Extracto
La UDP-glucuronosyltransferase (UGT), la familia de enzimas juega un papel vital en la desintoxicación de sustancias cancerígenas, así como eliminación de los fármacos contra el cáncer. En los seres humanos, 19 miembros de la familia UGT han sido identificadas y se expresa en una manera específica de tejido en todo el cuerpo. Sin embargo, los UGTs no se han caracterizado previamente en los melanocitos o melanoma. En el presente estudio, UGT2B7, UGT2B10, y UGT2B15 fueron identificados como normalmente se expresa en melanocitos humanos. Los mismos tres miembros de la familia UGT también se expresaron en la línea celular de melanoma primario WM115. No expresión UGT se detectó en otra línea de células de melanoma primario, WM3211, o en cualquier línea celular de melanoma metastásico examinó. Estos resultados sugieren que la expresión UGT se pierde durante la progresión del melanoma. El tratamiento de WM3211 o líneas celulares de melanoma metastásico con agentes anti-cáncer (incluyendo vemurafenib) expresión inducida de UGT2B7, UGT2B10 y UGT2B15 que demuestra que las células de melanoma retienen la capacidad de volver a expresar estos mismos tres UGTs. También se observó el correspondiente aumento en la actividad de glucuronidación en células de melanoma después de un tratamiento anti-cáncer. Además, desmontables de UGT2B7 en WM115 células sensibilizadas estas células a tratamiento por adriamicina y epirubicina que indica que UGT2B7 está implicado en la resistencia a estos fármacos. Sin embargo, desmontables de UGT2B7 no tuvo ningún efecto sobre la toxicidad de temozolomida. En conjunto, estos resultados demuestran claramente un papel para UGTs en etiología melanoma. Dado que las enzimas UGT son el metabolismo de fármacos, proponemos que la re-expresión de los UGT constituye un mecanismo previamente insospechada para la resistencia a los medicamentos intratumoral en el melanoma
Visto:. Dellinger RW, Matundan HH, Ahmed AS, Duong PH, Meyskens FL Jr (2012) Anti-Cancer Drugs Elicit reexpresión de UDP-glucuronosyltransferases en células de melanoma. PLoS ONE 7 (10): e47696. doi: 10.1371 /journal.pone.0047696
Editor: Keiran Smalley, El Moffitt Cancer Center & amp; Research Institute, Estados Unidos de América
Recibido: 16 Julio, 2012; Aceptado: September 17, 2012; Publicado: 22 Octubre 2012
Copyright: © Dellinger y cols. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue financiado por el generoso apoyo de las fundaciones Oxnard y Waltmar, así como las subvenciones de los Institutos nacionales de la Salud Instituto Nacional del cáncer [P30CA62330] para FLM y una beca de formación biología del cáncer [T32CA009054] apoyo asignación prevista RWD para este trabajo. Los proveedores de fondos no tiene función alguna en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
la familia de enzimas UGT cataliza la glucuronidación de una amplia gama de compuestos xenobióticos y endógenos. UGTs conjugar un resto de ácido glucurónico a sus sustratos, la alteración de las propiedades biológicas del sustrato y la mejora de su excreción en la orina o la bilis [1], [2]. En general, la glucuronidación convierte en sustratos menos bioactivo, más productos solubles en agua que facilitan su eliminación del cuerpo. De esta manera, los UGTs son integralmente involucrada en la detoxificación de muchos carcinógenos, el pase de las drogas y el metabolismo de una variedad de sustratos endógenos tales como la bilirrubina, hormonas esteroideas y lípidos bioactivos [1], [2]. Hay 19 UGT humanos funcionales clasificadas en tres subfamilias basadas en estructural y homología de secuencia de aminoácidos, UGT1A, UGT2A y UGT2B [2].
Los UGT están unidas a la membrana enzimas localizadas en gran medida al retículo endoplásmico [1], [3]. Especificidad de sustrato varía mucho entre los miembros de la familia, con amplia superposición, y su especificidad de sustrato puede ser alterado por modificaciones postraduccionales tales como fosforilación [4]. Aunque UGTs se expresan principalmente en el hígado, que también juegan un papel vital en otros tejidos en el cuerpo. Por ejemplo, UGT2B15 y UGT2B17 se expresan en la próstata donde regulan los niveles de andrógenos locales a través de la glucuronidación [5] y UGT1A10 y UGT2B7 se expresan en la mama donde regulan estrógenos [6]. También hay una amplia evidencia de que los UGT juegan un papel importante en el tracto aerodigestivo, tracto gastrointestinal, pulmón, colon, vejiga, riñones y cerebro [7], [8], [9], [10], [11]. Sin embargo, el papel de las UGT en la piel, el órgano más grande del cuerpo, aún no se ha investigado.
