Extracto
Antecedentes
Cáncer de pulmón no microcítico (CPNM) es la causa más común de muerte por cáncer en los países occidentales. El desarrollo de terapias más eficaces NSCLC requerirá la elucidación de las bases genéticas y bioquímicas para esta enfermedad. Las células madre broncoalveolar (BASCs) son una población de células madre putativa cáncer en modelos de ratón de oncogénico
K-ras
adenocarcinoma pulmonar inducida, un subtipo histológico de NSCLC. Las señales activadas por el oncogén K-ras que median la expansión BASC no han sido plenamente definidos.
Metodología /Principales conclusiones
Se utilizó enfoques genéticos y farmacológicos para modular la actividad de fosfatidilinositol 3-quinasa ( PI3K), un mediador clave de oncogénicos
K-ras, España en dos modelos genéticos de ratón de adenocarcinoma de pulmón. Oncogénico
K-ras
inducida por la acumulación y el crecimiento tumoral BASC se bloquearon por tratamiento con un inhibidor de molécula pequeña PI3K y aumentada por la inactivación de
fosfatasa y tensina suprimido del homólogo del cromosoma 10
, un regulador negativo de PI3K
Conclusiones /Importancia
se concluye que la PI3K es un regulador crítico de la expansión BASC, el apoyo a las estrategias de tratamiento para apuntar PI3K en pacientes con CPNM
Visto:.. Y Yang , Iwanaga K, Raso MG, Wislez M, Hanna AE, Wieder ED, et al. (2008) fosfatidilinositol 3-cinasa media la expansión celular broncoalveolar en el ratón Modelos de Oncogénicos Tallo
K-ras
inducida por el cáncer de pulmón. PLoS ONE 3 (5): e2220. doi: 10.1371 /journal.pone.0002220
Editor: José Najbauer, City of Hope Medical Center, Estados Unidos de América
Recibido: 27 Diciembre, 2007; Aceptado: 14 de abril de 2008; Publicado: 21 de mayo de 2008
Derechos de Autor © 2008 Yang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. R01 CA117965 , R01 CA105155, CA105352 U01
Conflicto de intereses: los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
cáncer no microcítico de pulmón no microcítico (CPNM) es el líder. causa de muerte por cáncer en los países occidentales y su incidencia está aumentando en Asia. Una vez que ha hecho metástasis, no existen tratamientos curativos para el NSCLC. Una mejor comprensión de la patogénesis y los factores de riesgo para esta enfermedad no sólo contribuirá a la mejora de la detección temprana y la prevención, sino también para el desarrollo de terapias más eficaces para ello.
Aproximadamente el 10% de las muestras de NSCLC llevar a mutaciones activadoras en
K-ras
[1]. El subtipo histológico de NSCLC que con mayor frecuencia ha
K-ras mutaciones
es el adenocarcinoma; 30% de los adenocarcinomas tienen estas mutaciones.
K-ras
mutaciones también se han identificado en lesiones atípicas hiperplasia adenomatosa (AAH), que se cree que preceder el desarrollo de adenocarcinoma de pulmón [2]. Un creciente cuerpo de evidencia indica que
K-ras
mutaciones son importantes en el inicio del desarrollo de adenocarcinoma de pulmón. Los modelos de ratón han sido desarrollados que expresan mutante
K-ras
condicionalmente, somáticamente, o de manera inducible [3] - [7]. Estos ratones desarrollan lesiones AAH rápidamente y con alta penetrancia, y un subconjunto de estas lesiones progresan a adenocarcinomas.
Una célula candidato pulmón progenitor cáncer (células madre bronquioalveolar o BASC) se ha identificado en modelos murinos de
K-ras
cáncer de pulmón inducida. BASCs tienen un patrón específico de expresión de marcadores de células madre (Sca-1
pos CD34
CD45 pos
neg Pecam
neg), se encuentran en los bronquios terminales, y tienen la capacidad de auto-renovación y se someten a diferenciación multi-linaje [8]. Estas células pueden ser la misma que la variante Clara (Clara o
v) las células, que se encuentran cerca de grupos de organismos neuroendocrinos en bronquios y bronquiolos. Al igual que en BASCs, Clara
V células son capaces de restaurar la población de células Clara naftaleno después de la lesión [9]. Después de la instalación intranasal de adenovirus Cre en Kras
ratones LSL, que se desarrollan adenocarcinoma de pulmón debido a la activación de un condicional oncogénicos
K-ras
alelo [5], BASCs rápidamente proliferan antes del desarrollo de histológica anormalidades [8]. Los BASCs en estos ratones contienen
K-ras
mutaciones idénticas a las encontradas en los tumores [8]. Sobre la base de esta evidencia, BASCs se postulan para ser progenitores de adenocarcinoma de pulmón en ratones. Las señales bioquímicas que inician la expansión de esta población celular no han sido completamente aclarada. Esta deficiencia es importante dado que la elucidación de estas señales podría conducir a un mejor tratamiento para los pacientes con CPNM
.
