Extracto
El tratamiento del cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) con fármacos que se dirigen al receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), por ejemplo, gefitinib y erlotinib, fallarán en el futuro, debido al desarrollo de mutaciones secundarias como T790M en EGFR. Estrategias para superar esta resistencia son, por tanto, una necesidad urgente. En este estudio, se sintetizó una docena de nuevos análogos de gefitinib y evaluamos sus efectos sobre L858R /T790M-EGFR albergar células de NSCLC, y se informó que uno de estos miméticos gefitinib, N- (2-bromo-5- (trifluorometil) fenil) - 6-metoxi-7- (3- (piperidin-1-il) propoxi) quinazolin-4-amina (en lo sucesivo, V1801), desencadena la apoptosis de las células de NSCLC y superó gefitinib-resistencia en ratones inoculados con células NCI-H1975. Aunque V1801 única actividad EGFR quinasa moderadamente inhibido, notablemente indujo la expresión de la proteína BH3-only Noxa, y Noxa silenciar reducido significativamente la apoptosis inducida por V1801 de las células NCI-H1975. Se mostró que V1801 interfirió con la expresión del factor de transcripción c-Myc y la vía de la cinasa regulada por señales extracelulares (ERK). V1801 en combinación con bortezomib inhibidor del proteasoma ejerce una mayor citotoxicidad en células NCI-H1975, posiblemente debido a la inducción de la expresión potenciada Noxa. Estos datos indican que los análogos gefinitib con una débil actividad inhibidora de EGFR pueden superar resistencia a las drogas a través de la activación de BH-3 proteínas sólo se pro-apoptóticos, y V1801 pueden tener potencial terapéutico para el NSCLC
Visto:. Zhang B, Jiao J , Liu Y, Guo LX, Zhou B, Li GQ, et al. (2012) gefitinib analógica V1801 induce la apoptosis de las células EGFR T790M que albergan un cáncer de pulmón regulación de la BH-3 única proteína Noxa. PLoS ONE 7 (11): e48748. doi: 10.1371 /journal.pone.0048748
Editor: Giuseppe Viglietto, Universidad Magna Grecia, Italia |
Recibido: 27 Febrero, 2012; Aceptado: 1 de octubre de 2012; Publicado: 21 Noviembre 2012
Derechos de Autor © 2012 Zhang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el Programa Nacional clave de Investigación básica (2012CB910800, 2010CB833200, 2010CB529201), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales (N ° 81071930, 81171925, 20972160 y 21172220), la Fundación Especial del Presidente y el Proyecto clave del Programa de Innovación del conocimiento Academia china de Ciencias (KSCX1-YW-R-26 y KSCX2 YW-R-235) Programa, y el Mayor Nacional de la Ciencia y Tecnológico para el descubrimiento de medicamentos (2009ZX09103-101). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de pulmón es el de la neoplasia más frecuente en todo el mundo, que comprende el 17% del total de los nuevos casos de cáncer y el 23% del total de muertes por cáncer en los hombres [1]. El tratamiento del cáncer de pulmón se determina por el tipo histológico y el estadio al momento del diagnóstico, e incluye principalmente la cirugía, la terapia doblete de platino, la radioterapia y la terapia dirigida, con un 15% de tasa de supervivencia global a cinco años para todos los estadios combinados [2]. El receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) agentes -targeting incluyendo anticuerpos-EGFR específica y los inhibidores de la tirosina quinasa (TKIs) tales como gefitinib y erlotinib, se benefician de una proporción de los pacientes, especialmente aquellos que nunca humo y de origen asiático [3] - [5] . Sin embargo, el tratamiento con gefitinib y erlotinib fallarán en el futuro, debido al desarrollo de resistencia a los fármacos adquirida resultante de la amplificación de la MET proto-oncogén o que se detecta en la treonina a metionina sustitución de aminoácido en la posición 790 (T790M) de EGFR, 50% de los pacientes clínicamente resistentes a [6], [7]. La mutación T790M en EGFR afecta el residuo gatekeeper en el dominio catalítico de la quinasa que debilita la interacción de los inhibidores con el objetivo [6]. Estudios recientes muestran que T790M mutación es una mutación de resistencia "genérico" que reducirá la potencia de cualquier inhibidor de quinasa competitivos con ATP [8]. En las células EGFR T790M que alberga, la inhibición de EGFR por disponibles en la actualidad la segunda generación de EGFR-TKI no es suficiente para evitar que fisiológicamente la aparición de células que aún dependen de la señalización del EGFR [9]. Por lo tanto, las estrategias para superar la resistencia a EGFR TKI permanecen necesidades prácticas con el fin de prolongar el tiempo de supervivencia de los pacientes con cáncer de pulmón.