El melanoma es uno de los tipos de tumores de más rápido crecimiento en los Estados Unidos y el número de casos en todo el mundo se ha duplicado en los últimos 30 años [12]. Melanoma, que surge de melanocitos, es un tumor extremadamente agresivo que invade los sistemas vasculares y linfáticos para formar tumores en el cuerpo [12] en otro lugar, [13], [14]. El melanoma es un cáncer especialmente resistente, lo que representa sólo el 4% de todos los cánceres de piel, pero el responsable del 80% de las muertes por cáncer de piel [15]. Además, sólo el 14% de los pacientes con melanoma metastásico sobreviven durante 5 años [15].
sistémicos enfoques de terapia han logrado un éxito mínimo contra el melanoma metastásico que resulta en sólo unos pocos tratamientos aprobados por la FDA [16]. El interferón-2b, la interleucina-2 y temozolomida todos han demostrado una eficacia limitada con tasas de respuesta en general, menos del 15% en el corto plazo con un efecto claro sobre la mortalidad por melanoma [16]. Sin embargo, el reciente éxito de la vemurafenib inhibidor específico mutante BRAF en un ensayo clínico de fase 1 es muy prometedor [17]. Se estima que la progresión de la supervivencia libre de 7 meses se informó de entre todos los pacientes que albergan la mutación BRAF V600E [17], que está presente en aproximadamente el 50% de todos los melanomas [18]. Sin embargo, la emoción de vemurafenib como agente único se ha templado un poco desde ya se está observando la resistencia adquirida [17]. Por lo tanto, la comprensión del mecanismo (s) de la resistencia a la quimioterapia que emplean células de melanoma es de suma importancia para la lucha contra esta enfermedad mortal.
El objetivo del presente estudio fue caracterizar la expresión y función de UGT en los melanocitos y melanoma y para examinar el papel potencial de la UGT en la resistencia a los medicamentos. La evidencia presentada aquí revela tres miembros de la familia UGT, UGT2B7, UGT2B10 y UGT2B15, tal como se expresa normalmente en los melanocitos humanos aislados de prepucios neonatales. Se encontró que los mismos tres UGT que se expresa en la línea celular de melanoma primario WM115. Curiosamente, no se observó expresión UGT en otra línea celular de melanoma primario, WM3211, o en cualquiera de las tres líneas celulares de melanoma metastásico examinados, lo que sugiere que la expresión de UGT se pierde durante la progresión del melanoma. Sin embargo, el tratamiento de células de melanoma con agentes anti-cáncer resultados en re-expresión de estos mismos tres UGTs. Esta novela re-expresión de UGT en el melanoma se investigó adicionalmente en este documento.
Materiales y Métodos
Reactivos y la célula Cultura y
La temozolomida, adriamicina, epirubicina y alameticina se obtuvieron de Sigma . Vemurafenib se adquirió de Selleck (Houston, TX). melanocitos humanos normales fueron aislados de prepucio del recién nacido identificado des-de la cirugía de circuncisión de acuerdo con un protocolo aprobado por la Junta de Revisión Interna de la Universidad de California en Irvine. De acuerdo con este protocolo aprobado no hay reclutamiento de sujetos, se recoge tejido circuncidados solamente desechado. No información de identificación se recoge en relación con este tejido que de otro modo serían descartados. Los melanocitos se aislaron como se describe anteriormente [19], [20] y se cultivaron en medios MCDB153 suplementado con suero bovino fetal al 2%, 10 ng /ml de 12-O-tetradecanoylphobol-13-acetato y 0,15% de extracto de pituitaria bovina. Los WM115 líneas celulares de melanoma, WM3211, Lu1205, SKmel28 y A375 se cultivaron como se ha descrito anteriormente [21], [22], [23]. Sólo WM3211 tiene WT B-Raf, todos los demás albergar mutaciones V600E. Todas las líneas celulares dieron negativo para micoplasma.