Lesiones premalignas normalmente experimentan una expansión transitoria seguida de la senescencia programada, y sólo una minoría de las lesiones tempranas progresa a una totalmente transformado estado. En el caso de los modelos de Ras-dependientes de ratón de cáncer, la senescencia programada de lesiones premalignas es activado por la proteína quinasa quinasa /extracelular de señalización quinasa regulada por señales activada por mitógenos, que inhibe Ras a través de vías de retroalimentación que implican aumento de la expresión de las proteínas Sprouty, Ras GTPasa activación de las proteínas, y la proteína quinasa activada por mitógeno fosfatasa-3 [10]. El programa de senescencia en lesiones premalignas puede ser bloqueada por la fosfatidilinositol 3-quinasa (PI3K) de activación [10], lo que indica que PI3K es un determinante crucial de la progresión maligna de estas lesiones. De hecho, la señalización de PI3K se activa de forma constitutiva en las células NSCLC través de la inactivación de mutaciones somáticas en, o silenciamiento epigenético de,
fosfatasa y tensina suprimido del homólogo del cromosoma 10 gratis (
PTEN
), un lípido que fosfatasa regula negativamente la señalización de PI3K en cascada [11] - [15]
en este estudio, se evaluó la importancia de PI3K en la regulación de la expansión de BASCs en dos modelos genéticos de ratón oncogénico de
K-raster.
cáncer de pulmón inducido. Los oncogénicos
K-ras
alelos en estos modelos se activan de forma somática en un (Kras
LA1) y condicionalmente en el otro (Kras
LSL) (5, 7). Se encontró un número de BASCs aumentado en estos ratones relación con los de sus compañeros de camada de tipo salvaje. BASC expansión y la progresión maligna en el pulmón fueron atenuadas por la inhibición farmacológica de PI3K y aumentada por la inactivación genética de
PTEN
. Especulamos sobre la base de estos resultados que las estrategias farmacológicas para inhibir PI3K serán útiles en la prevención y el tratamiento de NSCLC.
Resultados
PX-866 inhibe la tumorigénesis de pulmón en Kras
LA1 ratones
Hemos postulado que PI3K se requiere para la progresión maligna en el cáncer de pulmón y a prueba esta hipótesis mediante el uso de ratones Kras
LA1 como un modelo de tumorigénesis de pulmón. Varias semanas después del nacimiento, Kras
ratones LA1 presentan lesiones multifocales que AAH, por 2-3 meses de edad, se unen en los adenomas sólidas o papilares, las cuales agrandan y se someten a una transformación histológica en los adenocarcinomas de 6-8 meses [7]. En primer lugar, se evaluó la expresión de PI3K (p110α y beta isoformas) en los tejidos del pulmón en diferentes etapas de la tumorigénesis (AAH, adenoma o adenocarcinoma). Se detectaron estas isoformas de PI3K y su abundancia aumentó con la progresión maligna (AAH lesiones
frente a adenocarcinomas:
P = 0,006 para
p110α;
P Hotel & lt; 0,001 para p110β) ( Figura 1A).
(A) expresión de PI3K aumenta con la progresión maligna. tinción inmunohistoquímica Representante de lesiones en el microarray de tejido y su cuantificación en gráficos de barras adyacentes. La barra de calibración en el panel inferior derecho representa el 100 micras. Decenas de (sólido /papilar) adenomas mixtos se incluyen en los gráficos de barras, pero no en las imágenes de tinción de PI3K. se requiere (B) PI3K para el crecimiento tumoral. La media de los cambios en el número de tumores y volumen determinado por tomografía computarizada micro realizadas antes y después del tratamiento. (*
P Hotel & lt; 0,05 en comparación con el vehículo). (C) PX-866 inhibe PI3K en los tejidos pulmonares. Western Blot de AKT fosforilada-Ser473 (P-AKT) y GSK3 fosforilada-9 Ser21 /(P-GSK3α /β) en lisados de todo el pulmón de ratones (n = 7 en cada cohorte de tratamiento). Las posiciones de los marcadores de peso molecular se indican a la izquierda. (D) PX-866 disminuye la proliferación de células tumorales. tinción inmunohistoquímica Representante de la histona H3 fosforilada-Ser28 (P-H3) en adenomas en los microarrays de tejidos (x 20 aumentos, las áreas con células positivas rodeadas) y la cuantificación de la tinción en 16 lesiones de los ratones tratados con vehículo y 4 lesiones de PX-866 los ratones tratados con (gráfico de barras, *
P Hotel & lt; 0,05 en comparación con el vehículo). El recuadro ilustra células rodearon a 40 × magnificación. barras de calibración representan 200 micras.
