Extracto
El cáncer colorrectal (CCR) es uno de los cánceres más comunes en los países desarrollados. Para identificar redes moleculares y procesos biológicos que están desregulados en el CCR en comparación con la mucosa colónica normal, se aplicó conjunto de genes de enriquecimiento de análisis del transcriptoma de dos conjuntos de datos independientes, incluyendo un total de 137 CRC y diez muestras normales de la mucosa del colon. Ochenta y dos conjuntos de genes descritos en la Enciclopedia de Kyoto de genes y genomas de base de datos habían alterado significativamente la expresión de genes en ambos conjuntos de datos. Estas redes incluidos asociados con la división celular, el mantenimiento de ADN, y el metabolismo. Entre las vías de señalización con cambios conocidos en los genes clave, la "red de señalización fosfatidilinositol", que comprende parte de la vía PI3K, se encontró desregulado. Los genes regulados negativamente en esta vía se encontraban varios miembros de la familia de proteínas fosfolipasa C, y la reducción de la expresión de dos de ellos,
plcd1
y
PLCE1
, fueron validados con éxito en biopsias de CRC (n = 70) y líneas de células (n = 19) por análisis cuantitativos. Se encontró que la represión de los genes asociados con
KRAS
mutaciones (
P = 0,005
y 0,006, respectivamente), y se observó que los carcinomas de microsatélites estables con una reducción
plcd1
expresión una mayor frecuencia de
TP53
mutaciones (
P
= 0,002). metilación del promotor análisis de
plcd1
y
PLCE1
realizado en líneas celulares y biopsias de tumores reveló que la metilación de
plcd1
puede contribuir a la reducción de expresión en el 40% de los carcinomas inestables microsatélites . En conclusión, hemos identificado las vías desreguladas significativamente en el CCR, y la represión de los
plcd1
y
PLCE1
expresión validado. Esto pone de manifiesto que el enfoque puede servir de guía GSEA descubrimiento de nuevos biomarcadores en el cáncer
Visto:. Danielsen SA, Cekaite L, Agesen TH, Sveen A, Nesbakken A, Thiis-Evensen E, et al. (2011) fosfolipasa C isoenzimas están desreguladas en Cáncer Colorrectal - conocimientos adquiridos a partir conjunto de genes de enriquecimiento de análisis del transcriptoma. PLoS ONE 6 (9): e24419. doi: 10.1371 /journal.pone.0024419
Editor: Baochuan Lin, Laboratorio de Investigación Naval, Estados Unidos de América
Recibido: 20 de mayo de 2011; Aceptado: August 10, 2011; Publicado: 1 de septiembre 2011
Derechos de Autor © 2011 Danielsen et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue financiado por becas de la Sociedad de cáncer de Noruega (http://www.kreftforeningen.no/english) (RAL: sin PR-2006-0442, incluyendo becas de doctorado en Tha SAD y; GEL:. PR-2008 a 0163; RIS : PR-2007-0166), por una beca del Consejo de Investigación de Rikshospitalet-Radiumhospitalet Salud Empresa (RAL: incluyendo una beca de doctorado a AS), con una donación de la Autoridad de Salud regional de Noruega sudoriental (http: //www .helse-sorost.no /omoss /Inglés /Sider /Page.aspx) (RAL: PR-2009-093, que comprenden primas de postdoctorado para LC), y la beca de la Fundación Noruego de Salud y Rehabilitación (http: //www. extrastiftelsen.no/) a través de los fondos extra (ETE: HF-52015/002). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
El cáncer colorrectal (CCR; MIM#114500) ocupa el tercer lugar en la incidencia de cáncer en todo el mundo con un estimado de 1.2 millones de nuevos casos por año [1]. De acuerdo con el Comité Americano Conjunto sobre el Cáncer (AJCC) las tasas de supervivencia a 5 años para los pacientes diagnosticados en estadio I y IV CRC etapa, son el 93% y 8%, respectivamente, por lo que el pronóstico del paciente depende en gran medida del estadio del tumor al momento del diagnóstico [2 ]. CRC desarrolla a través de etapas histopatológicos distinto de lesiones precursoras benignos a tumores malignos, conocidos como la secuencia adenoma-carcinoma. El desarrollo es impulsado por la acumulación progresiva de alteraciones genéticas y epigenéticas de genes específicos, y conserva las redes que ejercen efectos pleiotrópicos en las células cancerosas a menudo están dirigidos de señalización. Típicamente, los tumores malignos se caracterizan por la fenotipos moleculares inestabilidad de microsatélites (MSI), inestabilidad cromosómica (CIN), y el fenotipo isla methylator CpG (CIMP) [3]. Los genes más comúnmente alterado durante la Convención de desarrollo constituyen la base para estos fenotipos e implican varias vías de señalización y redes (Figura 1A).