Total Aislamiento de ARN, transcripción inversa y PCR
ARN total fue aislado de las células utilizando el ARN total Mini Kit Arum (BioRad) de acuerdo con las empresas proporcionados protocolo. RNA se cuantificó utilizando un NanoDrop 1000 (Thermo /Fisher) cDNA fue luego hecha de 1,0 g de ARN usando el iScript de la transcriptasa inversa Kit (BioRad) de acuerdo con protocolos estándar. PCR se realizó usando una Taq carga rápida (2X) mezcla maestra (New England Biolabs) y se ejecutan en un termociclador 2700 Sistema GeneAmp Applied Biosystems utilizando el protocolo siguiente: Paso 1 = 94 ° C durante 5 min; Paso 2 (40 ciclos) = 94 ° C durante 30 s, 55 ° C durante 30 s, 68 ° C durante 1 min; Paso 3 = 68 ° C durante 10 min. Tabla S1 en los datos adicionales se enumeran los cebadores utilizados para amplificar miembros de la familia UGT individuales.
Real-Time PCR
Para analizar los niveles de expresión de ARNm de UGT en células de melanoma en tiempo real PCR se realizó como se describió anteriormente [3], [24]. Brevemente, pre-diseñados TaqMan Gene Expression Ensayos [Applied Biosystems (Hs02383831_s1 de ID para UGT2B4; Hs00426592_m1 para UGT2B7; Hs02556282_s1 para UGT2B10; Hs03008769_g1 para UGT2B15 y Hs99999905_m1 para GAPDH)] se utilizaron de acuerdo con el protocolo del fabricante. PCR en tiempo real se realizó con un volumen total de 20 l que contenía 50 ng de ADNc usando GAPDH como el gen de normalización 'limpieza'. PCR en tiempo real se realizó en una máquina CFX96 PCR en tiempo real (BioRad). los valores de expresión de ARNm reportados son el promedio de al menos 3 experimentos independientes con una desviación estándar.
shRNA
Listo clonado-shRNA dirigido contra UGT2B7 y controlar los vectores de expresión vacías fueron comprados Origene. Cada vector de ARNhc se transfectó en células WM115 utilizando el agente de transfección BioT (Bioland Científica) de acuerdo con los protocolos del fabricante y la expresión estable fue seleccionado para mediante la adición de puromicina (Invivogen).
Ensayo MTT
Para determinar los efectos de los fármacos sobre la proliferación celular se realizó 3- (bromuro de 4,5-dimetiltiazol-2-il-2,5-difeniltetrazolio (MTT) ensayos (Sigma Aldrich). brevemente, las células se colocaron en placas durante la noche a 2000-4000 células /bien (dependiendo de la célula tiempos de duplicación) en placas de 96 pocillos, y se trataron con cualquiera de adriamicina, epirubicina, o temozolomida en diluciones en serie de la droga. Después de la tercera días post-tratamiento, MTT diluido en medio libre de colorante se añade a cada pocillo y se incubaron durante 3 horas. una vez que el MTT es metabolizado por las células en proliferación activa en agua formazen insoluble luego, se añade sulfóxido de dimetilo (Sigma Aldrich) y cambios colorimétricos se analizan y se cuantificó con un espectrofotómetro a 590 nm. los resultados de MTT se analizaron utilizando GraphPad Prism donde se representa gráficamente la dosis del medicamento frente a su efecto sobre la proliferación; una curva de regresión no lineal utilizando la ecuación dosis-respuesta sigmoidal se monta sobre el gráfico y la concentración inhibitoria media-máxima se obtiene (IC
50). Reportados IC
50 valores son la media de al menos 3 experimentos independientes con la desviación estándar.
