de Ciencias de China, Shanghai, China; línea celular SGC-996 [9] fue proporcionado por Biología de Células Tumorales Instituto de Investigación de la Universidad de Tongji, Shanghai, China; NOZ y celulares OCUG-1 líneas fueron adquiridos de Recursos de Investigación del Banco de Ciencias de la Salud, Osaka, Japón. Las células se cultivaron bien en DMEM o RPMI 1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) suplementado con 1% de penicilina /estreptomicina (Invitrogen) y 10% (v /v) de suero bovino fetal (Hyclone, Logan, UT, EE.UU.) a 37 ° C en un humidificado 5% de CO
2 incubadora.
las transfecciones
Para regular positivamente la expresión de FOXL1, pcDNA-FOXL1 (FOXL1 codifica ADNc) se construyeron y se transfectaron en células GBC. El vector pcDNA3.1 vacío (Invitrogen) se utilizó como control. Los mapas de estrategia de clonación y restricción de los plásmidos recombinantes se muestran en la Figura S1. El reactivo de transfección Lipofectamine 2000 fue utilizado durante la transfección de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Invitrogen). Para obtener transfectantes estables, el medio se reemplazó por medio completo fresco suplementado con 300 mg /ml de geneticina (G418) después de 48 h de la transfección. El medio selectivo se refrescó cada 3-4 días hasta que los clones resistentes a G418 se pueden identificar. los niveles de expresión FOXL1 en líneas celulares fueron examinados por RT-PCR y ensayo de transferencia Western.
aislamiento de ARN y el análisis de RT-PCR
ARN total fue extraído a partir de muestras de tejido congelado y líneas celulares GBC utilizando Trizol Los reactivos del kit (Gibco BRL, Gaithersburg, MD, EE.UU.). ARN se convirtieron en cDNA utilizando un kit de PCR de ARN de Takara (Takara Bio Inc, Dalian, China). El ADNc obtenido se amplificó utilizando el procedimiento siguiente: 94 ° C (5 min), luego 30 ciclos a 94 ° C (30 s), 59 ° C (45 s), 72 ° C (45 s). Las secuencias de los cebadores para FOXL1 fueron los siguientes: Sentido: cacggtactccacttccagt; Anti-sentido:. Aacacttccctgaacccaca
La viabilidad celular y ensayos de formación de colonias
tetrazolio soluble en agua (WST) -1 ensayo se realizó para medir la viabilidad celular después de la transfección. 5 × 10
3 de células transfectadas por pocillo fueron sembradas en placas de 96 pocillos y se cultivaron durante 24, 48, 72, o 96 h. Después, las células se incubaron con reactivo WST-1 durante 2 horas a 37 ° C. La absorbancia a 450 nm se midió con el uso de un lector de microplacas automático (Bio-Rad 5 Modelo 550, Bio-Rad, Hercules, CA, EE.UU.) y la curva de crecimiento se calculó.
Para el ensayo de formación de colonias , 1 × 10
3 de células transfectadas por pocillo fueron sembradas en placas de 6 pocillos y se cultivaron en medio completo a 37 ° C. Después de 14 días de cultivo, las colonias se tiñeron con cristal violeta y el número de colonias se había contado por el contador automático de colonias (Alpha Innotech, San Leandro, CA, EE.UU.).
experimentos de xenoinjertos tumorales
se llevaron a cabo xenoinjertos subcutáneos en ratones desnudos para evaluar los efectos de la sobreexpresión FOXL1 sobre el crecimiento celular y la tumorigenicidad in vivo. (Nu /nu) ratones desnudos atímicos macho y la hembra de 6-8 semanas de edad se obtuvieron de Shanghai Laboratory Animal Center de la Academia de Ciencias de China y alojados bajo condiciones específicas libres de patógenos (SPF). células NOZ fueron transfectadas establemente con pcDNA-FOXL1 o pcDNA3.1. Aproximadamente 1 × 10
7 de células foxl1 sobreexpresan o control de las células se suspendieron en un volumen total de 200 l de 1/1 (v /v) PBS /Matrigel (BD Biosciences, San Diego, CA, EE.UU.) y luego inyectada por vía subcutánea en los flancos de los ratones. Aproximadamente 4 semanas después de la inyección de las células tumorales, los volúmenes tumorales subcutáneos visibles se midieron semanalmente con pinzas y los volúmenes tumorales en cada grupo se calcularon utilizando la fórmula: volumen = longitud x anchura
2/2. Todos los ratones fueron sacrificados después de 6 semanas de observación. tumores de xenoinjertos se fijaron en formalina y luego se incluyeron en parafina. El peso del tumor se midió y registró.