A) genes clave específicas en los diferentes fenotipos de CRC durante el desarrollo de lesiones precursoras de carcinomas . Los genes en negrita representan MAPK, PI3K, y las redes de señalización TP53, y su estado de mutación han sido previamente determinado [38]. B) La figura muestra como parte de la red de fosfatidilinositol interactúa con la vía PI3K canónica. Los genes de los que se utilizan los datos de estado de mutación para la asociación análisis en el presente trabajo son de color azul, rosa y marrón. Abreviaturas: GPCR, G-receptor acoplado a proteína; RTK, el receptor de la tirosina cinasa.
Expresión
El ARN mensajero (ARNm) de perfiles de estudios han proporcionado una mejor comprensión de las funciones de varios genes importantes en la iniciación y progresión del cáncer, incluyendo CRC [4]. A pesar del creciente conocimiento de los patrones de expresión de genes individuales, así como las firmas de genes prometedor, menos visión se ha obtenido en las alteraciones de redes moleculares y vías de señalización de la gran cantidad de datos generados en estos estudios. Aplicando el enfoque estadístico de conjunto de genes de enriquecimiento de análisis (GSEA) a los datos de expresión de genes, genes que interactúan cuyos niveles de expresión se cambian de forma coordinada se pueden explorar [5]. El método GSEA tiene en cuenta la expresión de todos los genes dentro de un conjunto de genes /vía anotada. Hay varias bases de datos y definiciones conjunto de genes que unen los genes de sus anotaciones funcionales. Los términos más utilizados es la base de datos de ontología de genes (GO), que se basa en una combinación de asignación de cálculo y manual de los genes que ir [6]. Sin embargo, estos términos no corresponden directamente a las vías conocidas. La Enciclopedia de Kyoto de genes y genomas (KEGG) es una base de datos vía molecular de la mano curada y actualizados con frecuencia metabólicas, reguladoras, y vías de señalización [7]. El uso de esta base de datos conservadora anotado, la redundancia en la estructura anidada de las asociaciones de genes representados por los términos de GO se puede evitar. En comparación con el análisis de la expresión de genes individuales, GSEA da una idea de los cambios en la expresión coordinada de los genes dentro de las vías, por lo tanto, altera las vías y los genes en este documento no se sabe están involucrados en la carcinogénesis se pudo identificar señalización.
La importancia de la fosfatidilinositol canónica 3-quinasa (PI3K) y la vía en el cáncer se ha establecido en numerosas publicaciones en la última década [8]. Esta red de señalización tiene impacto en varios fenotipos de cáncer crítica, tales como la proliferación celular, la supervivencia, el metabolismo y el crecimiento del tumor [8]. Una rama de la red se solapa con la red de señalización fosfatidilinositol que está mediando señales a través de proteínas de la fosfolipasa C (PLC) (Figura 1B). Esta red probablemente crosstalks con la MAPK y las vías de TP53, vías importantes en el desarrollo de CCR. La familia de proteínas PLC comprende trece isoenzimas divididos en seis subtipos distintos, β, γ, δ, ε, ζ y η, basados en la estructura y los mecanismos de activación de regulación. Las isozimas de PLC contienen varios dominios comunes, así como dominios específicos de subtipo, que pueden hacerlos capaces de regular las reacciones de lipasa-independiente [9]. Además, son solubles y localizado principalmente en el citosol, pero se vuelven translocado a la membrana plasmática en respuesta a la activación del receptor [10]. En la membrana que hidrolizan fosfatidilinositol (4,5) fosfato (PIP
2) y generan el importante segundo mensajero diacilglicerol (DAG) e inositol 1,4,5-trifosfato (IP
3). Desequilibrio de los niveles phosphoinositide (PIP
2 y PIP
3) se ha demostrado que induce defectos en la actividad del canal, el tráfico y la polaridad celular normal [9]. Así, la regulación correcta de los fosfoinosítidos por ejemplo, enzimas PLC es esencial y la regulación aberrante contribuye a varias enfermedades humanas, incluyendo el cáncer [9].