UGT Ensayo de actividad
actividad UGT se examinó utilizando el ensayo de UGT-Glo (Promega) de acuerdo con protocolos de fabricante. homogeneizados de células se prepararon resuspendiendo células sedimentadas en solución salina tamponada con Tris (base Tris 25 mM, NaCl mM 138 y KCl 2,7 mM; pH 7,4) y sometiéndolos a tres rondas de congelación-descongelación antes de la homogeneización utilizando un homogeneizador Dounce de vidrio . homogeneizados celulares (5-20 mg de proteína /ml) fueron almacenadas a -70 ° C en alícuotas de 100 l. Total de las concentraciones de proteína de homogeneizado de células se determinaron usando el ensayo BCA de Pierce Biotechnology (Rockford, IL) después de la extracción de proteínas utilizando protocolos estándar. microsomas de hígado humano (Xenotech, Lenexa, KS) se utilizaron como control positivo. Los homogenados se incubaron con alameticina durante 10 minutos en hielo. Cada reacción consistía en 50 g de homogeneizado, tampón UGT-Glo, 50 mM UGT Multienzimáticos sustrato y agua para un total de 30 l. A continuación, se añadió ya sea de 10 l de agua o 10 l UDPGA 16 mM (concentración final de 4 mM). Cada una de estas reacciones se realizó por triplicado (total de 6 reacciones de cada homogeneizado). Las reacciones se incubaron a continuación a 37 ° C durante 90 min. Sólo las reacciones con el co-sustrato UDPGA añadido puede glucuronidate sustrato. Después de 90 min, 40 l de reactivo de detección Luciferin más D-cisteína se añade a todos los pocillos y se permite que la señal luminiscente para estabilizar a temperatura ambiente durante 20 min. a continuación, la placa se leyó en un luminómetro (Turner Biosystems módulo de microplacas). Como control negativo se llevó a cabo un conjunto de seis reacciones sin ningún tipo de UGT presentes. La UGT Multienzimáticos Sustrato generará luminiscencia, pero el sustrato multienzimático UGT glucuronizado no lo hará. Por lo tanto, la media de las reacciones por triplicado con el UDPGA co-sustrato se resta de la media de las reacciones por triplicado sin UDPGA para determinar la actividad UGT. Los gráficos son la combinación de múltiples experimentos independientes con la desviación estándar.
Resultados
Expresión UGT en melanocitos humanos y melanoma
Mientras que la expresión UGT ha sido reportado previamente en la piel [25 ], la expresión de UGT en los melanocitos no se había abordado específicamente. En el presente estudio, los melanocitos humanos aislados de prepucios de-identificado neonatales se analizaron para la expresión UGT por RT-PCR. Los conjuntos de cebadores diseñados para miembros de la familia UGT2B individuo se utilizaron, así como un cebador común configurado para detectar cualquier miembro de la familia UGT1A. Los UGT2As no se midieron tal como se encuentran en gran parte en el sistema olfativo [26]. Como se muestra en la Figura 1A, UGT2B7, se encontraron UGT2B10 y UGT2B15 que se expresa en melanocitos humanos. Los productos de PCR indicados por las flechas negras (Figura 1A) se presentó en el tamaño previsto, se escindieron y se confirmaron las secuencias de UGT individuales. La banda en el carril UGT2B4 (Figura 1A, carril 1) también se cortó y se determinó que UGT2B7 por secuenciación. Esto no es demasiado sorprendente, ya que los miembros de la familia UGT2B comparten una alta homología. De hecho, UGT2B4 y UGT2B7 comparten más de un 90% de identidad a nivel de ADN y las estrategias para cebadores específicos es difícil. Como control, RT-PCR se realizó con ARN de hígado de demostrar que los cebadores conjuntos UGT eran funcionales y mostrar predijeron tamaños para cada amplicón UGT (Figura 1B). La expresión de estos mismos tres miembros de la familia UGT también se observó en melanocitos humanos a partir de un segundo prepucio neonatal de-identificado (Tabla 1; Observe que los números 322 y 423 simplemente denotar fechas prepucio se obtuvo de los lactantes de raza blanca). A continuación, la expresión UGT se examinó en varias líneas celulares de melanoma primarios y metastásicos por RT-PCR. De acuerdo con el patrón de expresión observado en los melanocitos UGT, la línea celular de melanoma primario WM115 exhibió solamente UGT2B7, UGT2B10 y expresión UGT2B15 (Figura 1C). Debido a la alta homología de miembros de la familia, y similar a la figura 1A, la banda 'UGT2B4' en la Figura 1C se determinó que era UGT2B7 después de la secuenciación del ADN. Además, la banda superior en el carril UGT1A se escindió y secuenció (aunque era más pequeño que el tamaño esperado) y estaba decidido a no ser cualquier miembro de la familia UGT. No expresión UGT se observó en otra línea de células de melanoma primario, WM3211 (Figura 1D), o en cualquiera de las tres líneas celulares de melanoma metastásico examinados (resumen en la Tabla 1; representan en la Figura S1). Estos resultados sugieren que la expresión de UGT se pierde durante la progresión del melanoma.
