Extracto
quinasa asociada a la ciclina G (GAK), un jugador clave en el tráfico de membrana mediada por clatrina, se sobreexpresa en diversas células cancerosas. Aquí, mostramos que la expresión GAK se correlaciona positivamente con la puntuación de Gleason en la pieza quirúrgica de pacientes con cáncer de próstata. fibroblastos de embriones de ratones knockout que expresan una forma quinasa muerta (KD) de GAK mostraron constitutiva hiper-fosforilación del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR). Además de la conocida gefitinib y erlotinib inhibidores de EGFR, la luteolina flavonoides de la dieta era un potente inhibidor de la actividad quinasa Ser /Thr de GAK
in vitro
. Co-administración de luteolina y gefitinib a las células PC-3 tuvo un mayor efecto sobre la viabilidad celular de la administración de cualquier compuesto solo; esta disminución de la viabilidad se asoció con drástica baja regulación de la expresión de la proteína GAK. Un análisis exhaustivo conjunto de microARN reveló aumento de la expresión de miR-630 y miR-5703 después del tratamiento de PC-3 células con luteolina y /o gefitinib, y la sobreexpresión exógena de miR-630 causado la detención del crecimiento de estas células. GAK parece ser esencial para la muerte celular debido a la co-administración de gefitinib y luteolina a las células U2OS osteosarcoma EGFR deficientes también tuvo un mayor efecto sobre la viabilidad celular de la administración de cualquier compuesto solo. Tomados en conjunto, estos hallazgos sugieren que GAK puede ser una nueva diana terapéutica para el cáncer de próstata y el osteosarcoma
Visto:. Sakurai MA, Ozaki Y, Okuzaki D, Naito Y, Sasakura T, Okamoto A, et al. (2014) Gefitinib y luteolina detención del crecimiento Causa de cáncer de próstata humano PC-3 células mediante la inhibición de la ciclina G-quinasa asociada y la inducción de miR-630. PLoS ONE 9 (6): e100124. doi: 10.1371 /journal.pone.0100124
Editor: Ichiro Aoki, Escuela de Medicina de la Universidad de la Ciudad de Yokohama, Japón
Recibido: 20 Febrero, 2014; Aceptado: 21 de mayo de 2014; Publicado: 27 Junio 2014
Derechos de Autor © 2014 Sakurai et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado en parte por subvenciones-en-Ayudas a la Investigación Científica S (Nº 15101006), Investigación Científica B (Nº 20370081 y 23370086), y la investigación exploratoria (Nº 21.651.085) para HN; Investigación Científica y C (N ° 22.570.185) a Nueva York desde el Ministerio de Educación, Cultura, Deportes, Ciencia y Tecnología de Japón. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de próstata es uno de los cánceres más frecuentemente diagnosticados y es la causa principal de muerte por cáncer en los varones en todo el mundo [1]. Debido a que es impulsado principalmente por receptor de andrógenos (AR) de señalización, el cáncer de próstata avanzado se trata típicamente por la terapia de privación de andrógenos, en el que la castración quirúrgica o médica se lleva a cabo para bloquear activo de señalización AR ya sea mediante la eliminación del ligando o afectar al receptor directamente [2] . Aunque es eficaz, la ablación de andrógenos controla el cáncer de próstata metastásico por sólo unos pocos años y casi todos los pacientes desarrollan cáncer de próstata refractario a las hormonas progresiva (CPRH). la terapia de privación de andrógenos no es curativo para estos pacientes incluso cuando se combina con terapias más eficaces que se dirigen a la síntesis central de testosterona, tales como el inhibidor de abiraterona CYP17A1 y el antagonista de AR MDV3100 [3], [4]. La identificación de un nuevo objetivo que controla AR señalización indirecta, o incluso un objetivo que no está relacionada con la señalización AR, puede ser útil para el desarrollo de nuevos enfoques terapéuticos para CPRH.