análisis citométrico de flujo de la apoptosis
La apoptosis de las células in vitro se determinó por citometría de flujo usando el kit Annexin V-FITC Apoptosis Detección (BD Bioscience) según el fabricante de protocolo. Brevemente, 24, 48 y 72 h después de la transfección con pcDNA-FOXL1 o pcDNA3.1, se recogieron las células, se lavaron con PBS, y se resuspendieron en 1 x tampón de unión. Después, las células se tiñeron con FITC-anexina V y PI de 15 min y se analizaron por citometría de flujo.
TUNEL ensayo
apoptosis en secciones de tejido de tumores de xenoinjertos fue evaluada por desoxinucleotidil transferasa terminal dUTP nick fin de etiquetado (TUNEL) tinción utilizando En kit de detección de muerte celular in situ, fluoresceína (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania) siguiendo el protocolo del fabricante. Brevemente, las muestras de tumor de xenoinjerto se desparafinaron utilizando xileno y etanol. Las secciones de tejido se incubaron con proteinasa K solución durante 15 min, seguido de incubación con mezcla de reacción TUNEL. Después las secciones de tejido se incubaron con convertidor-POD y de contraste con 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI). La fluorescencia se vieron por microscopía de fluorescencia usando filtros de excitación y emisión apropiados.
Flow análisis de citometría de potencial de membrana mitocondrial
La alteración en el potencial transmembrana mitocondrial se determinó por cytomery flujo utilizando el potencial de membrana mitocondrial sensible tinte de fluorocromo JC-1. Brevemente, las células fueron cosechadas NOZ 24, 48 y 72 h después de la transfección con pcDNA-FOXL1 o pcDNA3.1 y se lavaron con PBS. Las células se incubaron con JC-1 (10 g /ml en PBS) a 37 ° C durante 10 min. Las células teñidas se lavaron con PBS dos veces y se analizaron por citometría de flujo.
mitocondrial y preparación extracto citosólico
Las cantidades de citocromo c mitocondrial y citosólica de citocromo c se determinaron utilizando extracto mitocondrial y extracto citosólico respectivamente. Mitocondrial y las fracciones citosólicas se extrajeron de las células cultivadas por las mitocondrias /citosol Fraccionamiento Kit (Abcam, Cambridge, Reino Unido) de acuerdo con el protocolo del fabricante. En resumen, después se lavó con PBS enfriado en hielo, las células transfectadas se incubaron con extracción citosol mezcla tampón que contenía ditiotreitol (DTT) e inhibidores de proteasa en hielo durante 10 min. Las células se homogeneizaron suavemente usando un homogeneizador de vidrio enfriado con hielo. La suspensión celular se centrifugó a 3000 rpm a 4 ° C durante 10 min. Los sobrenadantes se centrifugaron nuevamente a 13.000 rpm durante 30 minutos para separar las mitocondrias intactas (pellets) y fracción citosólica (sobrenadantes). Los sedimentos se resuspenden con 100 l de extracción mitocondrial mezcla tampón que contenía inhibidores de la proteasa y de TDT y agitaron en vórtex durante 10 segundos. La mezcla se guarda como fracción mitocondrial.
ensayo Western blot
Las proteínas totales se extrajeron de las células NOZ 48 h después de la transfección con pcDNA-FOXL1 o pcDNA3.1. El contenido de proteína se cuantificó por ensayo de proteínas de Bradford. 40 g de proteína se separó en un 10-12% de SDS-PAGE y se electrotransfirieron a membranas de PVDF (Millipore, Billerica, MA, EE.UU.). La membrana se bloqueó con leche en polvo desnatada al 5%, y se sondeó con anticuerpos primarios (Santa Cruz Bio) la noche a 4 ° C, seguido de incubación con rábano picante peroxidasa secundaria de anticuerpos acoplados (Santa Cruz) Bio correspondiente. la actividad de la peroxidasa de rábano picante se visualizó usando quimioluminiscencia potenciada (ECL) Kit (Pierce, Rockford, IL, EE.UU.) y se expone a X-OMAT-Blue película (Kodak, Rochester, NY, EE.UU.).