Evadir la apoptosis es una de las características del cáncer, la apoptosis y la orientación se ha convertido en una estrategia terapéutica del cáncer [10 ]. Los reguladores de la apoptosis críticos, CLL de células B /linfoma de 2 (BCL-2) y sus proteínas de la familia, se puede dividir en los miembros pro y anti-apoptóticos, y las proteínas pro-apoptóticas se puede subdividir en proteínas proapoptóticos y BH3-only subfamilias, sobre la base de su similitud estructural de diversos Bcl-2 de homología (BH) dominios [11], [12]. Noxa es una proteína BH3-only que está implicado en la apoptosis asociada con daño en el ADN, la hipoxia o la exposición a inhibidores del proteasoma [13] - [15]. Expresión de Noxa en células HeLa promueve fuertemente la apoptosis de células, mientras que el bloqueo de la endógeno Noxa suprime la muerte celular programada [16]. La acumulación de Noxa sensibiliza apoptosis mediante la unión a y neutralización de la proteína antiapoptótica MCL-1, conduce a la liberación y la posterior activación de Bax (proteína X BCL2-asociado) o BAK (BCL2-antagonista /asesino) de Bax /Bak-MCL-1 complejo [13], [17], [18]. Además de su papel en la apoptosis, Noxa también regula diversas funciones celulares en la muerte celular y el metabolismo de autofagia [19], [20]. la activación Noxa asociado a la apoptosis se logra principalmente a través de la regulación positiva de la transcripción de p53, E2F1 quinasa, HIF1α, c-Myc, ATF3, y regulada por señales extracelulares (ERK) vía [14] - [16], [21] - [23]. Sin embargo, la identidad de los críticos BH3-sólo las proteínas y el mecanismo de su acción después del tratamiento por diversos estímulos de apoptosis aún no se han resuelto por completo.
Para la detección de los agentes para superar la resistencia a gefitinib, que aquí sintetizamos una número de nuevos análogos estructurales gefitinib y probado sus efectos inhibidores sobre la actividad quinasa de EGFR y la proliferación de las células NCI-H1975 [24], que albergan L858R /T790M-EGFR [6], [7], [25] y de tipo salvaje MET sin genómico amplificación [26] que son resistentes a gefitinib y erlotinib. Encontramos un mimético de gefitinib, N- (2-bromo-5- (trifluorometil) fenil) -6-metoxi-7- (3- (piperidin-1-il) propoxi) quinazolin-4-amina (en lo sucesivo, V1801), moderadamente inhibido la actividad quinasa de EGFR, pero suprimió de forma significativa la proliferación celular y la apoptosis inducida en EGFR T790M que albergan células no pequeñas de cáncer de pulmón no microcítico (CPNM) in vitro e in vivo. Hemos demostrado, además, que la sobre regulación de la actividad de Noxa sustentada V1801 en células de NSCLC.
Materiales y Métodos
Agentes
Los análogos de gefitinib (Tabla 1) fueron sintetizados por nuestra química grupo, y el
N
- (3-cloro-4-fluoro-fenil) -7-metoxi-6- (3-morfolin-4-ilpropoxi) quinazolin-4-amina (gefitinib) se adquirió de J & amp; K Chemical Ltd. Todos los compuestos se disolvieron en dimetilsulfóxido (DMSO) para hacer que la concentración madre de 10 mM y se mantuvieron a -20 ° C. El 3- (4,5-dimethylthiahiazozy1) -3,5-di-phenytetrazoliumromide (MTT) se adquirió de Sigma. Bortezomib fue alcanzado desde el Millennium Pharmaceuticals Inc. La Anexina V /yoduro de propidio kit (PI) de detección de apoptosis se obtuvo de BD Biosciences (San Jose, CA, EE.UU.).
Los anticuerpos
los anticuerpos utilizados en este estudio fueron los siguientes: anti-β-actina (Sigma); anti-Casp-9 (C9), anti-Casp-8 (1C12), anti-Casp-3 (3G2), anti-PARP, anti-fosfo-p44 /42 MAPK, anti-EGFR (L858R), anti-STAT3 , anti-fosfo-STAT3 (señalización celular); anti-c-Myc, anti-Noxa, anti-fosfo-EGFR (Y1173), anti-pAKT y AKT (Santa Cruz Biotechnology); anti-ERK2 (Abcam); anti-conejo o anticuerpo secundario conjugado con HRP anti-ratón (Pierce). La detección se realizó mediante el uso de un kit de detección quimioluminiscente Western (Señalización Celular).