La quinasa ubicua asociada expresada G-ciclina (GAK) regula la trata mediada por clatrina de la membrana actuando como un cofactor esencial para uncoating Hsc70 dependiente de vesículas revestidas de clatrina en el citoplasma [5], [6]. GAK también se localiza en el núcleo [7], donde actúa como un coactivador transcripcional del ARS. En particular, la expresión de GAK es significativamente mayor en las células CPRH [8]. Por otra parte, GAK juega un papel en el mantenimiento de la correcta maduración del centrosoma y congression cromosoma mitótico, y desmontables siRNA mediada de GAK activa el husillo de control y el ensamblaje, que detecta sobresalía, mal alineados, o anormalmente cromosomas condensados, lo que lleva a la detención del ciclo celular en la metafase [9]. GAK es esencial para el crecimiento celular desde GAK nocaut (GAK
- /-) ratones son embriones letal [10] y el ratón de fibroblastos embrionarios (MEF) derivados de GAK
- /- ratones no pueden dividirse y finalmente se convertirá en senescentes [ ,,,0],11] debido a la interrupción de la endocitosis mediada por clatrina. Sin embargo, que anteriormente mostró que knockout ratones que expresan la forma quinasa-muertos de GAK (GAK-kd) eran MEFs letales y GAK-kd no embrionarias crecieron normalmente [12], lo que sugiere que la pérdida de actividad de la quinasa GAK puede no ser letal en las células normales que expresan la cantidad adecuada de GAK. Esta evidencia sugiere que un inhibidor de la actividad quinasa GAK podría utilizarse para desarrollar una nueva terapia diana molecular que inhibe selectivamente el crecimiento de células CPRH con expresión GAK mejorado mediante el control de la señalización AR indirectamente.
Gefitinib [13], un inhibidor de tirosina quinasa selectivo para el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), también inhibe la actividad quinasa de GAK [14]. A pesar de EGFR [15] y GAK [8] se expresa en altos niveles en el cáncer de próstata y su mayor expresión se asocia con un mal pronóstico [8], [15], la administración de gefitinib solo es ineficaz [16] y las administraciones combinadas de gefitinib y radioterapia [17] o docetaxel [18] han limitado los efectos terapéuticos. La luteolina, un flavonoide de la dieta común que se encuentra en una gran variedad de plantas y alimentos [19], es otro antagonista de las proteínas quinasas de tirosina de EGFR-asociado. Similar a gefitinib, luteolina provoca la detención del crecimiento de células de cáncer de próstata humano PC-3 a través de la regulación del ciclo celular genes reguladores [20]. La luteolina también inhibe las topoisomerasas de ADN, los objetivos clínicos de medicamentos contra el cáncer [21]. Por lo tanto, luteolina puede ser útil como un medicamento contra el cáncer, aunque su
bona fide
objetivo (s) y los mecanismos moleculares implicados en la inhibición de la proliferación de células cancerosas siendo difícil de alcanzar debido a su amplio espectro de propiedades farmacológicas.
el objetivo de este estudio fue identificar un nuevo factor que controla la señalización indirecta en pacientes con CPRH AR, y para examinar si GAK podría ser objetivo para la terapia de CPRH no sólo, sino también otros tipos de cáncer con expresión GAK mejorada. De hecho, aquí informe que un aumento en la expresión de GAK en pacientes con CPRH se correlaciona positivamente con la puntuación de Gleason, una medida de la gravedad de la enfermedad. Tanto GAK y AR localizado en el núcleo de las células de cáncer en muestras quirúrgicas GAK-positivo. Un
vitro
ensayo de quinasa in reveló que la luteolina y gefitinib inhiben la actividad quinasa de GAK con potencia similar, lo que sugiere su utilidad como inhibidores de la actividad quinasa de GAK. En comparación con los efectos de cualquiera de los fármacos solos, co-administración de luteolina y gefitinib a células PC-3 tenían un mayor efecto inhibidor sobre la viabilidad celular. Estos compuestos también tenían un efecto inhibidor acumulativo sobre expresión de la proteína GAK que era independiente de la degradación mediada por proteasoma. Tomados en conjunto, los resultados presentados aquí sugieren que GAK, que se sobreexpresa en muchas células cancerosas, es un nuevo candidato prometedor para la quimioterapia dirigida.