En base a su mayor abundancia en las células transformadas por completo, el próximo tratado de determinar si era necesaria para el crecimiento tumoral PI3K. El tratamiento de K-ras
volumen LA1 ratones con PX-866, un inhibidor de PI3K [16], disminución de pulmón lesión y la multiplicidad (Figura 1B). Esto fue acompañado por la reducción de la actividad de PI3K como se muestra mediante transferencia Western de lisados de todo el pulmón para AKT fosforilada y glucógeno sintasa quinasa-3 (Figura 1C). Las células tumorales se sometieron a una reducción en la proliferación causada por PX-866 basado en intra-lesional histona H3 fosforilada (Figura 1D), pero no mostraron evidencia bioquímica de la apoptosis como se muestra por transferencia de Western para la caspasa-3 escindido y poli (ADP-ribosa) polimerasa ( datos no mostrados). Por lo tanto, el tratamiento con un antagonista de PI3K inhibe profundamente el crecimiento de estas lesiones tempranas.
BASCs son muy sensibles a PX-866
in vivo
y
in vitro
se determinó a continuación si el efecto antitumoral de PX-866 en Kras
ratones LA1 fue en parte debido a la inhibición de la expansión BASC. En los bronquios terminal, un subconjunto de células epiteliales expresa tanto clara proteína celular específica (CCSP) y proteína surfactante-C (SPC) (Figura 2), que es una característica de BASCs [8]. La cuantificación de las células de doble positivos en ratones de tipo salvaje (con 83 bronquios) y K-ras
ratones LA1 (con 66 bronquios) reveló que no hay ratones de tipo salvaje tenían más de 3 BASCs por bronquio terminal, mientras que un subconjunto de bronquios terminal en K-ras
ratones LA1 tenía 4 a 7 (
P = 0,042
, de tipo salvaje
frente
Kras
LA1) (Figura 2). Por lo tanto, un subconjunto de los bronquios terminal en Kras
LA1 ratones tenían expansión BASC. Además, los estudios de inmunofluorescencia revelaron que triples BASCs expresado p110α y tenía fosforilación detectable de AKT (Figura 3), un mediador aguas abajo de PI3K, proporcionando evidencia de la activación de PI3K en estas células. El uso de secciones de tejido de la Kras
ratones tratados con LA1 PX-866 (con 88 terminales bronquios) o vehículo (con 81 terminales bronquios), se determinó el número de BASCs por bronquio terminal en los grupos de tratamiento. Los ratones tratados con vehículo tenían un subconjunto de los bronquios terminal con 4 a 7 BASCs por bronquio terminal, mientras que ninguno de los ratones tratados con PX-866 tenía más de tres BASCs por bronquio terminal (
P
= 0,025, vehículo
frente
PX-866-tratado) (Figura 4).
tinción de inmunofluorescencia para detectar células de los bronquios terminales que co-expresa CCSP y SPC. BASCs cercadas en los paneles superiores (ampliación x10) ilustradas en paneles inferiores a mayor aumento (x40). gráfico de barras que indica los porcentajes de los bronquios terminales con los números indicados de BASCs. barras de calibración en las imágenes de H & amp; E tejidos teñidos representan 50 micras
tinción de inmunofluorescencia de secciones de tejido para detectar células teñidas triplemente (CCSP /SPC /o p110α pAKT) en bronquios terminales.. BASCs cercado (ampliación x40). La barra de calibración en el panel inferior derecho representa el 50 micras.