Cultivo celular
La líneas celulares de cáncer de pulmón NCI-H1975, A549 y HCC827 se obtuvieron de la American Tissue Culture Collection. Las células A549 se cultivaron en Dulbecco modificado medio de Eagle (DMEM) que contiene 10% de suero bovino fetal (FBS; Gibco /BRL, Grand Island, NY), 100 U /ml de penicilina, 100 mg /ml de estreptomicina. NCI-H1975 y HCC827 células se cultivaron en RPMI 1640 suplementado con 10% FBS, 100 U /ml de penicilina y 100 mg /ml de estreptomicina.
preparación de ARN y RT-PCR
El RNA total de las células se aisló usando el reactivo TRIZOL (Invitrogen) y el método de extracción con fenol-cloroformo de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ARN total (2 mg) se recoció con cebadores aleatorios a 65 ° C durante 5 min. El cDNA fue sintetizado usando un equipo de 1ª línea de cDNA de síntesis (Fermentas). Para la amplificación PCR, los cebadores son las siguientes: actina, cebador directo: 5'-CTCCTCCTGAGCGCAAGTACTC'-3 ', cebador inverso: 5'-TCCTGCTTGCTGATCCACATC'-3'; Puma, cebador directo: 5'-GTCCTCAGCCCTCGCTCT-3 '; cebador inverso: 5'-CTAATTGGGCTCCATCTCG-3 '; Bim, cebador directo: 5'-GCCCCTACCTCCCTACAGAC-3 '; cebador inverso: 5'-ATGGTGGTGGCCATACAAAT-3 '; Bcl-XL, cebador directo: 5'-GGTGGGAGGGTAGAGTGGATGGT-3 '; cebador inverso: 5'-GGAAAGCGTAGACAAGGAGATGC-3 '; MCL-1, cebador directo: 5'-CACGAGACGGTCTTCCAAGGCATGCT-3 '; cebador inverso: 5'-CTAGGTTGCTAGGGTGCAACTCTAGGA-3 '; Noxa, cebador directo: 5'-AAGAAGGCGCGCAAGAAC-3 '; cebador inverso:. 5'-CGTGCACCTCCTGAGAAAAC-3 '
ensayo de transferencia Western
Las células se suspendieron en tampón de lisis (50 mM Tris-HCl (pH 7,4), NaCl 150 mM, 1% de Triton X-100, 1% desoxicolato de sodio, 0,1% SDS, Na 1 mM
3Vo
4, NaF 1 mM, EDTA 1 mM, PMSF 1 mM, proteasa completo cóctel inhibidor) y se aclaró por centrifugación para obtener conjunto- lisados celulares. Cantidades iguales de muestras se separaron por SDS-PAGE, se transfirieron a nitrocelulosa y se sometieron a inmunotransferencia con el anticuerpo indicado [27].
Preparación de fracciones citoplasmáticas
Para la detección de citocromo c liberado de las mitocondrias, fracciones citoplásmicas se recogieron a partir de células NCI-H1975 después de la incubación con 0,1 mg /ml de digitonina durante 3 min a 37 ° C en el citosol de tampón de lisis (0,01% de digitonina, mM EDTA 1 mM, EGTA 1 mM, PMSF 1, inhibidores de cócteles de la proteasa en 1 × PBS a pH 7,4). Después de la centrifugación, las alícuotas del sobrenadante (fracción citoplásmica) y el sedimento que contiene la mitocondria se analizaron por transferencia Western.
Evaluación de la proliferación celular y la apoptosis
Las células se trataron con V1801 o gefitinib para indicado concentraciones y puntos de tiempo. La proliferación celular se determinó usando el ensayo de MTT. La viabilidad celular se estimó por exclusión con azul de tripano colorante [27]. Externalización de la fosfatidilserina se puso a prueba utilizando un Anexina V /PI Apoptosis kit de detección (BD Biosciences, San Jose, CA) según las instrucciones del fabricante. Después de la tinción con Hoechst 33258 a 10 mg /ml para 10 min, la muerte celular se evaluó mediante un microscopio de fluorescencia (Leica).
Los ensayos in vitro de la quinasa del EGFR
In vitro se determinó la capacidad inhibidora de quinasa usando el kit de ADP-Glo ™ Ensayo de quinasa EGFR y la quinasa Enzyme System (Promega), siguiendo las instrucciones del fabricante.
ensayos de siRNA
uso HiPerFect reactivo de transfección (Qiagen, Crawley, Reino Unido) de acuerdo con el protocolo del fabricante, las células se transfectaron con 100 oligonucleótidos de doble cadena siRNA nm. Las secuencias de siRNA fueron 5'-GGUGCACGUUUCAUCAAUU-3 '(Noxa siRNA1), 5'-AACUUCCGGCAGAAACUUC-3' (Noxa siRNA2), y 5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3 '(control negativo (NC) siRNA), 5'-CAGAAATGTCCTGAGCAAT- 3 '(c-Myc siRNA1), 5'-AAGGTCAGAGTCTGGATCACC-3' (c-Myc siRNA2).
