Extracto
La mayoría de las aprobaciones de nuevos fármacos para el cáncer se basan en dianas terapéuticas existentes. Un enfoque para la identificación de nuevos objetivos es llevar a cabo la interferencia de ARN (RNAi) pantallas de viabilidad celular de alto rendimiento. Se describe un nuevo enfoque que combina control ARNi en múltiples líneas celulares con expresión génica y el perfil genómico para identificar nuevas dianas contra el cáncer. Se realizó RNAi pantallas paralelas en varias líneas celulares de cáncer para identificar los genes que son esenciales para la viabilidad en algunas líneas celulares pero no en otros, lo que sugiere que estos genes constituyen factores clave de la supervivencia celular en las células cancerosas específicas. Este enfoque se verificó mediante la identificación de los
PIK3CA
, el silenciamiento de los cuales era selectivamente letal para la línea celular MCF7, que alberga una oncogénico
PIK3CA
mutación activadora. Hemos combinado nuestro enfoque de ARNi funcional con la expresión génica y el análisis genómico, lo que permite la identificación de varias quinasas novedosos, incluyendo
WEE1
, que son esenciales para la viabilidad sólo en líneas celulares que tienen un nivel elevado de expresión de esta quinasa. Además, hemos identificado un subconjunto de tumores de mama que expresan altamente WEE1 lo que sugiere que WEE1 podría ser una nueva diana terapéutica en cáncer de mama. En conclusión, esta estrategia representa una nueva y eficaz estrategia para la identificación de los funcionalmente importantes dianas terapéuticas en el cáncer
Visto:. Iorns E, Señor CJ, Grigoriadis A, McDonald S, K Fenwick, MacKay A, et al . (2009) integrado funcional, la expresión génica y el análisis genómico para la identificación de dianas del cáncer. PLoS ONE 4 (4): e5120. doi: 10.1371 /journal.pone.0005120
Editor: Toru Ouchi, de la Northwestern University, Estados Unidos de América
Recibido: 12 Enero, 2009; Aceptado: March 6, 2009; Publicado: 9 Abril 2009
Derechos de Autor © 2009 Iorns et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Agradecemos Breakthrough Breast Cancer y la Comisión de Educación terciaria Nueva Zelanda para la financiación de este estudio. También reconocemos la financiación del NHS para el Centro de Investigación Biomédica INDH. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Centro para el diseño de nuevas estrategias terapéuticas para el cáncer es la identificación de genes que son críticos para la supervivencia de las células tumorales, pero que son en gran medida redundante en las células normales [1]. Correlacionar los cambios moleculares con la génesis tumoral ha proporcionado una vía para la identificación de dianas de fármacos potenciales y proporciona la razón de los esfuerzos para caracterizar la variación genética y la expresión de genes en los tumores. Sin embargo, la naturaleza correlativa de estos datos significa que frecuentemente no es posible determinar si las observaciones son causal o simplemente un efecto del estado de enfermedad [2].
ARN de interferencia (ARNi) es un mecanismo de origen natural que regula la expresión génica a nivel post-transcripcional. En células de mamíferos, RNAs cortos de interferencia (siRNAs) median la degradación del ARN mensajero transcripciones complementaria (ARNm) de una manera dependiente de la secuencia [3]. Esta especificidad de secuencia de RNAi puede utilizarse experimentalmente para silenciar genes específicos mediante la transfección de siRNAs en células de mamífero. Esta tecnología ha sido ampliado en las bibliotecas de ARNi que abarcan los reactivos que se dirigen a una amplia gama de transcripciones, permitiendo que el papel de múltiples genes en un proceso celular que se deben evaluar de una manera imparcial [4], [5]. pantallas de RNAi se han utilizado para identificar genes importantes para fenotipos celulares de cáncer, incluyendo la viabilidad celular [6], [7].
Demostramos que pantallas de RNAi se pueden utilizar para identificar los genes que están diferencialmente requieren para la viabilidad de cáncer líneas celulares y, como prueba de este principio, identificar el oncogén conocido
PIK3CA
como esencial para la viabilidad de las células MCF7 con un activador
PIK3CA
mutación. Se demuestra que la combinación de análisis funcional RNAi con la expresión génica y el análisis genómico proporciona una nueva estrategia para la identificación de los factores clave de las células cancerosas específicas, que son posibles nuevas dianas de medicamentos.