Materiales y Métodos
Los anticuerpos y siRNAs
los anticuerpos contra las proteínas siguientes se utilizaron en este estudio: AR (Santa Cruz Biotechnology), caspasa 3 activa (Cell Signaling Technology), Ki67 (Dako), Lefty (Abcam), lamina a /C (Bethyl Laboratories), EGFR ( conejo; Cell Signaling Technology), EGFR (ratón; Millipore), ERK1 /2 (Cell Signaling Technology), pERK (Cell Signaling Technology), GAPDH (Fitzgerald) y α-tubulina (Sigma-Aldrich). Los anticuerpos monoclonales anti-GAK se prepararon como se informó anteriormente [7]. Los siRNAs Lefty1-específicos fueron adquiridos de OriGene Tecnologías y Gene diseño em
Productos químicos y suplementos dietéticos
Los siguientes productos químicos y los suplementos dietéticos se utilizaron en este estudio:. Gefitinib (Tocris Bioscience), erlotinib ( Kemprotec), SB203580 (LC Laboratories), LutiMax (CalComp Nutrition), Oryza luteolina (Oryza Oil & amp; Fat Chemical), luteolina (Sigma-Aldrich), el resveratrol (Sigma-Aldrich), y DMSO (Sigma-Aldrich)
cultivo de células
células
el PC-3 fueron proporcionados por el Banco de Recursos de investigación del cáncer de Japón. Todas las otras células cancerosas humanas se adquirieron de la American Type Culture Collection. Las células se mantuvieron en 5% de CO
2 a 37 ° C en medio de Dulbecco modificado de Eagle suplementado con suero bovino fetal al 10% (FBS, Hyclone Laboratories), 100 U /ml de penicilina, y 100 mg /ml de estreptomicina. WT (GAK-kd
+ /+) y GAK-kd
- /- MEFs se mantuvieron en medio MEF (medio de Eagle modificado de Dulbecco suplementado con 10% FBS, penicilina, estreptomicina y 50 mM 2-mercaptoetanol) como se describe anteriormente [22].
EGF estimulación
Después de dos lavados en solución salina tamponada con fosfato (PBS), MEFs se cultivaron en medio MEF bajo en suero (que contiene 0,5% de FBS) durante 12 marido. Se añadió EGF de ratón (Sigma) al medio de cultivo a una concentración final de 10 ng /ml (para el análisis de transferencia de Western) o 100 ng /ml (por inmunofluorescencia), y las células fueron incubadas en 5% de CO
2 a 37 ° C durante los tiempos indicados.
análisis FACS
las células se tiñeron usando el kit de Cycletest Plus Reactivo de ADN (BD Bioscience), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El análisis se realizó utilizando un instrumento FACS Calibur con el software CellQuest (BD Bioscience).
Curva de crecimiento análisis
Aproximadamente 1,0 × 10
3 PC-3 células fueron sembradas en un Petri de 3,5 cm plato y se incubaron a 37 ° C durante la noche. Gefitinib, luteolina, y el resveratrol se disolvieron en DMSO y se añadió al medio de cultivo en el tiempo cero.
Medición
La viabilidad celular utilizando el miR-630
La expresión de miR-630 de la PEP-miRNASelect vector de expresión de HSA-mir-630 se realizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Cell Biolabs). Para determinar la viabilidad, las células se sembraron en placas de 6 pocillos a una densidad de 1 × 10
5 células por pocillo y luego se trataron con tripsina en los puntos de tiempo indicados. El número de células en proliferación se determinaron usando un contador de células automatizado condesa (Invitrogen).
El análisis histológico
especímenes quirúrgicos de pacientes sometidos a prostatectomía radical se fijaron en formalina tamponada al 10%, embebidos en parafina, y luego se corta en 4 micras de espesor de serie de secciones. Las primeras secciones se tiñeron con hematoxilina y eosina y se utilizan para el diagnóstico patológico de la región inflamada. Las tres secciones restantes se sometieron a análisis de inmunohistoquímica, como se describe anteriormente [23]. Brevemente, las secciones desparafinadas se trataron en autoclave en tampón de citrato 0,1 M, se bloquearon con albúmina de suero bovino, y después se incubaron con anticuerpos primarios en PBS que contenía 2% de albúmina de suero bovino. incubaciones de anticuerpos secundarios y reacciones de mejora de la señal se realizaron utilizando el kit de tinción simple Histofine (Nichirei) y el color fue desarrollado usando aminoethlcarbazole (AEC Impacto; Vector Laboratories). Las secciones se counterstained con hematoxilina para la visualización nuclear y luego montadas utilizando Ultramount acuosa Permanente medio de montaje (Dako). Las imágenes se registraron utilizando un microscopio (BX51; Olympus) equipado con una cámara CCD (DP72; Olympus).
Análisis de transferencia Western
Para preparar lisados de células enteras, las células se lisaron a 4 ° C durante 30 min en tampón RIPA modificado (10 mM Tris-HCl pH 7,5, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, 1% NP-40, ditiotreitol 1 mM, 0,1% de SDS, y 0,1% de desoxicolato) suplementado con inhibidor de proteasa 1% cóctel (Sigma-Aldrich), mM NaF 1, Na 1 mM
3Vo
4, y 10 mM β-glicerofosfato. Después de la centrifugación, los lisados despejadas se sometieron a SDS-PAGE. Las proteínas resueltas se transfirieron a membranas de PVDF, que fueron bloqueados y luego a inmunotransferencia con los anticuerpos indicados en solución salina tamponada con Tris y Tween 20 conteniendo 5% de leche descremada. Las bandas de proteínas inmunorreactivas se visualizaron utilizando reactivos ECL Plus Western Rayo (PerkinElmer).