Clonigénicas ensayo
Después de la incubación con V1801 (3 M) o gefitinib (3 M ) durante 12 h, se realizó un ensayo de colonias en agar blando. Con este fin, las células se suspendieron con tripsina en medio RPMI 1640 que contiene 10% de FBS y de bajo punto de fusión 0,3% de agarosa (Amresco, Solon, OH) y, posteriormente, superpuesta sobre una capa solidificada de RPMI 1640 que contiene 10% de FBS y 0,6% agarosa en placa de 35 mm (5.000 células /placa) por triplicado. Después de 2 semanas, las colonias se fijaron en etanol al 90% y se tiñeron con violeta 0,005% de cristal (Sigma). La unidades formadoras de colonias con más de 100 células fueron contadas usando un microscopio de luz [28].
Indice de Combinación
La interacción entre compuestos se cuantificó mediante la determinación del índice de combinación (IC) calculado por el Chou-Talalay la ecuación [29], [30]. La ecuación general para el isobolograma clásico está dado por: IC = (D) 1 /(Dx) 1 + (D) 2 /(Dx) 2. Donde Dx indica la dosis de un compuesto solo se requiere para producir un efecto, (D) 1 y (D) 2 son las dosis de los compuestos 1 y 2, respectivamente, necesarios para producir el mismo efecto en combinación. A partir de este análisis, los efectos combinados de los dos compuestos se pueden resumir como sigue: CI & lt; 1 indica sinergia; CI = 1 indica efecto aditivo; y CI & gt; 1 indican antagonismo
Los modelos murinos
Todos los estudios con animales se realizaron de acuerdo a los protocolos aprobados por el Comité de Ética Animal del Instituto de Zoología de la Academia China de Ciencias, con el ID de autorización. de AEC2011030205. Todos los ratones utilizados en este estudio fueron criados y mantenidos en un ambiente libre de patógenos específicos. células NCI-H1975 (2,5 × 10
6) se inyectaron por vía subcutánea en el flanco derecho de ratones desnudos. Cuando tumor alcanzó un tamaño palpable, los animales fueron asignados al azar en 3 grupos (n = 11 para cada grupo) y se trataron con V1801 (30 mg /kg /día), gefitinib (30 mg /kg /día) o vehículo de control por 3 semanas. Los animales se sacrificaron cuando los tumores alcanzaron 2 cm o si los ratones parecían moribundos para prevenir la morbilidad innecesaria a los ratones. En el momento de la muerte de los animales, se extirparon los tumores; las células se separaron y se lisaron por transferencia Western utilizando anticuerpo anti-Noxa y los anticuerpos anti-actina. entonces la expresión Noxa se cuantificó mediante análisis de densitometría y normalizado contra la expresión de actina.
El análisis estadístico
Todos los experimentos se repitieron al menos tres veces y los datos se presentan como la media ± SD a menos que se indique lo contrario.
P
los valores inferiores a 0,05 indican significación estadística.
Resultados
Efectos de miméticos de gefitinib en las células de cáncer de pulmón y la actividad quinasa de EGFR
En este trabajo, catorce análogos de gefitinib se sintetizaron mediante el intercambio de las posiciones de los sustituyentes C5 y C6 y variando la funcionalidad C4-amino del núcleo de quinazolina de gefitinib, y sus efectos sobre las células NCI-H1975 se evaluaron utilizando gefitinib como control (Tabla 1). Entre estos compuestos, V1801, V1802 y V1807 se encontraron para exhibir mucho más potente citotoxicidad contra las células NCI-H1975 que gefitinib, y V1801 es el más potente, cuya IC50 valor de 3 M es más de tres pliegues menor que la de gefitinib ( Tabla 1). Generalmente la introducción de un resto trifluorometilanilina a la posición C4 del núcleo de quinazolina es una manera eficaz de mejorar la citotoxicidad. Se encontró un sustituyente bromo en la posición C2 'para ser una modificación adecuada para la actividad más alta (V1801 V1802 frente, V1805 y V1808). Además, el resto piperidina en el terminal de C6-sustituyente de estos compuestos también es superior en comparación con la correspondiente morfolina, ciclohexano, azido, triazol y tetrazol funcionalidades.