Resultados
RNAi paralelo pantallas para identificar quinasas esenciales para la viabilidad celular
para identificar funcionalmente importantes genes expresados en las células cancerosas, se utilizó un enfoque de control ARNi. El uso de un amplia gama de líneas celulares de cáncer humano y una biblioteca de ARN corto de interferencia (siRNA) de orientación 779 quinasas, se realizó cinco pantallas de viabilidad paralelas utilizando MCF7 (ER positivo, cáncer de mama luminal), CAL51 (ER negativo, microsatélites inestable cáncer de mama), A549 (cáncer de pulmón), NCI-H226 (cáncer de pulmón) y HeLa (cáncer cervical) líneas celulares (Figura 1 y Tabla S1). Elegimos para apuntar quinasas como estas proteínas son relativamente susceptibles a la inhibición farmacológica y han demostrado ser importantes factores de muchos tipos de cáncer diferentes. En breve, las células se sembraron en placas de 96 pocillos y se transfectaron con ARNsi de la biblioteca. Aquí hemos utilizado una biblioteca SmartPool, donde cada pocillo de la placa de 96 pocillos contenía un conjunto de cuatro diferentes siRNAs (un SmartPool) dirigidas a un gen. Después de siete días de cultivo continuo, la viabilidad celular en cada pocillo se calculó mediante el uso de un ensayo luminiscente medición de los niveles celulares de ATP. Con el fin de comparar la pérdida de los efectos de viabilidad en diferentes líneas celulares, que normalizó los datos de viabilidad celular de cada línea celular a la mediana de todos los efectos de la misma línea celular, lo que representa cada efecto SmartPool como una puntuación Z [8] en la que Z = 0 representa ningún efecto sobre la viabilidad y las puntuaciones Z de menos de -3 representa una pérdida significativa de efectos de viabilidad. Los resultados de las cinco pantallas de viabilidad celular aproximan las distribuciones normales, permitiendo la comparación de los efectos de siRNA individuales a través de las líneas celulares (Figura 1B).
a. Gráficos de dispersión de las puntuaciones Z de pantallas de viabilidad celular llevadas a cabo en paralelo en MCF7, CAL51, HeLa, A549 y líneas celulares de cáncer del NCI-H226. Negro diamantes - SmartPools siRNA individuales de orientación 779 genes quinasa por línea celular. Z scores≤-3 representan una pérdida significativa de efectos de viabilidad. segundo. gráficas de distribución de las puntuaciones Z de las pantallas paralelas siRNA. Z scores≤-3 representan una pérdida significativa de efectos de viabilidad. do. Las quinasas se pueden clasificar sobre la base del efecto de silenciamiento sobre la viabilidad celular a través de las cinco líneas celulares de cáncer. siRNAs que no tenían ningún efecto significativo sobre la viabilidad celular en ninguna de las líneas celulares estudiadas probable que el objetivo quinasas no esenciales (o el ARNsi no era funcional). siRNAs que causan una pérdida significativa de la viabilidad celular en todas las líneas celulares estudiadas probables quinasas objetivo que son esenciales para la viabilidad en la mayoría de los tipos de tumores o los que son esenciales para la viabilidad de las células normales y tumorales. siRNAs que sólo causan letalidad significativa en algunas, pero no todas las líneas celulares que puedan quinasas diana que pueden no ser crítico para la viabilidad de todas las células, sino representar los efectos específicos de tumores. re. RNAi pantallas paralelas identifican un oncogén conocido,
PIK3CA
. efectos de viabilidad celular de
PIK3CA
focalización se muestran en cinco líneas celulares. MCF7 células fueron selectivamente sensibles a la orientación de los
PIK3CA
como se demuestra por una puntuación Z de ≤-3. siRNAs que causan letalidad significativa en algunas pero no todas las líneas celulares son propensos a atacar quinasas que no son críticos para la viabilidad de todas las células, sino que representan los efectos específicos de tumores. En algunos casos esto puede ser explicado por la presencia de un oncogén activado como es el caso con las células MCF7, que albergan un activador
PIK3CA
mutación.