Mediante la exploración de la expresión génica de los procesos predefinidos biológicas y circuitos moleculares en dos conjuntos de datos normales CRC y la mucosa del colon obtenidos utilizando diferentes plataformas de microarrays, se identificó una lista de las vías alteradas significativamente por la expresión diferencial de genes en el CCR. Seleccionamos la "red de señalización fosfatidilinositol" y dos de los componentes del mercado liberalizado en el mismo,
plcd1 gratis (HGNC: 9060) y
PLCE1 gratis (HGNC: 17175), para estudios detallados y se compararon los resultados con los datos clínico-patológicos y estado de la mutación de varios genes conocidos por ser alterados en el CCR.
Resultados
Liberalizado vías KEGG en CRC
en total, 152 KEGG conjuntos de genes estaban presentes en ambas expresión génica de datos. De estos, GSEA reveló 33 significativamente upregulated y 49 downregulated significativamente los procesos biológicos y las vías de CRC en comparación con mucosa colónica normal (
P
≤0.05; Figura 2). Once redes alterado de manera significativa tenían puntuaciones de enriquecimiento opuestos entre los conjuntos de datos, mientras que 44 fueron encontrados alterados significativamente en sólo uno de los conjuntos de datos. redes KEGG desregulados significativamente en el CCR en comparación con la mucosa normal en ambos conjuntos de datos se enumeran en la Tabla S1 (n = 82). El hecho de que estas vías fueron significativamente alterados (
P
≤0.05) en dos conjuntos de datos analizados de forma independiente, obtenidos de diferentes plataformas de microarrays, da un riesgo de 1/400 única para cada vía para ser incluido como alterado significativamente meramente por casualidad. Por lo tanto, no se realiza ninguna corrección adicional para múltiples ensayos (esto también da cuenta de la parte superior de la Tabla 1). Las 82 redes incluyen conjuntos de genes responsables de los rasgos generales de células cancerosas, varios circuitos metabólicos, así como cascadas de señalización más famosos como el TP53 y las vías de MAPK. Los gráficos de los niveles de expresión génica en muestras de CRC
especímenes mucosa colónica normal frente
para todos los genes en el las tres redes más downregulated en CRC tres más upregulated y se muestran en la Figura S1, y sus genes estadísticamente expresados diferencialmente se enumeran en S2 tabla.
el diagrama muestra que los resultados de la GSEA fueron altamente reproducible con 33 y 49 vías en forma conjunta hacia arriba y regulación a la baja a través de los dos conjuntos de datos, respectivamente.
el "sistema de señalización de la fosfatidilinositol"
el "sistema de señalización de la fosfatidilinositol" fue una de las vías moleculares que se encuentran para ser regulados a la baja en el CCR en comparación con la mucosa normal,
es decir
tener más downregulated que los genes upregulated. Un total de 22/59 y 27/76 genes que pasan los criterios de calidad fueron desregulados significativamente en la CRC en los AB y HuEx conjuntos de datos, respectivamente (Figura 3, Tabla 1). De los 11 genes que se encuentran desregulados en ambas series, que comprende las quinasas de inositol, diacilglicerol quinasas, y fosfolipasas, dos fueron regulados positivamente de manera significativa, mientras que nueve fueron downregulated. Curiosamente, encontramos cuatro lipasas regulación a la baja (
plcd1
,
plcd3
,
PLCE1
, y
plcg2)
que fueron isoenzimas que pertenecen a la fosfolipasa estrechamente relacionado C (PLC) de la familia de las proteínas.
plcd1
y
PLCE1
, los dos genes PLC en el "sistema de señalización de la fosfatidilinositol" más significativamente regulados a la baja en comparación con las muestras normales de la mucosa en los conjuntos de datos HuEx y AB, respectivamente, fueron elegidos para su posterior validación .
en total, 38 genes en el "sistema de señalización de la fosfatidilinositol" se alteraron en una o ambas de datos, once genes fueron encontrados desregulados a través de ambos conjuntos de datos.