Uso de 3- (4,5-dimetiltiazol -2-il) -2,5-difeniltetrazolio (MTT), que mostró que el V1801 muestra efectos inhibitorios significativos frente a la proliferación de NCI-H1975 (Fig. 1a) y de tipo salvaje A549 expresión del EGFR (Fig. 1b) las células en una manera dependiente de la dosis. Mediante el análisis de exclusión de azul de tripano, se encontró que V1801 reduce rápidamente viable NCI-H1975 (Fig. 1c) y A549 (Fig. 1d) células de una manera dosis-y dependiente del tiempo. Se evaluaron los efectos de la actividad V1801 sobre la formación de colonias de las células, y se informó de que, en comparación con gefitinib o control del vehículo, V1801 inhibió drásticamente la actividad clonogénico de células NCI-H1975 (Figs. 1e y 1f).
(una , b) Las células se trataron con gefitinib o V1801 durante 48 h, y se analizaron mediante el ensayo de MTT. (C, D) Las células fueron tratadas con gefitinib o V1801 para los puntos de tiempo indicados y se evaluaron mediante análisis de exclusión con azul de tripano. (E) ensayo de formación de colonias en agar blando de las células NCI-H1975 tratadas con o sin V1801 o gefitinib. (F) La cuantificación de recuento de focos. Se muestra la media ± SD de tres experimentos independientes. (G), h las células NCI-H1975 (g) y (h) HCC827 fueron tratados con gefitinib o V1801 durante 12 h, se lisaron, y la prueba de Western blot se realizó utilizando anticuerpos indicados.
Hemos probado los efectos de estos análogos de gefitinib en EGFR y mostraron que V1801, V1802 y V1805 ejerce actividad inhibidora moderada sobre la actividad quinasa de EGFR (Tabla 1). V1801 tenía una IC
50 en EGFR mucho más alta que la de gefitinib (701,9 nM vs 11,2 nM; Tabla 1), lo que indica que las nuevas modificaciones hechas en V1801 analógica son viables, pero menos superior para inhibir la actividad de EGFR quinasa. Por Western blot en células NCI-H1975, tanto gefitinib y V1801 no pudieron regular a la baja EGFR fosforilado (p-EGFR) (Fig. 1 g), mientras que en las células HCC827 gefitinib sensible, gefitinib, pero no V1801 inducida de-fosforilación de p -EGFR (Fig. 1 h). Estos resultados indican V1801 podría inducir la apoptosis de las células a través de un mecanismo independiente de la inhibición de la señalización del EGFR vía.
V1801 induce la apoptosis de las células de NSCLC de una manera dependiente de caspasas
A continuación se probó si V1801 o no induce apoptosis de las células. Por Hoechst 33258 tinción, se mostró en NCI-H1975 células V1801 causado condensación de la cromatina y fragmentación que son cambios morfológicos nucleares apoptóticos típicos (Fig. 2a). Un yoduro de anexina V /de propidio (PI) y citometría de flujo -staining ensayos confirmó que el tratamiento con V1801 durante 24 h apoptosis inducidas en NCI-H1975 y células A549 (Fig. 2b). Por análisis de transferencia Western, se encontró que el tratamiento V1801 para dar lugar a un marcado aumento en la forma activa de la caspasa-9, caspasa-8 y la caspasa-3 y la escisión de poli (ADP-ribosa) polimerasa (PARP) en células NCI-H1975 en la dosis y de la manera (Fig. 2c) dependiente del tiempo y en células A549 (Fig. 2d). Cuando las células NCI-H1975 se trataron previamente con un inhibidor de pan-caspasa benciloxicarbonil-Val-Ala-Asp fluorometilcetona (z-VAD.fmk; 20 M) durante 1 h seguido de tratamiento con V1801 a 3 mM durante 12 h, V1801- apoptosis inducida fue suprimida (Fig. 2e), lo que indica que la activación de la cascada de caspasas es esencial para V1801 inducida por apoptosis en las células gefitinib-resistencia.