Razonamos que siRNAs causando significativa pérdida de la viabilidad celular (Z≤-3) en todas las líneas celulares ensayadas quinasas probable representados que son esenciales para la viabilidad en la mayoría de tipos de tumores o más probablemente esencial para la viabilidad de las células tanto normales como tumorales. Del mismo modo, siRNAs que no tenían ningún efecto significativo sobre la viabilidad en cualquiera de las líneas celulares o bien no funcional o dirigido quinasas no esenciales. Por último, la hipótesis de que siRNAs que sólo causaron letalidad significativa en algunas pero no todas las líneas de células, las quinasas identificadas que representan efectos específicos de tumores potencialmente la identificación de nuevas dianas terapéuticas (Figura 1c). Para determinar la naturaleza del efecto, los siRNA se clasificaron mediante la comparación de índices de crecimiento entre las líneas celulares (Tabla 1).
Identificación de
PIK3CA
proporciona la prueba de principio para el enfoque
Nuestro análisis inicial indica que
PIK3CA
silenciamiento era probable que represente un efecto específico de la línea celular. El silenciamiento de
PIK3CA
fue selectivamente letal para las células MCF7 (puntuación Z de -3,80), pero no HeLa, CAL51, A549 ni H226 (Figura 1d y en la Tabla 1). Se sabe que las células MCF7 a albergar un activador
PIK3CA mutación
(E545K) en la que estas células dependen para su supervivencia [9], [10]. Además, las amplificaciones y las mutaciones de ganancia de función de
PIK3CA
se han asociado con el cáncer de ovario [11], cáncer de cuello uterino [12] y el cáncer de mama [10]. La dependencia de las células MCF7 en un
PIK3CA
la activación de la mutación, puede ser un efecto adicción oncogén que puede ser explotado terapéuticamente [13]. En los casos de adicción gen, las células tumorales se vuelven dependientes fisiológicamente de la función continua de oncogenes activados o sobreexpresados que son, por tanto, los objetivos terapéuticos candidatos obvios. Por ejemplo, la eficacia de imatinib (Gleevec) en el tratamiento de leucemias que llevan la fusión BCR-ABL [14] proporciona un ejemplo clínico de la adicción oncogén y cómo puede explotarse terapéuticamente. La identificación de los
PIK3CA
valida nuestro enfoque para identificar quinasas que son esenciales para la supervivencia de las células tumorales.
Correlación de la viabilidad celular con la expresión de genes
A pesar de que los efectos de genes específicos de la célula identificada en la pantalla de RNAi puede ser debido a mutaciones activadoras, como en
PIK3CA
, es probable que otros pudieran surgir debido a la adquisición de un mayor nivel de expresión del gen. Para investigar esto, se realizó en todo el genoma de perfiles de expresión génica en el panel de línea celular humana usando 6-v2 Illumina BeadChips [15] y comparó esto con los datos de la pantalla de RNAi (Tabla S2). De perfiles de expresión se realizó por triplicado y quinasas con diferencias significativas en la expresión génica entre las líneas celulares identificadas por análisis de la varianza. Para los genes en los que al menos un ARNsi disminuyó significativamente la viabilidad celular (Tabla 1), se analizó la correlación entre la viabilidad celular después de siRNA transfección y la expresión génica. Este análisis identificó cuatro genes en la viabilidad celular inversamente correlacionada con la expresión de genes;
ADCK2
,
NAGK
,
TLR6
y
WEE1 gratis (Figura 2 y Tabla 1). Cada una de estas correlaciones sugirió que la expresión elevada del gen en cuestión puede ser esencial para la supervivencia del tumor y por lo tanto puede representar una nueva diana terapéutica.
a-d. Z resultados de las pantallas de siRNA, Z-3 scores≤ se destacan con un recuadro de puntos rojos. e-h. los niveles de expresión normalizados calculados a partir de Illumina perfiles de expresión. Alta expresión correlacionada con la sensibilidad a la siRNA, resaltada con un recuadro de puntos rojos. Las barras de error representan el error estándar de la media (SEM). La significación de las diferencias en la expresión de genes entre las líneas celulares se evaluó mediante ANOVA de una vía y el valor p se muestra para cada líneas celulares. Illinois. comparación de valores Z con los niveles de expresión normalizados. La línea discontinua representa el Z = -3 umbral para la pérdida significativa de los efectos de viabilidad (p & lt; 0,0015). Para los cuatro genes muestran, un nivel elevado de expresión es coherente con la pérdida de viabilidad después de siRNA transfección. Ver Tabla 1 para la correlación de Pearson de Z vs expresión.