La migración celular y la invasión ensayo de
la migración celular y la invasión de ensayo se realizaron con un 24 pocillos transwell cámara (Corning Inc., Corning, Nueva York, EE.UU.) con 8 micras poros de acuerdo con el protocolo del fabricante. Las células transfectadas se sembraron en el (ensayo de migración) sin recubrir (ensayo de invasión) matrigel recubierto coladuría cámara superior con RPMI1640 libre de suero. RPMI1640 suplementado con suero bovino fetal al 10% se colocaron en las cámaras inferiores como quimioatrayente. 24 h después de la incubación, las células en el lado superior de la membrana de filtro se retiraron con un hisopo de algodón. Las células que se pegan a la superficie inferior de la membrana se fijaron con paraformaldehído al 4% durante 30 minutos y después se tiñeron con cristal violeta durante 20 minutos.
El análisis estadístico
Los datos se presentan como media ± SD . El análisis estadístico se realizó con SPSS 11.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, EE.UU.). Se evaluaron las diferencias entre los grupos utilizando la prueba t de Student o ANOVA de un factor o de Kaplan-Meier de log-rank o prueba de chi-sqaured. La significación estadística se definió como p. & Lt; 0,05
Resultados
expresión FOXL1 en GBC y su relación con variables clínico
FOXL1 ARNm y proteínas se examinaron en los tejidos tumorales y no tumorales tejidos por RT-PCR, blot e inmunohistoquímica análisis Western, respectivamente. Como se muestra en la Figura 1A y B, el ARNm FOXL1 y los niveles de proteína se redujo en tejidos de cáncer en comparación con los tejidos no tumorales emparejados. Además, 2 de las muestras tumorales carecen de la expresión de ARNm FOXL1 y 3 de las muestras tumorales carecen de expresión de la proteína.
(A) la expresión de mRNA en tejidos FOXL1 GBC y emparejados no tumoral tejidos. T: GBC tejidos; N, igualó tejidos no tumorales. (B) la expresión de proteínas en los tejidos FOXL1 GBC y tejidos no tumorales emparejados. análisis (C) La inmunohistoquímica en tejidos de FOXL1 GBC y emparejados no tumoral tejidos. El aumento es de 200 × y la barra de escala es de 50 micras. R: La tinción positiva de FOXL1 en tejidos no tumorales; b: La tinción positiva de FOXL1 en los tumores bien diferenciados (WD); c: La tinción positiva de FOXL1 en tumores moderadamente diferenciados (MD); d: La tinción positiva de FOXL1 en tumores poco diferenciado (PD); (D) IHC puntuación de los tejidos y tejidos no tumorales GBC (P & lt; 0,05). puntuación de (E) IHC de etapa temprana TNM (I y II) y los tumores de etapa tardía TNM (III y IV), los tumores (P & lt; 0,05). puntuación (F) IHC de los tumores y los tumores de WD MD + Pd (P & lt; 0,05). curvas (G) de Kaplan-Meier basan en los niveles de expresión mediante técnicas de inmunohistoquímica en FOXL1 GBC. Los pacientes con alta expresión de FOXL1 tienen mejor resultado en comparación con aquellos con baja expresión de FOXL1 (P & lt; 0,05). (H) La expresión del ARNm y la proteína de FOXL1 en GBC-SD, SGC996, NOZ y líneas celulares OCUG-1. (I) de la transfección con pcDNA-FOXL1 restaurado expresión de FOXL1 en células NOZ. * Indica una diferencia significativa.
El análisis inmunohistoquímico mostró que la proteína FOXL1 fue localizada principalmente en la nuclear de las células cancerosas y las células epiteliales normales (Figura 1C). proteína FOXL1 se expresa abundantemente en tejidos normales, pero fue relativamente menos expresa en tejidos de cáncer. La puntuación de la inmunotinción FOXL1-positivas en los tejidos GBC era mucho menor que en los tejidos normales (P & lt; 0,05, Figura 1D). expresión FOXL1 fue significativamente mayor en los tumores en estadio temprano (I y II), en comparación con aquellos con la etapa tardía (III y IV) (P & lt; 0,05, Figura 1E). Diferencia en la puntuación de la inmunotinción FOXL1-positivo también se midió entre los grados tumorales (WD vs PD + MD) y se encontró que era significativa (P & lt; 0,05, Figura 1F), con una puntuación más alta en los grupos foxl1 WD. Además, un mayor nivel de expresión del gen FOXL1 se asoció con un mejor pronóstico. (P & lt; 0,05, Figura 1G): perfil líneas celulares
El endógena FOXL1 ARNm y proteínas fueron detectables en GBC-SD, SGC996 y OCUG-1 , pero no en la línea celular NOZ por lo tanto que se elige para los experimentos posteriores (figura 1H). La transfección con pcDNA-FOXL1 restauró los niveles de ARNm y proteínas de FOXL1 en línea celular NOZ (Figura 1I).