(a) las células NCI-H1975 fueron tratados con gefitinib o V1801 para 24 h, y se evaluaron mediante el ensayo de Heochst33258. (B) Las células se trataron con gefitinib o V1801 durante 24 h, y la muerte celular por apoptosis se analizó por tinción con Anexina V /PI y citometría de flujo. (C) las células NCI-H1975 se trataron con V1801 o gefitinib (3 mM), se lisaron, y ensayo de transferencia Western se realizó utilizando anticuerpos indicados. (D) las células A549 se trataron con V1801 o gefitinib (3 M) durante 24 h, se lisaron, y ensayo de transferencia Western se realizó utilizando anticuerpos indicados. (E) las células NCI-H1975 se pre-trataron con z-VAD-fmk (20 M) durante 1 h seguido de tratamiento con V1801 a 3 mM durante 12 h, y las células apoptóticas se determinaron por Anexina V /PI tinción y el flujo de El análisis de citometría. Se muestra la media ± SD de tres experimentos independientes. **,
P
. & Lt; 0,01
V1801 hasta regula Noxa en las células NSCLC
Para dilucidar el mecanismo de acción de V1801, sus efectos sobre el expresión de proteínas anti-apoptóticas (Bcl-XL y Mcl-1) y de las proteínas pro-apoptóticos (Noxa, Puma y BIM) de la familia Bcl-2 fueron probados en células de NSCLC con el análisis de RT-PCR. Curiosamente, encontramos que V1801 aumentó fuertemente la expresión de Noxa de una manera dependiente del tiempo (Fig. 3a). A continuación, evaluó el efecto de V1801 en el nivel de proteínas de Noxa, y encontramos que el tratamiento con V1801 en 3 a 4 M durante 24 h notablemente hasta reguladas Noxa en células NCI-H1975 (Fig. 3b). En las células NCI-H1975 tratadas con V1801 a las 3 M durante 3 a 6 h, Noxa se aumentó drásticamente (Fig. 3c). En el A549, HCT116, BGC823 y SGC7901 células, el tratamiento con V1801 a los 3 a 6 M durante 24 h también hasta reguladas Noxa (Fig. 3d). Sin embargo, gefitinib no logró un máximo de regular Noxa en estas líneas celulares (Figs. 3a a 3d), indicando que estos dos compuestos tienen mecanismos totalmente diferentes en la inducción de apoptosis de células de cáncer de pulmón.
(a) RT-PCR el análisis de la expresión de
Noxa
,
Puma
,
Bim
,
Bcl-XL
, y
MCL-1 Restaurant at el nivel de ARNm en células NCI-H1975 tratados con gefitinib (3 M) o V1801 (3 M) para los puntos de tiempo indicados. (B) las células NCI-H1975 se trataron con V1801 a la concentración indicada durante 24 h, se lisaron y se analizaron por análisis de transferencia de Western usando un anticuerpo anti-Noxa. (C) las células NCI-H1975 se trataron con V1801 en 3 M de los puntos de tiempo indicados, se lisaron y se analizaron por análisis de transferencia de Western usando un anticuerpo anti-Noxa. (D) las células indicadas se trataron con V1801 o gefitinib durante 24 h, se lisaron, y se analizaron por análisis de transferencia de Western. (E) las células NCI-H1975 transfectadas con el control o siRNA específicos Noxa se trataron con o sin V1801 (3 M) durante 24 h, se lisaron, y se realizó análisis de transferencia de Western. (F) Las células fueron transfectadas con siRNA y se trataron con V1801 como se describe en (e), después se analizaron por tinción con Anexina V /PI y citometría de flujo. (G) las células NCI-H1975 fueron tratados con gefitinib o V1801, se lisaron, y ensayos de Western blot de inmunoprecipitación /se realizaron con anticuerpos indicados. (H, i) las células NCI-H1975 se trataron con V1801 o gefitinib durante 24 h, se lisaron, citosol y las fracciones mitocondriales se aislaron por centrifugación, y la transferencia Western se realizó utilizando anticuerpos indicados (h). La expresión de citocromo C se cuantificó mediante análisis de densitometría y normalizado contra GAPDH o Hsp75 (i).
Sobre regulación se requiere de Noxa para la apoptosis inducida por V1801 de las células de NSCLC
para evaluar su papel en la apoptosis inducida por V1801, Noxa fue silenciada por siRNA (Fig. 3e), y las células sobre V1801 se analizaron por tinción con Anexina V /PI y citometría de flujo. Encontramos que desmontables de Noxa atenuó significativamente la apoptosis inducida por V1801 de las células NCI-H1975 (Fig. 3F), lo que indica que la regulación de Noxa es esencial para la apoptosis inducida por V1801. Sin embargo, Noxa silenciamiento no podía abrogado por completo la apoptosis de células V1801 inducida (Fig. 3F), lo que sugiere que otros factores pueden estar implicados en la muerte celular programada provocada por este análogo gefitinib.