tinción de inmunofluorescencia para detectar células de los bronquios terminales que co-expresan CCSP y SPC. BASCs cercadas en los paneles superiores (x 10 aumentos) ilustradas en paneles inferiores a mayor aumento (× 40). gráfico de barras que indica los porcentajes de los bronquios terminales con los números indicados de BASCs. barras de calibración en las imágenes de H & amp; E tejidos teñidos representan 50 micras
Para determinar si PX-866 tuvo efectos directos sobre Kras
LA1 derivados BASCs, se utilizaron cultivos primarios BASC, que eran. aislado de los pulmones de Kras
ratones LA1 por la clasificación para las células que eran Sca-1
pos, CD34
pos, CD45
neg, CD31
neg y. Estas células clasificadas CCSP y SPC (Figura 5A) co-expresó, las colonias se formaron cuando sembraron en cultivos de alimentación (Figura 5B), y presentaban múltiples potencial capacidad de diferenciación cuando chapada en Matrigel (Figura 5C), que son características de la BASCs [8] . tratamiento PX-866 dio lugar a una disminución importante en la actividad de formación de colonias BASC (Figura 5D), lo que indica que PX-866 tuvo un efecto directo sobre BASCs.
(A) Las células clasificadas SPC co-expresa y CCSP. Kras
LA1 tejidos del pulmón entero se disocia y se clasifica para aislar Sca-1
pos CD45
neg CD31
neg CD34
células de punto de venta (P4 y P5 en los paneles de la izquierda y centro, respectivamente), los cuales fueron sometidos a la tinción de inmunofluorescencia (ampliación x40, panel derecho). La barra de calibración en el panel de la derecha representa el 10 micras. (B) BASCs forman colonias cuando se sembraron en cultivos de alimentación. Fotografía de la colonia (aumento x10) formado tras la placa inicial (P1) y el paso 2 (P2). La barra de calibración en el panel de la derecha representa el 50 micras. (C) BASCs diferencian cuando se sembraron en matrigel. Las células se tiñeron después de 7 días en matrigel (ampliación x10) y el número de células con características de células alveolares de tipo II (CCSP
neg SPC
POS), células de Clara (CCSP
pos SPC
neg ), o BASCs (CCSP
SPC pos
pos) se contaron y se expresó como el porcentaje sobre el total de 158 células contadas en un gráfico circular. Ejemplos de células con características de células ATII (ATII) y células de Clara (CC) se indican. La barra de calibración en el panel de la derecha representa el 50 micras. (D) PX-866 inhibe la formación de colonias BASC. Las fotografías (aumento x10) y la cuantificación de las colonias por pocillo (5 pocillos por condición) forman después de 6 d en presencia o ausencia de PX-866. La barra de calibración en el panel de la derecha representa el 50 micras.
mejora PTEN
deficiencia oncogénico
K-ras
inducida por la acumulación BASC
Como otro enfoque para evaluar el papel de PI3K en la expansión BASC, estamos inactivado
Pten
, un regulador negativo de PI3K, en las células que expresan CCSP.
PTEN
fue genéticamente inactivados mediante el uso de
PTEN
Flox /+ ratones, que tienen un
PTEN
alelo que contiene
LoxP
sitios que rodean la dominio fosfatasa PTEN codificada por el exón 5 [17].
Pten
se recombinó específicamente en el pulmón por el entrecruzamiento con estos ratones CCSP
Cre /+ ratones, que expresan Cre bajo el control de la
CCSP
gen [18]. Además, se evaluó si
PTEN
inactivación cooperó con oncogénico
K-ras
para promover la expansión BASC.
PTEN
ratones deficientes se cruzaron con K-ras
ratones LSL, en el que la expresión oncogénica de
K-ras
G12D
está controlado por un elemento extraíble transcripción de terminación PARADA [5]. Con este enfoque, los ratones se generaron con los bronquios que son
PTEN
-deficiente (PTEN
Δ5 /Δ5; CCSP
Cre /+), expresa oncogénico
K-ras gratis ( Kras
LOX /+; CCSP
Cre /+), tiene
PTEN
deficiencia y oncogénico
K-ras
expresión (PTEN
Δ5 /Δ5; Kras
LOX /+; CCSP
Cre /+), o tienen ninguno (PTEN
flox /flox; CCSP
+ /+). Los ratones se sacrificaron a las 4 semanas o 12 semanas, y sus tejidos pulmonares se sometieron a estudios de inmunofluorescencia para cuantificar BASCs.