sobreexpresión FOXL1 suprime la proliferación de la línea celular NOZ in vitro e in vivo
El in vitro efecto de la sobreexpresión FOXL1 sobre la proliferación y el crecimiento de las células se evaluó por NOZ WST-1 de ensayo. La sobreexpresión de FOXL1 proliferación celular significativamente inhibida en las células NOZ (P & lt; 0,05; Figura 2A). Y esta inhibición del crecimiento era dependiente del tiempo
(A) El crecimiento de las células NOZ se inhibió significativamente después de la transfección con pcDNA-FOXL1 (P & lt; 0,05).. (B) La formación de colonias por las células NOZ. Los resultados mostrados son representativos de tres experimentos. (C) Transfección con pcDNA-FOXL1 redujo significativamente el número de colonias en las células NOZ (P & lt; 0,05). (D y E) la sobreexpresión FOXL1 reduce el volumen y el peso de tumor de xenoinjerto (P & lt; 0,05). * Indica una diferencia significativa.
Los más largo plazo efectos inhibitorios de FOXL1 sobreexpresión sobre la proliferación celular se evaluó mediante el ensayo de formación de colonias. Se observó una disminución significativa en el número de colonias en las células foxl1 sobreexpresan en comparación con células de control (P & lt; 0,05, Figura 2B y C).
Para investigar más a fondo el papel de FOXL1 en la tumorigenicidad y el crecimiento de GBC in vivo, xenoinjertos en ratones desnudos se establecieron por implantación subcutánea de FOXL1 sobreexpresan y células de control. Xenoinjertos formados por células que sobreexpresan foxl1 crecieron a un ritmo mucho más lento que los formados por células de control. la sobreexpresión in vivo FOXL1 indujo una reducción significativa tanto en el volumen del tumor (P & lt; 0,05, Figura 2D) y el peso del tumor (P & lt; 0,05, Figura 2E). Estos resultados sugirieron que FOXL1 suprime el crecimiento de células GBC tanto in vitro como in vivo.
FOXL1 sobreexpresión apoptosis promovido en la línea celular NOZ in vitro e in vivo
La inducción de la apoptosis por sobreexpresión en FOXL1 vitro e in vivo se examinó usando Anexina V /PI ensayo y el ensayo de TUNEL, respectivamente. Como se muestra en la Figura 3A y B, un aumento significativo en la proporción de células apoptóticas (NOZ principios de apoptosis más apoptosis tardía) se observó después de la transfección con pcDNA-FOXL1 (P & lt; 0,05). Y la proporción de finales de apoptosis o células necróticas aumento de una manera dependiente del tiempo (comenzó a partir de las 24 h y alcanzó el pico a 72 h).
(A) La apoptosis de las células NOZ in vitro se examinó por Anexina V /PI doble tinción. Las células que se tiñen negativo tanto para anexina V y PI son células viables (inferior izquierda). Las células que se tiñen positivo para anexina V y negativas para PI están experimentando apoptosis temprana (inferior derecha). Las células que se tiñen positivo tanto para anexina V y PI son o bien en la fase final de la apoptosis, o someterse a necrosis (parte superior derecha). Los resultados mostrados son representativos de tres experimentos. (B) El número de células apoptóticas NOZ (incluyendo apoptosis temprana, apoptosis tardía y necrosis) fue significativamente mayor después de la transfección con pcDNA-FOXL1 (P & lt; 0,05). (C) Apoptosis de NOZ se determinó células in vivo usando el ensayo de TUNEL. Las células apoptóticas se visualizan como células fluorescentes de color verde intenso. El número de células apoptóticas se registra en campos de alta potencia (400 ×). Localización en núcleos fue visualizado por contratinción con DAPI (azul). sobreexpresión (D) FOXL1 promovió significativamente la apoptosis de las células NOZ in vivo (P & lt; 0,05). * Indica una diferencia significativa.