El Toll-like receptor 6, (TLR6) se sabe que activa el factor nuclear kappa-B de señalización, un objetivo terapéutico candidato en el cáncer [16] , y la activación de la vía de TLR recientemente se ha sugerido que tiene un papel en la génesis tumoral [17]. La función de
ADCK2 gratis (AARF dominio que contiene quinasa 2) no está bien establecida. NAGK (N-acetilglucosamina quinasa) convierte endógeno N-acetilglucosamina (GlcNAc), un componente principal de hidratos de carbono complejos, de la degradación lisosomal o fuentes nutricionales en GlcNAc 6-fosfato, como parte de una ruta de recuperación catalítica. La función de Wee1 se discute a continuación.
Correlación de la expresión génica con el análisis genómico
Hemos examinado si la expresión relativamente elevada de los cuatro genes identificados en nuestra pantalla de RNAi podría explicarse por cambios en el gen el número de copias (es decir, el número de copias ganancias y /o amplificación de genes). el número de copias de genes se examinó mediante hibridación genómica comparativa basada en el análisis de microarrays (aCGH) y superpuesto en los datos de expresión génica y RNAi (Figura 3, Figura S1 y S3 cuadro). Este análisis combinado reveló que para algunas líneas celulares, la expresión elevada de
ADCK2
,
NAGK
o
WEE1
se asoció con un aumento en el número de copias de genes, la identificación de una causa potencialmente de elevada expresión. MCF7 células fueron altamente sensibles a
ADCK2
siRNA y esto se reflejó en la regulación positiva de la transcripción y el aumento en el número de copias de genes a
ADCK2
. Del mismo modo, un aumento en el número de copias de genes era consistente con la expresión elevada y la sensibilidad siRNA para
NAGK
en células A549. Finalmente, la sensibilidad de las células HeLa a
WEE1
siRNA fue consistente con la regulación positiva de este gen y la ganancia genómico (Figura 3 y la Figura S1).
Gráficos de dispersión que ilustran la relación entre el número de copias de genes y la expresion genica. Vertical líneas discontinuas representan el umbral para los aumentos del número de copias (relaciones de AWS & gt; 0,12).
Además de la caracterización de Wee1
WEE1 tiene un papel bien definido en el control de punto de control, con Wee1 actividad limitar los efectos pro-mitótico de Cdc2 (también conocido como CDK1) [18]. De acuerdo con ello, la pérdida de la actividad de quinasa WEE1 y su destrucción es un requisito para la entrada en mitosis [19], lo que sugiere que la actividad WEE1 en realidad puede limitar el crecimiento de células tumorales. Dado que nuestros datos sugieren que RNAi WEE1 es, en algunos contextos, fundamental para la viabilidad de las células cancerosas que sobreexpresan ella, se investigó el papel de esta quinasa más. En primer lugar confirmó que la proteína WEE1 se sobreexpresa en células HeLa y CAL51 apoyo nuestro análisis de ARN (Figura 4a). Para confirmar la correlación de la sensibilidad a la siRNA y expresión WEE1, WEE1 fue silenciada por una piscina independiente de siRNAs diseñado para reducir fuera de objetivo efectos (Wee1 ONTARGETplus). líneas de células CAL51 y HeLa fueron significativamente más sensibles al silenciamiento de Wee1 que las líneas de células que no sobreexpresan WEE1 (Figura 4b y la figura S2). Las moléculas pequeñas se han desarrollado para inhibir WEE1 sobre la base de que la inhibición de esta quinasa puede conducir a la supresión de la G
2 /M puesto de control. Muchas células cancerosas exhiben un defectuoso G
1 puesto de control que resulta en una dependencia de la G
2 /punto de control de M durante la replicación celular y, como tal, la inhibición de la G
2 /M puesto de control puede ser letal en este contexto [20]. Se utilizó un inhibidor de pequeña molécula WEE1 (PHCD [21]) para confirmar la sensibilidad selectiva de CAL51 y HeLa líneas celulares a la inhibición WEE1 (Figura 4c). También se examinaron las líneas celulares adicionales para la expresión WEE1 y la sensibilidad a la orientación WEE1, con líneas celulares de carcinoma de próstata PC3 y DU145, y la línea de células epiteliales de mama MCF10A no carcinogénico. Ninguna de estas líneas de células expresa altos niveles de Wee1 (Figura 4a), y, como se esperaba, ninguno era sensible a la orientación WEE1 (Figura 4b y 4c).