Validación de
plcd1
y
PLCE1
la expresión del ARNm
Desde cuantitativa con transcripción inversa-PCR,
plcd1
y
PLCE1
estaban claramente reprimido en muestras de tejidos cancerosos en comparación con los normales mucosa (
P
= 3 × 10
-16 y
P
= 4 × 10
-15), confirmando la regulación a la baja que se encuentra en los datos de microarrays de expresión (Figura 4) . Todos los años analizados líneas celulares de cáncer de colon también muestran la represión significativa de los dos genes en comparación con mucosa normal (
P
= 2 × 10
-10 y
P
= 1 × 10
-8).
Los niveles de expresión de
plcd1
y
líneas celulares PLCE1 Hoteles en CRC y el cáncer de colon evaluados por RT-PCR fueron significativamente regulados a la baja en comparación con el normal de colon mucosa.
PLC
expresión los valores asociados a las variables clinicopatológicas y genéticas
Curiosamente, había una estrecha relación entre la baja expresión de ambos
plcd1
y
PLCE1
y
KRAS
mutaciones en muestras de CRC (Tabla 2). Por otra parte, la reducción de los niveles de expresión de
plcd1
se asociaron significativamente con
TP53
mutaciones y el fenotipo de MSS. Para ambos genes PLC, los niveles de expresión se redujeron en etapas de la enfermedad más avanzada. Expresión valores de
PLCE1
se redujo en estadio II (
P
= 0,06) y disminuyó significativamente en los tumores en estadio III (
P
= 0,005), en comparación con los tumores en estadio I . Sin embargo, este no fue el caso para la enfermedad metastásica distante (etapa IV). La misma tendencia se observó también para
plcd1
, donde los niveles de expresión se redujo significativamente en la etapa III en comparación con la etapa I (
P
= 0,03). No se encontraron asociaciones entre los
plcd1
y
PLCE1
expresión y mutaciones en
BRAF
,
PIK3CA
, o
PTEN
. Para el cuadro 2 debe tenerse en cuenta que, debido a las múltiples pruebas (n = 16), existe el riesgo de falsas asociaciones significativas.
Análisis
Promotor metilación de
plcd1
y
PLCE1
plcd1
y
PLCE1
podrían ser objetivos para la metilación del promotor ya que sus niveles de expresión eran bajos en comparación con CRC muestras de mucosa normal del colon. Ambos genes tienen las islas CpG en sus promotores y su expresión se volvió upregulated en líneas celulares tratados con agentes epigenéticos reactivación (5-aza-2'deoxycytidine; AZA y tricostatina A; TSA). metilación completa o parcial de la
plcd1
promotor se encontró en el 79% (15/19) de las líneas celulares de cáncer de colon, detectado por tanto cualitativa como cuantitativa reacción en cadena de la polimerasa específica de metilación (MSP y qMSP, respectivamente ). Las cuatro líneas de células restantes fueron completamente no metilado. El estado de metilación de las líneas celulares de cáncer de colon se confirmó por secuenciación de bisulfito usando dos conjuntos no solapados de pares de cebadores que cubren total de 69 sitios CpG. No hubo asociación entre la metilación y MSI-estado de las líneas celulares. Para los carcinomas primarios, solamente nueve de cada 70 (13%) muestras se metilado, según la evaluación de MSP y qMSP. La mayoría de los tumores considerados positivos para la metilación muestra valores bajos PMR (mediana 5,69). Curiosamente, ocho de los nueve tumores metilados eran MSI, produciendo una frecuencia de metilación del 40% (8/20) en este subgrupo. Por otra parte, todos los tumores MSI metilados tenían mutaciones en
BRAF
, de tipo salvaje, mientras que el tumor era MSS metilado. Para
líneas celulares de cáncer PLCE1, España sólo uno de los 19 de colon mostró metilación del promotor. Esto fue confirmado por secuenciación de bisulfito que cubre 47 sitios CpG. Debido a la baja
PLCE1
frecuencia de metilación del promotor entre las líneas celulares, muestras de tejido fueron no sometido a análisis de metilación.