TUNEL ensayo mostró que la sobreexpresión FOXL1 promueve la apoptosis de las células NOZ en xenoinjertos de tumores. Hubo menos células TUNEL-positivas en los xenoinjertos de tumores formados por células de control. Por el contrario, el número medio de células TUNEL positivas aumentó significativamente en los tumores de xenoinjertos formados por células que sobreexpresan foxl1 (P & lt; 0,05, Figura 3C y D)
FOXL1 sobreexpresión inducida por despolarización transmembrana mitocondrial y apoptosis-citocromo c mediada
la pérdida de potencial de membrana mitocondrial (ΔΨm) indica la iniciación y activación de algunas cascadas apoptóticas. En el presente estudio, se examinó ΔΨm por JC-1 tinción. La pérdida de ΔΨm se determinó por el cambio en la fluorescencia JC-1 de rojo a verde. Como se muestra en la Figura 4A y B, la proporción de células con fluorescencia positiva rojos disminuido, mientras que la proporción de células con fluorescencia positiva verdes aumento después de la transfección con pcDNA-FOXL1 (P & lt; 0,05), lo que sugiere FOXL1 sobreexpresión induce una aparente reducción en el potencial de membrana mitocondrial .
(a) la pérdida de potencial de membrana mitocondrial (ΔΨm) se indica por una disminución en la relación de intensidad de fluorescencia roja /verde. eje X indica la intensidad de fluorescencia verde; eje Y indica la intensidad de fluorescencia roja. Los resultados mostrados son representativos de tres experimentos. (B) La proporción de células con fluorescencia positiva rojos disminuyó mientras que la proporción de células con fluorescencia verde positiva aumentó después de la transfección con pcDNA-FOXL1 (P & lt; 0,05). (C) Análisis de transferencia Western mostró el nivel de citocromo c citosólico aumentó notablemente, mientras que el nivel del citocromo mitocondrial c disminuyó notablemente. (D) Los niveles de caspasa-9 troceados, 3 y PARP y bax fueron elevados, mientras que el nivel de bcl-2 se redujo. * Indica una diferencia significativa.
mitocondrial y citosólica de citocromo c se examinó mediante ensayo de western blot. El nivel de citocromo c citosólico fue marcadamente elevada, mientras que el nivel de citocromo c mitocondrial se redujo marcadamente 48 h después de la transfección con pcDNA-FOXL1, lo que sugiere que la sobreexpresión FOXL1 promueve la liberación de citocromo c de la mitocondria al citosol (Figura 4C). Citocromo c oxidasa subunidad IV (Cox IV) y β-actina se utilizaron como control para la proteína mitocondrial y citosólica de proteína, respectivamente. Además, hemos encontrado pcDNA-FOXL1 indujo un aumento de la relación Bax /Bcl-2, lo que puede desencadenar la liberación de citocromo c de la mitocondria al citosol.
Los efectos de la sobreexpresión FOXL1 sobre la activación de caspasas en células NOZ fue examinarse más a fondo por Western blot. Se encontró que la escisión de la caspasa-9 y -3, fue significativamente superior 48 h después de la transfección con pcDNA-FOXL1. Además, la escisión de poli (ADP) polimerasa -ribose (PARP), que es el sello distintivo de la apoptosis también se aumentó notablemente después de la transfección con pcDNA-FOXL1 (Figura 4D). Estos hallazgos sugieren que la sobreexpresión foxl1 activa cascadas de caspasas en células NOZ.
migración FOXL1 suprimida y la invasión de las células NOZ e inducido la expresión de E-cadherina
Dado que la asociación de la expresión FOXL1 con el estadio clínico y metástasis de ganglios linfáticos de GBC se había demostrado anteriormente, es de esperar que FOXL1 puede desempeñar un papel en la migración y la invasión de GBC. Por lo tanto, el próximo evaluó el papel de FOXL1 en la migración y la invasión de GBC. Como se muestra en la Figura 5A-C, la transfección con pcDNA-FOXL1 indujo una disminución significativa en el número de células NOZ migratorias e invasivas en comparación con los grupos control (P & lt; 0,05), lo que sugiere FOXL1 sobreexpresión menoscabado las capacidades migratorias y invasivo de las células NOZ . Además, hemos encontrado el nivel de proteína E-cadherina fue significativamente elevado 48 h después de la transfección con pcDNA-FOXL1, mientras que el nivel de proteína ZEB1 se redujo significativamente (Figura 5D).