(A) Análisis de RT-PCR del ARN total de los melanocitos humanos para miembros de la familia UGT. Los conjuntos de cebadores para los UGT2Bs se diseñaron para ser específicas para cada isoforma, mientras que un único conjunto de cebadores dirigidos contra la región común de todos los UGT1As se utilizó para detectar la expresión de UGT1A. El ARN total de hígado humano se utilizó como control con los cebadores UGT2B7. Las flechas indican las bandas de ADN del tamaño esperado cuya secuencia se confirmó. (B) Análisis de control de RT-PCR del ARN total de hígado usando cebadores indicados conjuntos. análisis (C) RT-PCR del ARN total de la línea celular de melanoma humano WM115 utilizando cebadores indicados conjuntos. Las flechas indican bandas que fueron extirpados y secuenciado. Se encontró banda en el carril UGT2B4 ser UGT2B7 por secuenciación mientras que las bandas UGT2B10 y UGT2B15 fueron confirmados de esperar UGT. análisis (D) RT-PCR del ARN total de la línea celular de melanoma humano WM3211. GAPDH se utilizó como control positivo para asegurar la calidad de ADNc. (E) PCR en tiempo real utilizando ensayos TaqMan contra UGTs indicados. ND = no detectado.
Con el fin de mejorar la sensibilidad y la especificidad de la detección de ARNm UGT, genes TaqMan ensayos de expresión se utiliza para el resto de este informe. Estos ensayos han sido optimizados para ser específicos para UGTs individuales utilizando una sonda, así como un conjunto de cebadores. Para ilustrar este punto, y volver a afirmar que UGT2B7 está presente en los melanocitos en oposición a la UGT2B4, PCR en tiempo real ensayos que utilizan Tagman ADNc se realizó en los melanocitos. La figura 1E muestra claramente que es, en efecto UGT2B7 expresa en melanocitos humanos y UGT2B4 no se detectó.
Re-expresión de UGT2B7, UGT2B10 y UGT2B15 de melanoma en respuesta a las drogas anti-cáncer
Teniendo en cuenta que los UGTs son la fase II de enzimas del metabolismo y uno de sus principales funciones sistemáticamente es eliminar las drogas, examinamos si los UGTs podrían desempeñar un papel en la resistencia inherente de las células de melanoma a los agentes quimioterapéuticos. Por lo tanto, la línea celular de melanoma WM3211 se trató con diversos agentes anti-cáncer y la expresión UGT se ensayó mediante PCR en tiempo real. WM3211 fue elegido para estos experimentos ya que no tiene expresión UGT detectable como se determina por RT-PCR (Figura 1D).
Primero células tratadas WM3211 con temozolomida, que se indica actualmente para el tratamiento del melanoma metastásico. Una dosis de 100 mM fue elegido para este experimento ya que los informes publicados para el tratamiento de temozolomida cultivo celular comúnmente usan un mínimo de 100 M [27], [28]. Como se muestra en la Figura 2a, UGT2B7, UGT2B10 y UGT2B15 fueron re-expresar en células WM3211 en respuesta a la temozolomida. Curiosamente, se indujeron ningún otro UGTs (datos no mostrados), sólo los tres miembros de la familia UGT que normalmente se expresan en los melanocitos (Tabla 1). La inducción de la expresión de UGT en respuesta a la temozolomida se comportó de una manera dependiente del tiempo con la expresión máxima en horas pico a las 8 horas después del tratamiento (Figura 2A). Para los tres UGTs su expresión disminuye después de 8 horas, pero su expresión todavía se elevó 24 horas después de tratamiento (Figura 2A).
prediseñado Taqman de genes ensayos de expresión se utilizaron para visualizar la expresión UGT individuo por PCR en tiempo real siguiente tratamiento de las células con WM3211 (A) 100 M temozolomida, (B) 1,0 M adriamicina o (C) 0,1 M epirubicina. En todos los casos, UGT2B7, UGT2B10 y expresión UGT2B15 se examinó para el agente anti-cáncer se indica en 0, 8, 16 y 24 horas después del tratamiento. * Indica escala diferente para el eje y.