Noxa puede unirse directamente MCL-1 y competitivamente liberar Bim o Bak de este antagonista de la apoptosis, lo que lleva a la disfunción mitocondrial y el inicio de la muerte celular programada [18], [31]. Se realizó la co-inmunoprecipitación y ensayos de Western blot en células NCI-H1975-V1801 tratados, y se encontró que V1801 pero no gefitinib mejorado MCL-1-Noxa afinidad de unión (Fig. 3g). A continuación, examinó la localización subcelular de citocromo c por Western blot, mientras que la expresión del citocromo C se cuantificó por análisis densitométrico y se normalizó contra GAPDH o Hsp75. Se encontró que en células NCI-H1975 tratadas con V1801 (3 M), pero no gefitinib (3 M) durante 24 h, el citocromo c se transloca parcialmente de mitocondrias para citosol (Fig. 3 h y i). Estos resultados ilustran que el aumento de expresión de Noxa media la apoptosis inducida por V1801 a través de vía de las mitocondrias.
La investigación de los mecanismos subyacentes V1801 inducida Noxa regulación
Los estudios han demostrado que la p53, c-Myc y E2F1 puede aumentar transcripcionalmente la expresión Noxa a través de la unión directa de Noxa promotor [32]. Hemos probado la expresión de estos factores de transcripción, y se informó que sólo c-Myc se reguló en células NCI-H1975 tratadas con V1801 a las 3 M durante 3 h (Fig. 4a). Para determinar su papel en V1801-inducida Noxa regulación y la apoptosis de las células NCI-H1975, c-Myc fue silenciada por siRNA (Fig. 4b). Hemos encontrado que c-Myc silenciar ligeramente suprimió V1801-causado expresión Noxa (Fig. 4c) y la muerte celular programada en células NCI-H1975 (Fig. 4d). Para confirmar estos resultados, se empleó el inhibidor de c-Myc 5- (4-etil-benciliden) -2-tioxotiazolidín-4-ona (10 058-F4) [33] para inhibir la función de transcripción c-Myc. Los resultados mostraron que 10 058-F4 parcialmente reprimida V1801 inducida Noxa regulación (Fig. 4e) y la citotoxicidad en células NCI-H1975 (Fig. 4f).
(a) las células NCI-H1975 fueron tratados con gefitinib (3 M) o V1801 (3 M) para los puntos de tiempo indicados, se lisaron, y el ensayo de Western blot se llevó a cabo utilizando anticuerpos indicados. (B) análisis de transferencia de Western usando lisados de células NCI-H1975 transfectadas con el control o siRNA específico c-Myc y un anticuerpo anti-c-Myc. (c) las células NCI-H1975 transfectadas con ARNsi específicos de c-myc se trataron con o sin V1801, se lisaron, y la transferencia Western se realizó utilizando anticuerpos indicados. (D) las células NCI-H1975 transfectadas con ARNsi específicos de c-myc se trataron con o sin V1801, y evaluado por anexina V /PI tinción y citometría de flujo. (E) las células NCI-H1975 fueron tratados con los protocolos indicados durante 24 h, se lisaron, y se realizó análisis de transferencia de Western. (F) las células NCI-H1975 fueron tratados con los protocolos indicados durante 24 h, y se evaluaron mediante el ensayo de MTT. *,
p Hotel & lt; 0,05; **,
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Estudios anteriores mostraron que el cisplatino puede regular por incremento Noxa en forma dependiente de Erk, y la inhibición de Erk de siRNA o pequeño U0126 compuesto inhibidor marcadamente atenuada muerte inducida por cisplatino celular así como la expresión Noxa [15]. Hemos probado los efectos de la V1801 de Erk, y se encontró que en las células NCI-H1975 tratadas con V1801 a las 3 M durante 12 h, la fosfo-ERK (p-ERK) se incrementó (Fig. 5a). Tratado con V1801 durante 24 h también las reguladas los transductores de señal fosfo y activadores de la transcripción 3 (p-STAT3), pero no fosfo-Rac-serina /treonina-proteína quinasa (5a Fig.) (P-Akt). Se mostró que U0126 podría atenuar la expresión Noxa V1801 inducida (Fig. 5b) y ligeramente (p = 0,06) redujo la apoptosis inducida por V1801 de las células NCI-H1975 (Fig. 5c).
(a) NCI -H1975 células fueron tratadas con gefitinib (3 M) o V1801 (3 M) para los puntos de tiempo indicados, se lisaron, y se realizó análisis de transferencia de Western. (B) células NCI-H1975 fueron tratados con protocolos indicados durante 12 ó 24 h, se lisaron, y se realizó el análisis de transferencia Western. (C) las células NCI-H1975 fueron tratados con los protocolos indicados durante 24 h, y la muerte celular por apoptosis se evaluó mediante tinción con anexina V /PI y citometría de flujo. (D) las células NCI-H1975 se trataron durante 24 h con BOR y /o V1801, y luego evaluados por el ensayo de MTT. (E) las células NCI-H1975 se trataron con V1801 (2 M), gefitinib (2 M), BOR (10 nM), o sus combinaciones para los puntos de tiempo indicados. Las células se lisaron y se sometieron a transferencia de Western usando anticuerpos indicados.