Se llevó a cabo la purificación de proteínas recombinantes
La purificación de las proteínas marcadas con GST para ensayos de quinasa como se describe anteriormente [22]. En pocas palabras,
E. coli
células BL21 transformadas con el plásmido pGEX se incubaron en caldo Luria-Bertani a 37 ° C hasta que alcanzaron una absorbancia de 0,4-0,8 a 600 nm. La expresión de cada proteína recombinante fue inducida por exposición durante la noche de las células a IPTG 0,5 mM a 20 ° C. a continuación, las células se recogieron y se lisaron por sonicación en PBS que contenía 1% de Triton X-100, 1 mg /ml de leupeptina, 1 mg /ml de aprotinina, 1 mg /ml de pepstatina A, benzamidina 1 mM, 100 mg /ml fluoruro de fenilmetilsulfonilo, 1 NaF mM y 1 mM Na
3Vo
4. Después de la centrifugación, el lisado aclarado se adsorbió a Glutathione Sepharose 4B (Amersham Pharmacia Biotech), se enjuagaron con PBS, y después se eluyó con un tampón que contiene 10 mM de glutationa reducida (Nacalai Tesque).
In vitro
ensayo de quinasa del GAK
in vitro
quinasa ensayos se realizaron utilizando GST-etiquetados AR humana (~ 150 g /ml) como la muestra de ensayo y se purifica GAK humana marcada con GST (~ 100 g /ml) como la prueba de quinasa. Un fragmento purificado del subtipo B'γ3 de ratón PP2A (B'γ; ~ 10 mg /ml) se utilizó como sustrato de control GAK positiva, como se describe anteriormente [22]. Aurora A quinasa (~ 50 g /ml) y LATS1 /2 quinasa (~ 25 g /ml; en presencia o ausencia de Mob1A (~ 50 g /ml) como su activador) se utilizaron como enzimas de control positivo, y una quinasa -dead (KD) forma de Aurora a quinasa (~ 50 mg /ml) se utilizó como control negativo para la fosforilación de la AR. Las quinasas y proteínas sustrato se incubaron durante 30 min a 30 ° C en 10 tampón de reacción l (mM HEPES pH 7,5, NaCl 50 mM, MgCl 10
2, mM MnCl 5 mM DTT 10
2, 1, mM NaF 5 y 50 mM de β-glicerofosfato) que contiene ATP 5 mM y 10 Ci [γ-
32P] ATP (PerkinElmer). Cuando sea necesario, gefitinib, erlotinib, SB203580, el resveratrol, y la luteolina se incluyeron en las concentraciones indicadas. La reacción se detuvo por la adición de 4 x tampón de Laemmli (0,4 M Tris-Cl pH 6,8, 8% de SDS, 20% de glicerol, 10% de 2-mercaptoetanol, y 0,2% de azul de bromofenol). Las muestras se resolvieron mediante gradiente de SDS-PAGE usando un aparato de Multigel II Mini (Daiichi Pure Chemicals) y se detectaron por autorradiografía. Las cantidades de proteínas cargadas en el gel fueron controlados por tinción con azul brillante de Coomassie (Bio-Rad) o SimplyBlue SafeStain ™ (Life Technologies).
microarrays genoma humano análisis
análisis
microarrays se realizaron como hibridaciones de un solo color utilizando Agilent Plenario del Genoma humano de oligonucleótidos microarrays (4 × 44K; código de producto: 4112F). ARN total fue extraído a partir de células PC-3 24 h después del tratamiento con DMSO, 60 mM luteolina, 60 mM gefitinib, o 60 mM luteolina más 60 mM gefitinib usando un kit Mini miRNeasy de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Qiagen). Se determinó la calidad del ARN usando el kit de Nano LabChip RNA 6000 en el Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies). El ARN se transcribe inversa utilizando transcriptasa AffinityScript (Agilent Technologies) y cebadores oligo-dT que contienen la secuencia promotora de ARN polimerasa de T7 inversa.