Para dilucidar si la re-expresión de estos tres miembros de la familia de la UGT era específico para la temozolomida o si observa la respuesta puede ser un mecanismo general para el melanoma para defenderse contra agentes quimioterapéuticos, también se examinaron los agentes contra el cáncer adriamicina y epirubicina. Se seleccionaron estos dos compuestos, ya que se antraciclinas que se utilizan comúnmente para el tratamiento de varios tipos de tumores sólidos aunque melanoma ha demostrado ser resistente estrechamente relacionados [29], [30]. Además, se conoce epirubicina para ser metabolizados principalmente por UGT2B7 [31] mientras que el metabolismo de la adriamicina es mucho más complejo e implica varios fase diferente II enzimas (incluyendo UGTs) y transportadores ABC [30]. células de melanoma WM3211 se dejaron sin tratar o se trataron con 0,1, 1,0 o 10 adriamicina mu M (Figura S2A) o epirubicina (Figura S2B) y la expresión UGT fue examinado por PCR en tiempo real después de 8 h. En ambos casos UGT2B7, se observaron UGT2B10 y UGT2B15 que ser re-expresado. Similar a la temozolomida, se indujo ningún otro miembro de la familia UGT (datos no mostrados). cursos de tiempo examinando la expresión UGT después del tratamiento de células WM3211 con 1,0 M adriamicina (Figura 2B) o 0,1 M epirubicina (Figura 2C) se llevaron a cabo a continuación. En ambos casos UGT2B7, UGT2B10 y UGT2B15 se inducen de manera dependiente del tiempo, con la más alta expresión observada a las 24 hrs.
Re-expresión de UGT2B7, UGT2B10 y UGT2B15 en células de melanoma metastásico en respuesta a la epirubicina y vemurafenib
para garantizar que la inducción observada de UGT no se limita a las células WM3211, dos líneas celulares de melanoma metastásico (SKmel28 y A375) se examinaron para la inducción de UGT2B7, UGT2B10 y UGT2B15 en respuesta a la epirubicina. cursos de tiempo examinando la expresión UGT después del tratamiento de SKmel28 (Figura 3A) o A375 (Figura S3) con 0,1 M epirubicina se llevaron a cabo a continuación. Una vez más, se observó la inducción de los 3 UGTs en ambas líneas celulares de melanoma metastásico con la expresión máxima a las 24 horas. Por otra parte, ya que la resistencia se ha observado en los ensayos clínicos con el nuevo fármaco prometedor vemurafenib, examinamos si los UGT podrían ser inducidos después del tratamiento con vemurafenib. células SKmel28, que albergan la mutación BRAF V600E, se trataron con 1 vemurafenib mu M, recogido a las 0, 8, 16 y 24 horas después del tratamiento y se analizaron para los niveles de expresión UGT. Como se muestra en la Figura 3B, UGT2B7, UGT2B10 y UGT2B15 fueron inducidos en respuesta a vemurafenib.
prediseñado Taqman de genes ensayos de expresión se utilizaron para visualizar la expresión UGT individuo por PCR en tiempo real después del tratamiento de células con SKmel28 (A ) o epirubicina vemurafenib (B). Evolución temporal de la expresión siguiente UGT2B epirubicina (100 nM) o vemurafenib (1 M) de tratamiento, se examinó a las 0, 8, 16 y 24 hrs. * Indica escala diferente para el eje y. ND = no detectado.
El aumento de glucuronidación en células de melanoma después del tratamiento con un agente anti-cáncer
Después de demostrar que UGT se pueden volver a expresar en células de melanoma después del tratamiento con anti agentes de cáncer, la pregunta obvia era si la actividad de UGT se restauró también. Por lo tanto, la glucuronidación se examinó utilizando el ensayo de UGT-Glo en líneas celulares de melanoma que carecen de la expresión de UGT y se compararon con las mismas líneas de células después del tratamiento con epirubicina. Este ensayo emplea un sustrato de UGT Multienzimáticos que reacciona con el reactivo de detección luciferina para dar luz que se puede cuantificar en un luminómetro. Sin embargo, si el sustrato se glucuronizado entonces ya no reaccionará con el reactivo de detección luciferina para dar luz. Así, dos reacciones se establecieron por muestra, uno con el UDPGA co-sustrato y la otra sin. Sólo la reacción con el UDPGA producirá sustrato glucuronizado si UGTs están presentes y activos. De esta manera la actividad de UGT total de la muestra puede cuantificarse por la diferencia en la luz emitida entre las dos reacciones.