a. Western blot de lisados preparados a partir de células HeLa, CAL51, MCF7, A549, NCI-H226, PC3, DU145 y células MCF10A. Un anticuerpo que reconoce WEE1 se utilizó con β-tubulina como control de carga. expresión WEE1 es significativamente mayor en células HeLa y CAL51 en comparación con MCF7, A549, NCI-H226, PC3, células DU145 y MCF10A. segundo. Panel izquierdo: ensayo de viabilidad celular en las células transfectadas con WEE1 ONTARGETplus SmartPool, o ONTARGETplus siCONTROL. WEE1 silenciamiento fue selectivamente letal para WEE1 que sobreexpresan las células HeLa y CAL51. Las barras de error representan la DS de transfecciones por triplicado. Panel derecho: Western blot de lisados preparados a partir de células transfectadas con CAL51 WEE1 ONTARGETplus SmartPool o ONTARGETplus siCONTROL. Un anticuerpo que reconoce WEE1 se utilizó con β-tubulina como control de carga. WEE1 ONTARGETplus SmartPool redujo significativamente la expresión de proteínas WEE1 comparación con las células transfectadas siCONTROL. do. ensayo de viabilidad celular en las células tratadas con inhibidor de WEE1. inhibición WEE1 era selectivamente letal para WEE1 que sobreexpresan las células HeLa y CAL51. Las barras de error representan la DS de tratamientos con células por triplicado. re. panel de la izquierda: el análisis de transferencia Western de los lisados preparados a partir de células tratadas con inhibidor de WEE1 5 M durante 0, 6, 24 y 48 horas. Un anticuerpo que reconoce PARP se utilizó con β-tubulina como control de carga. Después de 24 horas WEE1 inhibición inducida PARP división (DCVI PARP) en WEE1 que sobreexpresan las células HeLa y CAL51 pero no inducir la escisión de PARP en las células MCF7 y NCI-H226 que expresan WEE1 en niveles normales. panel de la derecha: 3,7 caspasa actividad en las células tratadas con el inhibidor WEE1 5 M durante 24 horas. inhibición WEE1 indujo la activación de caspasa 3,7 en WEE1 que sobreexpresan las células HeLa y CAL51 pero no indujo la activación de caspasa 3,7 en las células MCF7 y NCI-H226 que expresan WEE1 en niveles normales. Las barras de error representan la DS de tratamientos con células por triplicado. mi. panel de la izquierda: Western blot de lisados preparados a partir de células transfectadas con WEE1 ONTARGETplus SmartPool o ONTARGETplus siCONTROL. Un anticuerpo que reconoce PARP se utilizó con β-tubulina como control de carga. El silenciamiento de Wee1 escisión de PARP inducida en WEE1 que sobreexpresan las células HeLa y CAL51 pero no inducir la escisión de PARP en las células MCF7 y NCI-H226 que expresan WEE1 en niveles normales. panel de la derecha: 3,7 caspasa actividad en las células transfectadas con WEE1 ONTARGETplus SmartPool o ONTARGETplus siCONTROL. El silenciamiento de Wee1 indujo la activación de caspasa 3,7 en WEE1 que sobreexpresan las células HeLa y CAL51 pero no indujo la activación de caspasa 3,7 en las células MCF7 y NCI-H226 que expresan WEE1 en niveles normales. Las barras de error representan la DS de transfecciones por triplicado.
En conjunto, nuestros resultados proporcionan evidencia para sugerir que las líneas celulares que presentan mayores niveles de expresión WEE1 son sensibles a la inhibición WEE1. Para investigar el mecanismo de la sensibilidad en estas líneas celulares, se examinaron los niveles de apoptosis siguientes inhibición WEE1. La inhibición química de Wee1 causó apoptosis sólo en líneas celulares con niveles más altos de expresión WEE1 (Figura 4d), una observación también se confirmó mediante el uso de Wee1 siRNA (Figura 4e).