Discusión
Mediante la exploración de la expresión de genes dentro de las vías moleculares predefinidos en dos conjuntos de datos independientes CRC transcriptoma, se han identificado varias redes moleculares y componentes de la misma que están desregulados en el CCR y podrían contribuir a la carcinogénesis.
el "ciclo celular" no fue sorprendente que el gen más ampliamente alterado encuentra en nuestros análisis. Su regulación adecuada es esencial para asegurar la correcta transmisión de la información genética de una generación a la siguiente, por lo que la desregulación de varios componentes del ciclo celular se define como sellos distintivos de cáncer. Nuestro resultado está en línea con varios estudios comparables de CRC en conjuntos de genes restringidos exclusivamente a las vías relacionadas con el cáncer [11] y varias bases de datos en línea que comprenden más vías generales, se han explorado [12] - [14]. CRCs muestra los cambios de expresión en numerosas vías metabólicas,
es decir
"La fosforilación oxidativa" era la red metabólica más significativamente downregulated a través de ambos conjuntos de datos, mientras que el metabolismo de las purinas, pirimidinas, y los N-glicanos, además de la "fosfato de pentosa vía "se upregulated. La purina y pirimidina metabolismo se encontró recientemente que se upregulated también en los adenomas en comparación con la mucosa normal, lo que indica que las alteraciones de estas redes son eventos tempranos en la tumorigénesis [14]. La reprogramación del metabolismo energético se puso en marcha recientemente como un sello distintivo que emerge de cáncer, y los resultados también están de acuerdo con lo descrito Otto Warburg, hace medio siglo, conocido como el "efecto de Warburg". Se identificó un cambio en el metabolismo de la glucosa de la fosforilación oxidativa para la glucólisis aeróbica en las células tumorales [15]. Limitar el metabolismo en gran parte a la glucólisis permite la conversión de los intermedios glucolíticas en nucleósidos y aminoácidos. Esto a su vez facilita la biosíntesis de macromoléculas y orgánulos necesarios para el aumento de la producción de nuevas células. También se encontraron los procesos biológicos que implican la replicación del ADN y varias formas de mecanismos de reparación del ADN desregulado en nuestros conjuntos de datos. Estos sistemas fundamentales son frecuentemente puestos fuera de juego, no sólo en el cáncer, sino también en otras enfermedades y síndromes, lo que subraya la gravedad de no ser capaz de copiar los errores de ADN o reparación de una manera correcta.
Además de los rasgos más generales de células cancerosas, circuitos centrales de CRC como MAPK, TP53-, y fosfatidilinositol sistemas, en los que por lo general uno o unos pocos jugadores destacados son reportados a ser alterado con frecuencia a nivel del ADN (debido a mutaciones puntuales de señalización, amplificaciones, y /o supresiones; [8], [16]), se encontraron significativamente desregulado en nuestros análisis. Esto implica que la expresión de genes alterados de varios miembros menos "famosos" en las vías también contribuyen en la carcinogénesis colorrectal. En este estudio se observó que los genes como
PIK3CA
y
PTEN
se expresa en muestras tumorales, pero no a niveles significativamente diferentes de tejido de colon normal en ambos conjuntos de datos. Nosotros y otros han demostrado que estos genes a menudo sufren de alteraciones en los niveles de proteína o de ADN en lugar de por los cambios en la expresión de ARNm [8], [17] - [19]
Para revelar genes adicionales en. el "sistema de señalización de la fosfatidilinositol" implicado en la tumorigénesis, hemos explorado el nivel de expresión de todos sus componentes como anotada en KEGG. Se encontró que ambos fosfatasas de inositol, diacilglicerol kinasa, y fosfolipasas tener expresión alterada. Entre las enzimas fosfolipasa, miembros de la familia de la fosfolipasa C estaban bien representados, lo que indica un papel importante para esta familia en CRC. Esto se puso de relieve por RT-PCR validación de los análisis que los niveles de expresión de
plcd1
y
PLCE1
fueron regulados a la baja ampliamente en CRC comparación con la mucosa colónica normal. La represión de
plcd1
está de acuerdo con los resultados presentados por Nomoto y colegas en 1995, donde se reportan niveles indetectables de proteína plcd1 en líneas celulares de cáncer de colon y ocho niveles disminuyeron en doce de los trece carcinomas de colon en comparación con su emparejado muestra de mucosa normal [20]. Varios grupos han sugerido un papel para plcd1 en la regulación del ciclo celular G
1 /S-puesto de control, sin embargo, existen resultados contradictorios sobre si tiene una función supresora de tumores oncogénicos o [21] - [23]. Sobre la base de los presentes hallazgos, sugerimos la última función de
plcd1
en el CCR. También se han notificado resultados similares para carcinomas de células escamosas de esófago (CECA), gástrico y cáncer de mama [21], [24] - [26]. Curiosamente, los niveles bajos de expresión de
plcd1
fueron fuertemente asociada con mutaciones en
TP53
y
KRAS
, así como a los tumores del fenotipo SMS; A pesar de la importancia biológica de estas asociaciones que queda por determinar.