(A) El número de migratoria e invasiva células teñidas con cristal violeta reflejaban su capacidad migratoria e invasiva. El número de células migratorias NOZ o invasivos por campo visual se contaron al microscopio después de una tinción de cristal violeta (× 100). Transfección (C B y) con pcDNA-FOXL1 migración inhibió significativamente y la invasión de las células NOZ (P & lt; 0,05). (D) la expresión ZEB1 fue suprimido y la expresión de E-cadherina fue inducida por la sobreexpresión FOXL1. * Indica una diferencia significativa.
Discusión
Las funciones de los miembros de la familia forkhead como Foxos, FOXMs y FOXPs en cánceres han sido ampliamente investigados. Sin embargo, hay pocas investigaciones sobre la regulación y función de FOXL1 en los cánceres. En el presente estudio, el papel de FOXL1 en el crecimiento, la apoptosis, la migración y la invasión de células GBC se estudió preliminarmente. Nos pareció que los niveles de ARNm y proteínas FOXL1 se redujo significativamente en los tejidos del GBC en comparación con los tejidos no tumorales emparejados. Además GBC, una disminución de la expresión de FOXL1 también fue observado por otros investigadores en los tumores de páncreas [10], [11]. Además, la expresión FOXL1 se correlacionó negativamente con el estadio TNM avanzada y la mala diferenciación de GBC. Por otra parte, una expresión FOXL1 alta se asoció con un mejor pronóstico en pacientes sometidos a cirugía por GBC. Estos resultados sugirieron que downexpression de FOXL1 puede estar implicada en la tumorigénesis y progresión de GBC y FOXL1 puede servir como un predictor de pronóstico útil para aquellos pacientes sometidos a cirugía. Resultados similares se observaron también en el mieloma y cáncer de páncreas [8], [12]. Sin embargo, los mecanismos de downexpression de expresión FOXL1 en estos tipos de cáncer no se han elucidado todavía. Varios mecanismos tales como la supresión del cromosoma [13], translocaciones cromosómicas [14], [15], la metilación del promotor [16], la alteración de los reguladores aguas arriba [17], [18] y las modificaciones posteriores a la traducción [4] han demostrado contribuir a la desregulación de los factores de Fox. Sobre la base de los resultados actuales, es difícil decir qué mecanismos responsables de la regulación a la baja de FOXL1 en GBC. Más investigación sobre los mecanismos genéticos y epigenéticos en la expresión de genes desregulados FOXL1 debe ser llevado a cabo para aclarar el tema.
La correlación de mayor expresión FOXL1 con estadio temprano y mejor pronóstico sugiere su función supresora potencial en el crecimiento celular y GBC progresión. Por lo tanto, llevamos a cabo una serie de estudios funcionales para evaluar el efecto de FOXL1 sobre el crecimiento, la apoptosis, la migración y la invasión de la línea celular GBC.
La sobreexpresión de FOXL1 crecimiento significativamente inhibido de células NOZ in vitro e in vivo, y esta inhibición del crecimiento se puede atribuir a la inducción de apoptosis por FOXL1 sobreexpresión. La apoptosis es un proceso biológico que implica una serie programada genéticamente de eventos que conducen a la muerte de una célula. Durante este proceso, varios eventos clave se producen en las mitocondrias, incluyendo la liberación de citocromo c de la mitocondria al citoplasma y la pérdida de potencial transmembrana mitocondrial (ΔΨm) [19], [20]. ΔΨm es un parámetro importante de la función mitocondrial y se ha utilizado como un indicador de las células viables. Bcl-2 familia que consiste en miembros de la apoptóticos y anti-apoptóticos pro- regula la ruta mitocondrial de la apoptosis mediante el control de la permeabilización de la membrana mitocondrial externa y la abertura de canal de aniones dependiente de voltaje (VDAC). proteína pro-apoptótica tales como Bax acelera la apertura de VDAC, mientras que la proteína anti-apoptótica Bcl-x (L) cierra VDAC mediante la unión a él directamente. Aumento de la relación Bax /Bcl-2 puede dar lugar a la interrupción de ΔΨm y apertura de VDAC. Posteriormente, citocromo c mitocondrial puede trasladar al citosol a través de VDAC e iniciar el proceso de la apoptosis [21].