Como era de esperar, la tinción de inmunofluorescencia triple (CCSP /SPC /PTEN) reveló la pérdida de expresión de PTEN en BASCs de Los ratones que fueron ambos
PTEN
-deficiente y
K-ras
ha transformado los (PTEN
Δ5 /Δ5; Kras
LOX /+; CCSP
Cre /+) pero no en los ratones que sólo eran
K-ras
-transformado (Kras
LOX /+; CCSP
Cre /+) (Figura 6). La cuantificación de BASCs por los bronquios terminales a las 4 semanas reveló que
PTEN
-deficiency solo (PTEN
Δ5 /Δ5; CCSP
Cre /+) no fue suficiente para cambiar los números de BASC en relación con el del control los ratones (PTEN
flox /flox; CCSP
+ /+) (Figura 7). Sin embargo, la comparación de los números de BASC en PTEN
Δ5 /Δ5; Kras
LOX /+; CCSP
Cre /+ ratones a la de Kras
LOX /+; CCSP
Cre /+ ratones demostraron que
PTEN
deficiencia impresionante y mejorada por la expansión BASC oncogénico
K-ras gratis (
P = 0,006
, PTEN
Δ5 /Δ5; Kras
LOX /+; CCSP
Cre /+
frente
Kras
LOX /+; CCSP
Cre /+) (Figura 7). Además de estos hallazgos en los bronquios terminales, grupos de CCSP
pos SPC
se observaron células de punto de venta en los bronquiolos y bronquios pequeños de PTEN
Δ5 /Δ5; Kras
LOX /+; CCSP
Cre /+ ratones; estos grupos de células fueron evidentes tan pronto como 4 semanas de edad y no estaban presentes en los bronquios o bronquiolos del Kras
LOX /+; CCSP
Cre /+ ratones (Figura 8). Llegamos a la conclusión de que
PTEN
inactivación cooperó con oncogénico
K-ras
para mejorar la acumulación BASC.
tinción de inmunofluorescencia de secciones de tejido para detectar triplemente manchado (CCSP /SPC /PTEN) células en bronquios terminales. BASCs (cercado) ilustradas en 10 × magnificación. La barra de calibración en el panel inferior derecho representa el 100 micras.
tinción de inmunofluorescencia para detectar las células en los bronquios terminales que co-expresan CCSP y SPC. BASCs (cercado) ilustrados en la ampliación × 40. gráfico de barras que indica los porcentajes de los bronquios terminales con los números indicados de BASCs. La barra de calibración en el panel inferior derecho representa el 100 micras.
tinción de inmunofluorescencia para detectar las células que co-expresan CCSP y SPC. BASCs (cercado) ilustradas en 10 × magnificación. gráfico de barras que ilustra los porcentajes de los bronquios con los números indicados de BASCs. La barra de calibración en el panel inferior derecho representa el 100 micras.
Discusión
Aquí mostramos que la PI3K era necesaria para la expansión iniciada por BASC oncogénico
K-ras y
, cuando constitutivamente activado por
PTEN
inactivación, PI3K cooperó con oncogénicos
K-ras
en este proceso. Esta conclusión se basó en los resultados de experimentos que incorporan enfoques farmacológicos y genéticos para apuntar PI3K en dos diferentes modelos de ratón genéticos y un
in vitro
modelo. Hemos informado anteriormente de que
PTEN
inactivación coopera con oncogénico
K-ras
para acelerar la tumorigénesis de pulmón, causando tumores pulmonares que son más histológicamente avanzada y con mayor rapidez obstruyen lumina bronquial y sustituyen a los espacios alveolares que las de ratones con oncogénico
K-ras
sola [18]. En conjunto, estos resultados plantean la posibilidad de que la PI3K promueve la tumorigénesis de pulmón a través de sus efectos sobre BASCs. Sin embargo, evidencia concluyente en este sentido requerirá la prueba de que surjan los adenocarcinomas de BASCs. Los estudios de trasplante para determinar si las inyecciones BASC son suficientes para recapitular el desarrollo de adenocarcinoma de pulmón en ratones no han sido reportados hasta ahora. Una población de células madre ha sido identificada en los pulmones de los ratones y de tumores de pacientes con NSCLC que expresa CD133, objetos expuestos se derivan características de las células
in vitro
en esferas (formas y pueden ser inducidas a someterse a la diferenciación terminal), y es tumorigénico en ratones desnudos [19]. Aunque ciertas características de que la población de células madre son similares a los de BASCs (es decir, la respuesta a la lesión pulmonar inducida por naftaleno), su relación permanece por esclarecer.