La represión observada de
PLCE1
, el segundo gen investigado en detalle, se apoya en los resultados de Sorli
et al
. que también demostró significativamente reducidos niveles de expresión de mRNA en muestras de cáncer de colon y recto y las líneas celulares de cáncer de colon, así como por Wang y colegas que informaron de una frecuencia de la pérdida de 36% de heterocigosidad (LOH) de 10q23 donde
PLCE1
se encuentra y regulación a la baja de PLCE1 en 21/50 muestras de cáncer colorrectal en comparación con el tejido emparejado normal [27] - [29]. Por otra parte, se observó que los niveles de expresión de
PLCE1
fueron disminuyendo con estadios más avanzados, lo que indica que la represión de este gen es beneficioso para la progresión del cáncer. Cabe destacar que el nivel parece elevarse cuando se alcanza la enfermedad metastásica (estadio IV), un fenómeno descrito anteriormente para
plcd1
y
plcd3
en cáncer de mama [24]. No obstante, debe tenerse precaución cuando se interpretan los resultados para el grupo IV etapa presente, y cuando se incluyen sólo siete tumores. Los niveles de expresión de
plcd1
y
PLCE1
fueron correlacionados, y como se esperaba, la reducción de expresión de ambos genes se asoció a las etapas de tumores más avanzados (datos no mostrados). Sin embargo, los niveles de expresión individuales y los niveles de expresión de ambos genes combinados no se correlacionaron con la supervivencia del paciente (datos no mostrados). Curiosamente, como por
plcd1
, baja expresión de
PLCE1
está fuertemente asociada con mutaciones en
KRAS
. Desde PLCE1 se encuentra que es tanto un efector aguas arriba y aguas abajo de las proteínas Ras de la familia [30], la correlación de mutado
KRAS
con los niveles de expresión reducidos más probable juega un papel crítico en la tumorigénesis CRC. Además, se informó recientemente de que la sobreexpresión de PLCE1 en una línea celular de cáncer de colon inhibió la proliferación de células tumorales, la reducción de número de colonias formadas, la migración reducida, y aumento de la apoptosis [29], lo que sugiere un papel supresor tumoral para este gen en CRC.
a continuación, investigaron si los reducidos niveles de expresión de
plcd1
y
PLCE1
podría ser debido a la hipermetilación del promotor. Esta es una forma común para inactivar los genes supresores de tumores, y ambas fosfolipasas se han presentado como candidatos para la hipermetilación del promotor [27]. Sin embargo, esto hasta ahora sólo ha sido confirmado en
plcd1
dentro de un rango de 52-62% de metilación en CECA, cáncer gástrico y de mama [21], [25], [26]. Nuestros resultados de la secuenciación de bisulfito qMSP y no pueden confirmar
PLCE1
como un objetivo de este tipo de silenciamiento epigenético, y pese a la elevada frecuencia de metilación en líneas celulares de cáncer de colon, la metilación en el
plcd1
promotor puede solamente explicar una expresión reducida en un subgrupo de los carcinomas. Curiosamente, sin embargo, descubrimos que todos menos uno de los tumores metilados eran MSI, dando una frecuencia de metilación de casi el cuarenta por ciento de los carcinomas con la reparación de defectos desajuste. Además, los tumores MSI metilados fueron localizados en el lado derecho del intestino y tenía
BRAF
mutación, en línea con el fenotipo CIMP [3].