Significado clínico de Wee1
Nuestros datos sugieren que la sobreexpresión WEE1 puede ser esencial para la viabilidad de células tumorales. Por lo tanto, se interrogaba la expresión de Wee1 en bases de datos disponibles públicamente que detallan los perfiles de expresión de líneas humanas de tumor de mama y tumores de células [22], [23]. Este análisis demostró que la expresión se correlaciona con WEE1
WEE1
número de copias de genes (Spearman p = 0,039) y muestra una tendencia (prueba t p = 0,06, Mann-Whitney de prueba p = 0,07) para una mayor expresión en líneas celulares con un fenotipo luminal (datos no mostrados). Sobre la base de estos datos, se examinó la expresión WEE1 por inmunohistoquímica (IHC). Expresión de Wee1 evaluó por IHC, pellets en la línea de células incluidas en parafina fijadas con formalina se correlacionaron con la expresión medido por el Western Blot, proporcionando evidencia de la especificidad del anticuerpo WEE1 (Figura 5a). A continuación, examinó una serie bien anotado de tumores de mama [24], [25] y se encontró que 35% los niveles exhibidos de expresión WEE1 similares a los de las células CAL51, que son sensibles a la inhibición WEE1 (Figura 5b). Además, los altos niveles de expresión WEE1 se encontraron preferentemente en cánceres de mama con un fenotipo luminal, como se define por Nielsen et al. [26], en consonancia con el análisis de líneas celulares de cáncer de mama. En el contexto de los datos anteriores que implican a WEE1 como un objetivo de cáncer, estos datos inmunohistoquímicos sugieren que el uso de inhibidores de Wee1 puede ser apropiado en un subconjunto importante de pacientes con cáncer de mama.
a. WEE1 tinción inmunohistoquímica en líneas celulares, fijado en formol e incluidos en parafina de cáncer de mama y cáncer de mama invasivo. Tenga en cuenta los bajos niveles de expresión WEE1 en H226 y células de un cáncer de mama de tipo basal y los altos niveles de expresión en células CAL51 WEE1 y luminal y los cánceres de mama HER2. (Tinción con hematoxilina de Harris /DAB; aumento original × 200). segundo. Los altos niveles de expresión WEE1 se expresan preferentemente en los cánceres de mama luminal. Los casos se obtuvieron de acuerdo con el sistema de puntuación Allred [36] como se describe en los materiales y métodos. Para cada tumor escriba el porcentaje de tumores con expresión de alto WEE1 se muestra. La expresión de alto WEE1 mostró una correlación directa estadísticamente significativa con la expresión de los receptores de estrógeno y progesterona y la ciclina D1, y una correlación inversa significativa con el tamaño del tumor, el grado histológico y la expresión del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), citoqueratina (Ck) 14, Ck 5 /6, Ck 17, MIB-1 índice de marcaje y caveolinas 1 y 2. No hay correlaciones entre WEE1 expresión inmunohistoquímica y la presencia de invasión linfovascular, metástasis en los ganglios linfáticos, la expresión de HER2 o amplificación de genes, la expresión de p53, y
CCND1
y
se encontró MYC
amplificación de genes [24], [37] (datos no mostrados). Todos los casos fueron clasificados en luminales, grupos HER2 y basal-como de acuerdo con el panel de inmunohistoquímica descrito por Nielsen et al. [26].
Discusión
La mayoría de las aprobaciones de nuevos fármacos para el tratamiento del cáncer se basa en los objetivos existentes. En lugar de reflejar una falta de objetivos, esto es quizás indicativo del coste y el tiempo necesarios para la identificación de nuevos enfoques terapéuticos. control ARNi paralelo puede permitir que un simple, de alto rendimiento, enfoque para la identificación funcional de los objetivos, y otros también han utilizado control ARNi paralelo para identificar posibles causas de la génesis tumoral y candidatos objetivos [27]. Nuestra identificación de
PIK3CA
, un oncogén conocido y diana terapéutica, utilizando RNAi pantallas paralelas proporciona una fuerte evidencia circunstancial de este enfoque. Además, las mejoras en la tecnología de ARNi pueden hacer RNAi paralelo cribado de un proceso mucho más simple y rentable [28], [29]. RNAi pantallas paralelas, cuando se combina con el compañero enfoques, tales como perfiles de expresión, el perfil genómico y análisis histopatológico e inmunohistoquímico de alto rendimiento tienen el potencial de identificar objetivos potenciales que son dignos de mayor investigación. En el caso de Wee1, una combinación de la detección de ARNi, la transcripción de perfiles, el perfil genómico y el análisis histológico ha llevado a la identificación de un subconjunto de pacientes (cáncer de mama luminal), donde la inhibición de esta quinasa podría explorarse como una estrategia terapéutica potencial. La incorporación de este enfoque en el proceso de identificación de objetivos farmacológicos convencionales tiene el potencial para agilizar el desarrollo de nuevas terapias.