En primer lugar, se examinaron las células de melanoma primario WM3211 para la actividad de UGT. Las células se dejaron sin tratar (ONU) o tratados con epirrubicina a las concentraciones indicadas. Las células se recogieron 24 horas más tarde y se ensayaron para la actividad de UGT. Como se muestra en la figura 4A, la actividad de UGT se aumentó en respuesta al tratamiento epirrubicina en comparación con las células no tratadas. Curiosamente, había un poco de actividad glucuronidación basal en las células no tratadas WM3211 que indican que UGTs se expresan en esta línea celular, pero a niveles por debajo de la detección de nuestro experimento RT-PCR (Figura 1D). microsomas hepáticos humanos fueron utilizados como control positivo, ya que tienen concentraciones muy altas de UGT y no había homogeneizado presente en el control negativo a la cuenta por cualquier señal de fondo. Se observaron resultados similares cuando este experimento se repitió para dos líneas de células del melanoma metastásico, SKmel28 (Figura 4B) y A375 (Figura 4C). En ambas de estas líneas de células actividad de UGT se aumentó drásticamente tras el tratamiento con epirubicina. En contraste con las células WM3211, ni línea celular metastásico exhibió actividad UGT en ausencia de tratamiento. Una vez más microsomas de hígado humano se utilizaron como un control positivo y el control negativo carecían de homogeneizado celular
actividad glucuronidación se examinó por el ensayo de UGT-Glo usando 50 g de homogeneizado por reacción en tres líneas celulares de melanoma.; (A) WM3211 (B) SKmel28 y (C) A375 sin tratamiento y en comparación con el tratamiento con epirubicina (EPI) a las concentraciones indicadas durante 24 horas. (-) Indica un control negativo en el que no estaba presente homogeneizado. (+) Indica el uso de microsomas de hígado humano (conocido por tener altas concentraciones de casi todos los miembros de la familia UGT) como un control positivo.
UGT2B7 Derribo sensibiliza a las células del melanoma WM115 de fármacos contra el cáncer
para determinar la contribución funcional de la glucuronidación de la resistencia del melanoma, UGT2B7 fue derribado en células WM115. shRNA dirigido contra UGT2B7 se transfectó de forma estable en células WM115. Esta línea celular fue nombrado WM115-2B7KD. a continuación, PCR en tiempo real se realizó para confirmar que los niveles de ARNm de UGT2B7 se habían reducido. La Figura 5A muestra claramente que los niveles de mRNA en UGT2B7 la línea celular WM115-2B7KD fue ~ 60% menor que la de WM115 células transfectadas de manera estable con el vector vacío (WM115-PRS). A continuación, las concentraciones máximas de inhibición media (IC
50) como se determina por ensayos de MTT, se llevaron a cabo para examinar si desmontables de UGT2B7 sensibilizado WM115 células para el tratamiento anti-cáncer. IC
50 valores para WM115-2B7KD se determinaron y se compararon con (línea celular estable hecha con el vector vacío como control) WM115-PRS y la línea celular de sus padres contra la temozolomida, adriamicina y epirubicina. Consistente con un papel de la glucuronidación en la resistencia melanoma, WM115-2B7KD se encontró que tienen una significativamente menor (p & lt; 0,01) IC
50 valor de la adriamicina y el tratamiento epirrubicina en comparación con tanto WM115 y WM115-PRS (Figura 5B) indicando que, de hecho, desmontables de UGT2B7 sensibiliza a las células de melanoma a estos fármacos anti-cáncer. Ningún efecto sobre la IC
50 valores se observó para la temozolomida o el tratamiento con vemurafenib en la línea celular WM115-2B7KD en comparación con las dos líneas celulares de control (Figura 5B).
(A) PCR en tiempo real de UGT2B7 los niveles de mRNA que comparan líneas celulares de melanoma que expresan de forma estable shRNA contra UGT2B7 (WM115-2B7KD) o vector vacío (WM115-pRS). (B) IC
50 valores determinados a partir de ensayos de MTT para evaluar la contribución de UGT2B7 a la resistencia después del tratamiento del melanoma de la temozolomida, adriamicina, epirubicina o vemurafeninb. (C) IC
50 valores determinados a partir de ensayos de MTT de evaluación de la sensibilidad de líneas celulares de melanoma con (WM115) y sin (WM3211) UGT expresión a fármacos contra el cáncer que son metabolizados por UGTs. Todos los gráficos de datos son la media de al menos tres experimentos independientes analizados por GraphPad Prism. Las barras de error representan la desviación estándar y * indica significación p. & lt; 0,01 en comparación con cualquiera de los controles
Si derribando uno UGT por las células de melanoma sensibilizado ~ 60% de adriamicina y epirubicina entonces es lógico pensar que la IC
50 para células de melanoma WM3211 (que carecen de la expresión UGT) sería significativamente menor que las células parentales WM115 (que tienen expresión UGT). De este modo, se comparó la IC
50 para WM115 y WM3211 directamente por estos medicamentos. Como se predijo, las células fueron WM3211 7 veces y 9 veces más sensibles a la adriamicina y epirubicina, respectivamente (Figura 5C).