Al someter dos conjuntos de datos CRC del transcriptoma de GSEA , hemos identificado una serie de conjuntos de genes estadísticamente significativas desregulados en el CCR, y han demostrado que este enfoque puede guiar descubrimiento de nuevas dianas moleculares y biomarcadores para el cáncer. analiza la verificación de los genes seleccionados dentro de una de las vías de señalización desregulados identificados,
plcd1
y
PLCE1
, confirmó la reducción de los niveles de estas transcripciones en el CCR en comparación con las muestras de mucosa normal. Tanto un supresor del tumor y el tumor de promover el papel de estos genes y de los productos de proteínas se han sugerido en relación con el desarrollo del cáncer, dependiendo de tejido de origen [9]. Los datos actuales apoyan el papel supresor tumoral de
plcd1
y
PLCE1
en el CCR, que para
plcd1
posiblemente puede explicarse por un mecanismo epigenético en carcinomas de microsatélites inestables.
Materiales y Métodos
Ética declaración
escrito el consentimiento informado se obtuvo de todos los sujetos incluidos. Todas las muestras fueron recuperados de los biobancos de investigación como parte de los proyectos de investigación aprobados de acuerdo con las directrices éticas nacionales. Las series de biobancos se han registrado conforme a la legislación nacional y está aprobado por el Comité Regional de Ética de Investigación Médica (REK Sudeste S-09282c2009 /4958, Biobanco 2781; REK del Sur: 2003, S-02126, Biobanco 296-2005-174211 ).
transcriptome conjuntos de datos
Dos independientes del transcriptoma de tejido colorrectal perfiles de conjuntos de datos previamente generados en nuestro laboratorio se utilizaron para este estudio GSEA [31], [32]. Los datos brutos son accesibles a través de la Expresión Génica del NCBI Omnibus repositorio público de los microarrays de datos (números de acceso GSE25071 y GSE24550). El primer conjunto de datos incluye perfiles de expresión génica de 46 CRC y cuatro muestras de mucosa normal del colon obtenidos utilizando el Applied Biosystems 1700 plataforma (Applied Biosystems por Life Technologies, Foster City, CA, EE.UU.; AB) [31]. El segundo conjunto de datos de expresión génica contiene 91 CRC y seis muestras de mucosa normal del colon generados usando los Affymetrix GeneChip Human exón 1,0 ST arrays (Affymetrix, Santa Clara, CA, USA; HuEx) [32]. No hubo muestras de solapamiento entre los dos conjuntos de datos de microarrays. Un resumen de los datos clínicos de los pacientes incluidos en los conjuntos de datos se pueden encontrar en la Tabla S3.
Muestras de tejidos y líneas celulares de cáncer de
El paciente muestras incluyeron en los análisis de verificación de destino constituye un subconjunto de la tumores utilizados en el conjunto de datos HuEx (n = 70), y 17 muestras normales de la mucosa del colon (incluyendo seis del conjunto de datos HuEx). Todas las muestras fueron tomadas de pacientes sometidos a cirugía primaria para el CCR en el Hospital de la Universidad de Oslo, Aker, Oslo, entre 2005 y 2008. Las muestras normales de la mucosa del colon se tomaron de las zonas libres de la enfermedad en el margen de resección de las muestras de CRC (≥ 10 cm de el tumor). Una descripción clínico-patológica que se puede encontrar en la Tabla S4.
líneas celulares de cáncer de colon Diecinueve (Co115, Colo320, EB, FRI, HCT15, HCT116, HT29, IS1, IS2, IS3, LoVo, LS1034, LS174T, RKO, SW48, SW480, TC7, TC71, y V9P) se incluyeron en el estudio, y se describen a fondo en [33]. Estos se cultivaron bajo condiciones estándar, que será entregado a petición. Seis de las líneas celulares (HCT15, RKO, SW48, HT29, LS1034, y SW480) fueron sometidos a un tratamiento epigenético de usar la droga desmedíante AZA (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EE.UU.; 1 M durante 72 horas), la inhibidor de la histona deacetilasa TSA (Sigma-Aldrich; 0,5 M durante 12 horas), y una combinación de ambos fármacos (1 M AZA durante 72 horas y 0,5 mM TSA añaden los últimos 12 horas). En paralelo, las mismas líneas celulares se cultivaron sin tratamiento durante 72 horas. Todas las líneas celulares disponibles en el mercado se autentican utilizando AmpFLSTR Identifiler Amplificación por PCR Kit (Applied Biosystems).