Materiales y Métodos
Las líneas celulares, compuestos, plásmidos y siRNA
MCF7, CAL51, HeLa, A549, NCI-H226, PC3, las células DU145 y MCF10A se obtuvieron de ATCC (EE.UU.) y se mantuvo de acuerdo con las instrucciones del proveedor. inhibidor WEE1 (681 637) se obtuvo de Calbiochem (UK). MCF7 y HeLa fueron transfectadas con siRNAs SmartPool usando el reactivo de transfección Dharmafect 3; las células A549 y NCI-H226 fueron transfectadas con siRNAs SmartPool usando Dharmafect 1 reactivo de transfección de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Dharmacon). células CAL51 fueron transfectadas con siRNAs SmartPool usando reactivo de transfección Oligofectamine según las instrucciones del fabricante (Invitrogen). células DU145 fueron transfectadas con siRNAs SmartPool utilizando reactivo de transfección Lipofectamine 2000 según las instrucciones del fabricante (Invitrogen). La biblioteca quinasa siRNA (siARRAY - orientación 779 conocidos y supuestos genes de proteína quinasa humana) se obtuvo en diez placas de 96 pocillos de Dharmacon (EE.UU.). Cada pocillo en esta biblioteca contenía una SmartPool de cuatro especies distintas de siRNA dirigidos a diferentes secuencias de la transcripción diana. Cada placa se complementa con siCONTROL (diez pozos, Dharmacon (EE.UU.)). El WEE1 ONTARGETplus SmartPool y ONTARGETplus siCONTROL se obtuvieron de Dharmacon (EE.UU.)
Se utilizaron anticuerpos
Los anticuerpos dirigidos a los epítopos siguientes:. WEE1 (4936, Cell Signaling, Reino Unido), PARP (9542, Señalización celular, Reino Unido) y β-tubulina (T4026, Sigma, Reino Unido). Todos los anticuerpos secundarios utilizados para el análisis de transferencia Western fueron conjugados con HRP.
método de pantalla de siRNA
Las células sembraron en placas de 96 pocillos se transfectaron 24 horas más tarde con siRNA (concentración final 100 nM), de acuerdo con el fabricante del instrucciones. Cada placa siRNA se complementó con 10 pozos de siCONTROL. Veinticuatro horas después de la transfección, se tripsinizaron las células y se dividieron en tres placas de réplicas idénticas. El medio se repone después de 48 horas y 96 horas, y la viabilidad celular se evaluó después de siete días usando CellTiter Glo Luminescent Cell Viabilidad de ensayo (Promega, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante. Los datos de cada línea celular se procesan como sigue: la lectura de luminiscencia para cada pocillo en una placa era de registro
2 transformado y expresado en relación con el valor de luminiscencia media de todos los pocillos en la misma placa (placa de centrado). a continuación, estos datos se normalizó según la mediana de los datos de pantalla enteras, utilizando la desviación media absoluta (MAD) para estimar la verdadera variación dentro de cada pantalla [30]. Esta normalización representa el efecto de cada SmartPool en cada línea celular como una puntuación Z [30] y permitió que los efectos de cada SmartPool sobre la viabilidad de ser comparados a través del panel de la línea celular. AZ score≤-3 fue tomada como el umbral de significación para la reducción de la viabilidad celular, que representa tres DAM de la mediana y la aproximación a tres desviaciones estándar.