Cuando se inicia durante la embriogénesis, condicional
Pten
inactivación en el pulmón conduce a la hipoxia y la muerte perinatal, lo que indica que
se requiere Pten
expresión para el desarrollo pulmonar normal [20]. En este estudio, la expresión de Cre en CCSP
Cre ratones comenzó en el día postnatal 4, que nos permiten evaluar
PTEN función de búsqueda: 's en el mantenimiento de la función pulmonar después del nacimiento. Aunque no podemos excluir la posibilidad de que se produjeron cambios sutiles en la función pulmonar, el
PTEN
ratones deficientes en este estudio no tenían alteraciones evidentes en su estructura pulmonar y no presentan ninguna morbilidad de hasta 12 meses de edad, lo que sugiere que, después de su nacimiento, los tejidos pulmonares puede funcionar normalmente sin
PTEN
. Esta aparente resistencia de los tejidos pulmonares a
PTEN
deficiencia está en contraste con las células madre hematopoyéticas adultas, que se agotan dentro de los 40 días después de la inactivación de los
PTEN
[21], lo que indica que la auto-renovación capacidades de células madre hematopoyéticas no pueden ser mantenidas en ausencia de señales reguladoras de crecimiento negativo de PTEN. Aunque las razones de esta diferencia no son claras, puede estar relacionada, en parte, a la poca frecuencia relativa con la que las células madre de pulmón normalmente se dividen [9].
PI3K se ha informado a desempeñar un papel importante en la tumorigénesis iniciado por oncogénicos
K-ras
. ratones Kras
LA2 que tienen un knock-in
PIK3CA
mutación que bloquea la interacción de PI3K con K-ras se desarrollan muchos menos tumores de pulmón que hacer Kras
ratones con LA2 de tipo salvaje
PIK3CA
[22], lo que indica un papel clave para PI3K como mediador aguas abajo de K-ras. Corroborar este punto, encontramos que el tratamiento PX-866 inhibe el crecimiento de tumores de pulmón en ratones Kras
LA1. Sin embargo, sobre la base de otros resultados aquí presentados, la importancia de PI3K en
K-ras
tumorigénesis pulmonar inducida no puede limitarse a su papel como mediador aguas abajo de K-ras. En primer lugar, la expresión de PI3K aumentó a medida que Kras
tejidos pulmonares LA1 se sometió a la progresión maligna de la AAH al adenocarcinoma, lo que sugiere que la PI3K se activa en estas lesiones histológicamente avanzada, en parte, a través de mecanismos K-ras-independientes. En segundo lugar, los resultados reportados aquí y en otras partes [18] indican que
PTEN
inactivación mejorado oncogénico
K-ras
tumorigénesis pulmonar inducida en ratones. La extrapolación de estos resultados, las mutaciones somáticas en células de NSCLC que implican genes que regulan la señalización dependiente de PI3K (es decir,
PTEN, Egfr
, y
PIK3CA
, entre otros [ref. 23]) se puede transformar estos Las células en parte por cooperar con oncogénico
K-ras
. La importancia potencial de mutaciones somáticas secundarias en la promoción de oncogénicos
K-ras
tumorigénesis de pulmón inducida se ilustra por las largas latencias de adenocarcinomas que surgen en ratones modificados para expresar mutante
K-ras
, que desarrollar lesiones pulmonares rápidamente y con alta penetrancia, pero sólo una fracción de las lesiones progresan en los adenocarcinomas y requieren varios meses para hacerlo [3] - [7]
los resultados aquí presentados difieren de los reportados previamente en una. diferente cepa de ratones que se someten condicional
PTEN
supresión inducida por Cre expresión impulsada por el SPC [20]. En ese informe,
PTEN
inactivación era suficiente para aumentar el número de BASC e inducir tumores de pulmón, lo que contrasta con los hallazgos presentados aquí y en otras partes [18] que
PTEN
deficiencia no es suficiente para aumentar números BASC o inducen tumores de pulmón. Ese informe anterior también fue diferente con respecto a los eventos genéticos que cooperaron con
PTEN
deficiencia. En ese estudio,
PTEN
tumorigénesis inactivación acelerada pulmonar inducida por uretano, un carcinógeno que induce con frecuencia
K-ras mutaciones
, pero sólo 2 de 6 tumores evaluados tenían
K-ras
mutaciones, lo que deja abierta la posibilidad de que coopera con uretano
PTEN
pérdida mediante la inducción de mutaciones somáticas de genes distintos de
K-ras
. Esto está en contraste con nuestro modelo en el que los condicionales
K-ras
y
PTEN
alelos recombinados en las mismas células que expresan (CCSP). Por lo tanto, los resultados dispares de estos estudios podrían estar relacionados con los eventos genéticos secundarios en los ratones o diferencias en el diseño experimental, como los antecedentes genéticos de los ratones o de los elementos promotores específicos de conducción expresión Cre uretano tratado.