En el linfoma de células del manto, se requiere la activación Noxa para la apoptosis inducida por bortezomib inhibidor del proteasoma [13]. Hemos probado el efecto combinado de V1801 y bortezomib en células NCI-H1975 y encontramos que bortezomib en V1801 10-15 nm mejorado significativamente (2 M) inhibición de la proliferación celular: provocada (Fig. 5d). Un análisis del índice de combinación (CI) [29], [30] indicó que los valores de CI eran menos de 1, lo que indica que estos dos agentes pueden ejercer efectos sinérgicos en células de NSCLC. A nivel molecular, se demostró que el tratamiento de células NCI-H1975 con V1801 y bortezomib resultó en una mayor regulación de Noxa y la activación de Casp-3 y la escisión de PARP (Fig. 5e). Sin embargo, la sobre regulación de p-ERK inducida por la V1801 fue ligeramente atenuada por el bortezomib (Fig. 5e).
En vivo
eficacia antitumoral de V1801 en el modelo de ratón con xenoinjerto
Hemos probado la
in vivo
eficacia antitumoral de V1801. Para ello, se inocularon ratones desnudos por vía subcutánea en el flanco derecho con 2,5 x 10
6 células NCI-H1975 en 0,1 ml de PBS. Cuando los tumores alcanzaron un tamaño palpable, los ratones se asignaron al azar en 3 grupos (n = 11 para cada grupo) y la administración oral con V1801 (30 mg /kg /día), gefitinib (30 mg /kg /día) o vehículo de control para 3 semanas. Curiosamente, se encontró que V1801 crecimiento del tumor inhibió significativamente en comparación con el control del vehículo o gefitinib (P & lt; 0,05) (Figs 6a a 6c.). Los animales fueron sacrificados cuando fueron tratados durante 3 semanas y las muestras de tumores fueron aislados y la imagen (Fig. 6c). Las proteínas se extrajeron a partir de muestras tumorales y ensayo de Western blot se llevó a cabo. Se encontró que en las muestras de ratones tratados con V1801, la expresión de Noxa era regulada-up en comparación a la de las muestras separadas de los ratones vehículo o gefitinib de control (Fig. 6D y E). Estos resultados demuestran que la administración de V1801 exhibe enormes potenciales terapéuticos
.
(a) ratones Nude inoculó por vía subcutánea con células NCI-H1975 fueron tratados con gefitinib o V1801 durante 3 semanas, y las mediciones de la pinza de los diámetros tumorales perpendiculares más largos eran realizado cada dos días para estimar el volumen del tumor. (B) Las imágenes de los ratones dos semanas después de iniciar el tratamiento. (c) Las imágenes de xenoinjertos de tumores obtenidos de ratones. Se muestran ocho tumores representativos de cada grupo de tratamiento. (D, e) análisis de transferencia de Western de lisados de muestras de tumor utilizando anticuerpos indicados (d). Noxa expresión se cuantificó mediante análisis de densitometría y normalizado contra la expresión de actina (e).
Discusión
EGFR es un receptor de la superficie celular activado en más de la mitad de los pacientes con CPNM, y esta activación puede ser el resultado de la proteína sobre-expresión, aumento del número de copias del gen, o mutaciones genéticas [2]. efectos contra el cáncer de pulmón de Gefitinib atribuyen a su unión al sitio de unión de la adenosina trifosfato en el dominio tirosina quinasa de EGFR, lo cual inhibe la actividad quinasa del EGFR [3], [5], [34], [35]. Aunque muchos pacientes responden inicialmente a gefitinib, la resistencia y la recurrencia del tumor eventualmente desarrollan. Para superar tal resistencia a los medicamentos, se informó de nuevos inhibidores de EGFR quinasa mutantes selectivos contra EGFR T790M [36], y las quinazolinas 4-pyrrylamino como nuevos análogos de gefitinib se sintetizaron [37]. En este estudio, diseñamos, sintetizamos y evaluamos una serie de nuevos derivados de quinazolina mediante el intercambio de las posiciones de los sustituyentes C5 y C6 y variando la funcionalidad C4-amino de gefitinib, y el informe que V1801 compuesto que tiene un grupo trifluorometilo en la C5'- posición y un átomo de bromo en la posición C2 'del resto de anilina sustituido en la posición C4 del núcleo de quinazolina contra la resistencia al gefitinib a través de la regulación de Noxa, lo que sugiere una nueva estrategia para luchar contra el CPNM con mutación de EGFR T790M.