Transcripción de perfiles
ARN fue extraído de las líneas celulares con Trizol y fenol /cloroformo extracción seguida de precipitación con isopropanol. Para la línea celular alcance, se realizaron extracciones por triplicado y perfiles. Marcado con biotina cRNA se produce por medio de un kit de amplificación lineal (IL1791; Ambion, Austin, TX, http://www.ambion.com) usando 250 ng de ARN total de calidad comprobada como entrada. hibridaciones de chips, lavado, Cy3-estreptavidina (Amersham Biosciences) tinción, y el escaneo se realizaron en un Illumina BeadStation 500 (San Diego, http://www.illumina.com) plataforma usando reactivos y siguiendo los protocolos suministrados por el fabricante. cRNA muestras se hibridación de Illumina humanos-6 v2 BeadChips, que cubre aproximadamente 47.000 transcripciones RefSeq. La distribución aleatoria de grandes poblaciones de perlas recubiertas con oligonucleótido a través de las posiciones disponibles dentro de la 6-v2 humana de chip permite, en promedio, 30 mediciones de intensidad por RefSeq, produciendo evaluaciones cuantitativas de la expresión de genes [15]. Todos los análisis de datos de expresión de base se llevó a cabo utilizando el software del fabricante BeadStudio 3.1. los perfiles de expresión Illumina se realizaron por triplicado, los datos en bruto fueron entonces variación de la estabilización transformado y spline robusto normalizó utilizando el paquete lumi en el software Bioconductor [31], [32]. Expresión valores para cada muestra fueron mediana escala y el valor medio de expresión se estableció durante los tres réplicas. Los genes con una diferencia significativa en la expresión entre las líneas celulares se identificaron por análisis de una vía de la varianza (ANOVA). Estos datos de perfiles de transcripción ahora está disponible al público (ArrayExpress adhesión: E-TABM-610)
Correlación de la puntuación Z de siRNA con la expresión de genes
La correlación entre la puntuación Z y siRNA expresión génica normalizada era. examinado por los genes que siRNA causado una pérdida significativa de viabilidad (Z & lt; -3). puntuación Z se comparó con la expresión génica normalizada mediante el coeficiente de correlación de Pearson. Un gen se tomó como se correlacionó significativamente si el coeficiente de correlación de Pearson fue significativamente diferente a la hipótesis nula, la correlación fue inversa, y la variación en la expresión génica entre las líneas de células fueron significativamente diferentes según la evaluación de ANOVA de una vía.
array CGH método de análisis
ADN genómico fue extraído de las líneas celulares utilizando el kit QIAamp DNA Blood Mini (51104, Qiagen), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. CGH análisis basado en microarrays se realizó en un suelo de baldosas camino 32K BAC gama plataforma de la casa como se describe anteriormente [33], [34]. Para las correlaciones de número de copias, el promedio de peso de adaptación suavizada (AWS) ratios de BAC que contiene el gen de interés se utiliza para las correlaciones de número de copia y copiar número asignado como se describe anteriormente [35]. En pocas palabras, se alisó los valores AWS & lt log2 ratio; -0.12 fueron clasificados como pérdidas, los & gt; 0,12 como ganancias, y los de entre inalterado. Las amplificaciones fueron definidos como valores de relación de log2 suavizadas & gt; 0,4 [35]. procesamiento y análisis de datos se llevaron a cabo en 2.0.1 R (http://www.r-project.org/) y BioConductor 1,5 (http://www.bioconductor.org/), lo que hace un amplio uso de versiones modificadas de la empaqueta aCGH, marray y AWS en particular.
ensayo de viabilidad celular para medir la sensibilidad WEE1 siRNA
Las células se sembraron en placas de 96 pocillos se transfectaron 24 horas más tarde con WEE1 ONTARGETplus SmartPool o ONTARGETplus siCONTROL (concentración final 100 nM), según las instrucciones del fabricante. Veinticuatro horas después de la transfección, se tripsinizaron las células y se dividieron en tres placas de réplicas idénticas. El medio se repone después de 48 horas y 96 horas, y la viabilidad celular se evaluó después de siete días utilizando CellTiter Glo Luminescent Cell Viabilidad de ensayo (Promega, EE.UU.) y se expresó con relación a significar luminiscencia en los pocillos transfectados con siCONTROL.
Cell ensayo de viabilidad para medir la sensibilidad de drogas
Las células se sembraron en placas de 96 pocillos y se expusieron a varias dosis de inhibidor de WEE1 (Calbiochem, Cat. No. 681637, 4- (2-fenil) -9-hidroxipirrolo [3, 4-c] carbazol-1,3 (2H, 6H) diona (PHCD)) [21]. La viabilidad celular se evaluó mediante CellTiter Glo Luminescent Cell Viabilidad de ensayo (Promega, EE.UU.) 48 horas más tarde y fracción de supervivencia para cada dosis de fármaco evaluado dividiendo el valor de la luminiscencia del fármaco tratada por el valor de la luminiscencia de vehículo.
Western a.