Discusión
El papel de la UGT en la etiología del melanoma no había sido investigado previamente a pesar de los UGTs de ser un mecanismo de eliminación principal para los agentes anti-cáncer. En el presente estudio UGT2B7, UGT2B10 y UGT2B15 fueron identificados como normalmente se expresa en melanocitos humanos. Se encontró que los mismos tres UGT que se expresa en la línea celular de melanoma primario WM115. Sin embargo, no se detectó expresión UGT en otra línea celular de melanoma primario, WM3211, o en cualquiera de las tres líneas celulares de melanoma metastásico examinados indica que la expresión UGT se pierde durante la progresión del melanoma. Curiosamente demostramos que UGT2B7, UGT2B10 y UGT2B15 pueden ser re-expresados en células de melanoma en respuesta a los agentes contra el cáncer. El aumento correspondiente en la actividad de UGT también se demostró después del tratamiento. Por lo tanto, re-expresión de los UGT presumiblemente proteger a las células de cáncer contra fármacos contra el cáncer mediante el aumento del metabolismo y el aclaramiento posterior. Es importante destacar que estas observaciones fueron consistentes tanto en las células de tipo salvaje de melanoma B-Raf (WM3211) y B-Raf mutante líneas celulares (A375 y SKmel28).
Desafortunadamente, el anticuerpo no está disponible comercialmente se ha demostrado para detectar UGT2B endógeno proteínas y, por consiguiente, nuestros intentos para visualizar la proteína endógena UGT2B tuvieron éxito. Esto es más probable debido al hecho de que UGTs son unidas a la membrana, proteínas insolubles. En consecuencia, no UGT humano de longitud completa ha sido purificado y /o cristalizada. De hecho, la única estructura cristalina reportado para un UGT humano es el medio C-terminal de UGT2B7 desde el medio N-terminal tuvo que ser cortado para solubilizar la proteína [32]. La gran mayoría de los westerns UGT publicados son líneas celulares de insectos (por lo general) que se sobreexpresan UGT recombinantes. Además, un reciente informe demuestra claramente que un gran porcentaje de estos, UGTs recombinantes sobreexpresados son inactivos [33]. Uno puede imaginar fácilmente que las proteínas recombinantes UGT que son visibles en el western no están totalmente maduros, enzimas activas. Por el contrario, totalmente maduros, UGT activas no pueden ser visibles en los westerns incluso cuando se sobreexpresa. Por lo tanto, de acuerdo con varias publicaciones previas en el campo de UGT, el presente estudio se centró en la expresión de ARNm de los miembros de la familia UGT2B junto con el análisis de la actividad de UGT. Hemos utilizado interferencia y glucuronidación ensayos de ARN para examinar el papel de UGT2B7 sobre la supervivencia de células de melanoma [1], [3], [24], [34], [35], [36], [37].
Para probar el papel de la glucuronidación en el melanoma resistencia a los medicamentos directamente, UGT2B7 fue derribado en células WM115, la única línea celular de melanoma se ha identificado con la expresión UGT hasta el momento. Desmontables de células de melanoma UGT2B7 sensibilizado a la epirubicina y tratamiento adriamicina, pero no tuvo efecto en la temozolomida o tratamiento vemurafenib. Estos resultados proporcionan una prueba del principio de que la glucuronidación está implicado en la resistencia a fármacos melanoma
in vitro
. La suposición más lógica es que UGT2B7 glucuronidatos epirubicina y metabolitos resultantes adriamicina directamente en su despacho antes de que estos fármacos pueden ejercer su toxicidad. Esto es consistente con informes anteriores que epirubicina se metaboliza principalmente por UGT2B7 [31] y que la glucuronidación también está implicado en el aclaramiento de adriamicina [30]. La observación de que la toxicidad de temozolomida y vemurafenib se mantuvo sin cambios después de UGT2B7 caída no era completamente inesperado ya que UGTs nunca han sido implicados en el metabolismo de estos fármacos.
Es importante tener en cuenta que estos experimentos se realizaron utilizando un UGT2B7 derribar línea celular, por lo que todavía había alguna UGT2B7 presente. Por otra parte, UGT2B10 y UGT2B15 todavía están presentes.