Métodos
Reactivos
Los anticuerpos adquiridos para estos estudios incluyen conejo anti-p110α (sc-7174), p110β (sc-7175), SPC (SC-13979), de cabra anti-CC10 (sc -9772) y PTEN (sc-6818) (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), de conejo anti-AKT total de (9272), AKT fosforilada-Ser473 (9271), fosforilada-9 Ser21 /GSK3α /β (9331), GSK3 total (9332), se escindió de la caspasa-3 (9661), poli (ADP-ribosa) polimerasa (9542), H3 fosforilada-histona (9701), fosforilados-Ser28 histona H3 (9713P) (Tecnologías de señalización Celular, Danvers, MA) , conejo anti-CCP (WRAB-SPC, Seven Hills Bioreagents, Cincinnati, OH), de conejo anti-CCSP (07-623, Upstate biotecnologías, Lake Placid, Nueva York), conjugado con FITC anti-Sca-1 (557.405), biotina conjugado anti-CD45 (553771) conjugado con biotina-CD31 (558.737), conjugado con PE anti-CD34 (12-0341-33, eBioscience), anti-IgG de conejo Alexa Flour 488 (A11008), y anti-IgG de cabra Alexa Flour 594 (A11058) (Invitrogen, Carlsbad, CA). Otros reactivos adquiridos incluyen estreptavidina-APC (554067, BD Pharmigen), kits de TSA 22 (T20932), 25 (T20935) y 27 (T20937), avidina /biotina bloqueo kit (00-4303) (Invitrogen), dispasa (354235, BD Biosciences), colagenasa /dispasa (10269638001, Roche Biosciences), y 7-aminoactinomicina D (A1310, Invitrogen).
mouse estudios
Para probar si PI3K promueve el desarrollo de tumores, 9 K- ras
ratones LA1 fueron tratados durante 4 semanas con 2 mg /kg /d intragástrico PX-866, un inhibidor de molécula pequeña de PI3K [12], y 12 recibieron vehículo a partir de los 4 meses, edad en la que los pulmones lesiones (AAH) y adenomas son medibles por los escáneres de tomografía computarizada micro-. Los ratones fueron sometidos a estas exploraciones al inicio y finalización del tratamiento para contar el número de lesiones y evaluar los cambios en volúmenes de lesión con el tiempo como se informó anteriormente [24].
Antes de su iniciación, todos los estudios en ratones y se sometieron a aprobado por el Comité de Cuidado y uso de Animales Institucional de la Universidad de Texas-M. D. Anderson Cancer Center. Los ratones recibieron estándares de atención y fueron sacrificados de acuerdo con las normas establecidas por el IACUC. Los ratones y las células y se obtuvieron a través de la colaboración con el Dr. Tyler Jacks, el MIT (ratones Kras
LA1 y Kras
LSL ratones), el Dr. Hong Wu, UCLA (PTEN
Flox ratones), y el Dr. Francesco Demayo, el Colegio Baylor de Medicina (CCSP
ratones Cre).
microarrays de tejidos y análisis inmunohistoquímicos
Se realizó el análisis inmunohistoquímico de PI3K en un microarray de tejido que contiene AAH (n = 17) , adenomas sólidos (n = 31), adenomas papilares /mixtos sólidos (n = 36), adenomas papilares (n = 45), y adenocarcinomas (n = 14) para determinar si los niveles de PI3K cambiar durante la progresión maligna. Se analizó la expresión de las isoformas de PI3K (p110α y beta)
.