aislamiento de ácidos nucleicos
ADN
partir de líneas celulares de tejido de cáncer de colon y de colon recién congelados se extrajo por una protocolo de fenol /cloroformo estándar. ARN a partir de tejido tumoral se extrajo usando el kit Qiagen AllPrep DNA /RNA Mini (Qiagen GmbH, Hilden, Alemania), mientras que el ARN de muestras de mucosa de colon normal y las líneas celulares de cáncer de colon fue aislado por el Kit Ambion RiboPure ™ (Life Technologies, Carlsbad, CA, EE.UU.) y Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.), respectivamente. Todos los procedimientos se realizaron de acuerdo con los protocolos de los fabricantes.
Gene Conjunto de Análisis de enriquecimiento (GSEA)
Para los conjuntos de genes GSEA se definieron de acuerdo a la colección vía KEGG (Homo sapiens (humanos) Release 53.0 ) [7]. El análisis se realizó utilizando el paquete GSEABase en Bioconductor /R versión 2.9.2 [34]. Los dos conjuntos de datos de microarrays de expresión génica de CRC
frente
mucosa colónica normal fueron sometidos de forma independiente para GSEA. preprocesamiento de los datos se realizó como se describe anteriormente [31], [32]. rango intercuartílico (IQR) se utilizó como una medida de la variabilidad. Los genes con RIC & lt; 0,5 fueron excluidos de los nuevos análisis con GSEA. Para los genes dirigidos por múltiples grupos de transcripción (HuEx) o sondas (AB), se utilizó el reportero con mayor variabilidad. Los genes no asignadas a ningún KEGG vías también fueron excluidos del análisis. Se evaluaron un total de 3.361 y 4.797 genes con un papel con anotaciones en 205 y 220 KEGG vías para los conjuntos de datos AB y HuEx, respectivamente. Rutas que incluía menos de 10 genes anotados fueron retirados de un análisis más detallado, dejando 167 y 185 vías en los respectivos conjuntos de datos. Dos caras, se realizaron dos pruebas t de clase suponiendo varianzas iguales a través de CDN y muestras normales para todos los genes incluidos. Una puntuación de enriquecimiento conjunto de genes se calculó como la suma de las estadísticas t observados para los genes en el conjunto, dividido por la raíz cuadrada del número de genes en el conjunto. conjunto de genes
P
-valores se calcularon basándose en el vector de probabilidades de las estadísticas t través de los genes incluidos [35].
Validación de plcd1 y PLCE1 niveles de expresión por cuantitativos Transcription- inversa PCR
el ARN total a partir de tejido CRC y las muestras de mucosa normal se convirtió a cDNA utilizando la alta capacidad de cDNA transcripción reversa Kit (Applied Biosystems). El ADNc de dos controles endógenos,
ACTB gratis (Hs99999903_m1) y
GUSB gratis (Hs99999908_m1), así como ADNc de los genes
plcd1 gratis (Hs00979908_m1) y
PLCE1
(Hs00275279_m1) se amplificó por separado en 384 así placas como se describe por el fabricante (Applied Biosystems). La expresión génica se mide en tiempo real utilizando el sistema de detección de secuencias 7900 HT (Applied Biosystems). Las muestras se analizaron por triplicado y se utilizó el valor medio para el análisis de datos. Una serie de dilución de cDNA a partir del RNA humano universal de referencia (Agilent, Santa Clara, CA, EE.UU.) se utilizó para generar la curva estándar. Los niveles de expresión de
plcd1
y
PLCE1
se normalizaron contra el valor medio de los controles endógenos.
tratamiento de bisulfito y el ensayo de metilación del promotor diseño em
Antes a MSP cualitativa y cuantitativa y secuenciación de bisulfito, 1,3 g de ADN de cada muestra fue de bisulfito de sodio tratado mediante el bisulfito Kit Epitect (Qiagen) de acuerdo con el protocolo del fabricante.