Para la tinción inmunohistoquímica, 4 micras, de secciones incluidas en parafina se hornearon a 60 ° C durante 30 min y después se enfrió a temperatura ambiente. Las secciones se incubaron secuencialmente en xileno (5 min dos veces), 100% de alcohol etílico (5 min dos veces), 95% de alcohol etílico (5 min dos veces), y 80% de alcohol etílico (5 min). Después de lavar con agua, las secciones fueron antígeno recuperado utilizando tampón de citrato (pH 6,0, DAKO) en un vapor durante 20 min y se enfrió a temperatura ambiente. a continuación, las secciones se lavaron con TBS-T y se inactivó con peróxido de hidrógeno al 3% en TBS durante 10 min, se bloquearon para la actividad de avidina /biotina, y se incubaron con el anticuerpo primario como sigue: Para p110α y tinción p110β, las secciones se bloquearon con suero de cabra al 5% durante 1 h, se incubaron con anticuerpos primarios durante 1 h a temperatura ambiente, y después se lavó con TBS-T; para fosforilados-Ser28 tinción de la histona H3, las secciones se bloquearon con suero de cabra al 10% a 4 ° C durante la noche, se incubaron con anticuerpo primario durante 30 min a temperatura ambiente, y se lavaron con TBS-T. La tinción se desarrolló utilizando el sistema de sustrato DAB. Los controles negativos incluyen la omisión del anticuerpo primario y pre-incubación de anticuerpo primario con el bloqueo de péptidos. La tinción se cuantificó por un investigador (M.G.R.) cegado como al grupo de tratamiento. expresión intralesional se anotó basa en la intensidad de tinción y la extensión como se describe anteriormente [24].
Detección de BASCs en los tejidos del pulmón
Los antígenos fueron recuperados de los tejidos del pulmón de ratón con 0,01 mol /L de citrato (pH 6; Dako, Glostrup, Dinamarca) durante 25 minutos en un vapor. Los portaobjetos se enfriaron en peróxido de hidrógeno 1,5% en solución salina tamponada con Tris durante 10 minutos y se bloquearon en DAKO bloque de proteína sin suero (Dako) durante 1 h a temperatura ambiente. Las diapositivas fueron incubadas con anticuerpos anti-CCP (sc-7705, Santa Cruz Biotechnology; WRAB-SPC, Seven Hills Bioreagents) y los anticuerpos a 4 ° C durante la noche contra el CCSP (07-623, Upstate Biochemicals). La inmunofluorescencia se desarrolló utilizando kits TSA 25 y 22 (Invitrogen) sobre la base de las instrucciones del fabricante. Se utilizó péptidos de bloqueo y omitido los anticuerpos primarios como controles negativos para determinar la especificidad de los resultados de inmunotinción. La inmunofluorescencia se visualizó usando un microscopio con un sistema de fluorescencia reflejada (Olympus Model IX71SIF-2). adquisición color y la fluorescencia de fondo se optimizaron mediante el software DPController y DPManager (Olympus).
aislamiento BASC y la cultura
Los ratones fueron sacrificados después de 12 semanas, y los pulmones fueron perfundidos con 10 ml de solución salina equilibrada de Hank a través del ventrículo derecho hasta que se borran de la sangre. Las tráqueas fueron inyectados con dispasa (líquido sin diluir, BD Biosciences), seguido de 0,5 a 1 ml 1% de agarosa LMP en agua. Los pulmones se colocaron en hielo picado en trozos, se incubaron con 0.001% de DNasa (Sigma D-4527) y 2 mg /ml de colagenasa /dispasa (100 mg /ml, Roche) en solución salina tamponada con fosfato a 37 ° C durante 45 min, se filtró (100 micras seguido de 40 micras filtro de tamaño de poro), y se centrifugó. Los sedimentos resultantes se resuspendieron en 2 ml de PF10 (10% de suero bovino fetal en solución salina tamponada con fosfato), que normalmente produce 1-2 millones de células totales por ratón. Se lisaron los glóbulos rojos. BASCs fueron aisladas por la clasificación del Sca-1
CD45 pos
neg Pecam
neg CD34
población de células pos a un clasificador de células activadas por fluorescencia de tres láser 13 color FACS Aria (BD Biosciences) que es capaz de clasificar cuatro subpoblaciones a baja presión con una velocidad máxima de 20 millones de células /hora. BASCs representaron aproximadamente el 0,1% del total de la población de células ordenadas.
La uniformidad o la pureza de las células clasificadas no se comprobó de forma rutinaria debido a que las células de interés habrían sido consumidos en el proceso. Dicho esto, las células fueron purificados-tipo de la más alta pureza posible colocando puertas en el tamaño (por dispersión frontal y lateral), excluyendo los dobletes (por ancho de dispersión hacia adelante
área y frente
anchura de dispersión lateral
frente con Z.), y las células de aislamiento con los marcadores de interés. Además, la uniformidad de las poblaciones de células clasificadas utilizados en estos ensayos se reflejó en la reproducibilidad de nuestros hallazgos;