In vitro de transcripción
continuación se llevó a cabo utilizando ARN polimerasa de T7 y una entrada de bajo Quick-Amp Labeling Kit (Agilent Technologies) para etiquetar los ARNc con Cy3-CTP (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). Purificados ARNc marcadas con Cy3 (1650 ng) se hibridó con los microarrays. Lavado, la exploración y análisis de genes se realizaron de acuerdo con el protocolo del fabricante (Agilent Technologies). Agilent software de extracción de características (v. 10.5.1) se utilizó para evaluar la calidad del terreno y extraer estadísticas de intensidad de características. La Plataforma subio y subio básico Plug-in (v1.15; subio Inc.) se utilizaron para calcular la muestra entre los factores de cambio, las cuales fueron analizadas por una muestra de
t-pruebas
Estudiante. Los datos de microarrays se han depositado en la base de datos de expresión de genes de Omnibus (www.ncbi.nlm.nih.gov/geo) bajo el número de GSE53180.
miARN humano microarrays análisis
El análisis de microarrays miARN se realizó a través de Agilent SurePrint v18.0 humano arrays miARN, que contienen 20-40 funciones de orientación 1919 miRNAs humanos catalogados en la versión 8.0 de la base de datos de Sanger (design ID 025416). Las alícuotas de ARN total (100 ng) se utilizaron para preparar sondas de genes miARN, de acuerdo con el protocolo de Agilent (v. 2.4). Brevemente, el ARN total se desfosforiló con fosfatasa alcalina de intestino de ternera, desnaturalizado con DMSO, y luego marcó con Cyanine 3-PCP utilizando ARN ligasa de T4 y el kit de marcado de miARN. Las sondas se hibridaron con las matrices durante 20 horas a 55 ° C con rotación mediante el Agilent miRNA hibridación Kit. microarrays se efectuaron por duplicado para las células PC-3 tratadas con DMSO, luteolina, gefitinib, o luteolina y gefitinib. Los portaobjetos se lavaron con expresión de genes de tampón de lavado 1 (Agilent) a temperatura ambiente durante 5 min y luego con la expresión génica de tampón de lavado 2 (Agilent) a 37 ° C durante otros 5 min. Después de la hibridación y el lavado, las diapositivas fueron escaneados utilizando un escáner de Agilent (G2505C). Las imágenes se obtuvieron mediante el software Agilent extracción de características (v. 10.7.3) y el software Agilent GeneSpring GX (v. 12.6). Se utilizó el gen de la señal total a partir de los archivos de datos GeneView (extraído con la configuración predeterminada en el software de extracción de características Agilent). Las diferencias en los niveles de expresión de genes miARN se normalizaron utilizando la muestra tratada DMSO PC-3 como control. aFold-cambios mayores que 2,0 y
P
-valores inferior a 0,05 (de Student
t-test
) se consideraron para su posterior análisis. Los datos de microarrays miARN se han depositado en la base de datos Gene Expression Omnibus con el número de GSE53178.
Cuantitativo PCR en tiempo real
analiza
RT-PCR cuantitativa se realizaron utilizando un ABI PRISM 7900 instrumento (PE Applied Biosystems) y sondas TaqMan ensayo-on-Demand para Lefty1 (Hs00764128_s1), miR-630 (HSA-mir-630), y miR-5703 (HSA-mir-5703), de acuerdo con los protocolos del fabricante (Agilent Technologies).
el análisis estadístico
las barras de error para todos los datos representan desviaciones estándar de la media.
P
-valores se calcularon utilizando de Student
t
-pruebas, a menos que se indique lo contrario.
Ética
Las muestras humanas fueron recogidos mediante una biopsia de la próstata de pacientes de cáncer con los datos clínicos relevantes en el hospital de la Universidad de Kinki. Todos los experimentos con muestras humanas fueron aprobados por el comité de ética de la Universidad de Osaka (Aprobación Nº 326) y la Universidad de Kinki (Aprobación#23-088); nuestro comité de ética renunciado a la necesidad de consentimiento. Las muestras quirúrgicas de los pacientes sometidos a prostatectomía radical en el Hospital de la Universidad de Kinki (Osaka, Japón) fueron fijadas en formalina al 10%, embebidos en parafina, y luego se corta en 4 micras de espesor de serie de secciones.
Resultados
GAK se localiza principalmente en el núcleo en las células cancerosas
Aunque GAK se localiza principalmente en el citoplasma en las células normales tales como TIG-1, se informó recientemente de que una fracción de la proteína también se encuentra en el núcleo [7 ]. En particular, un estudio anterior utilizando un microarray de tejido terapia hormonal neo-adyuvante demostró que la expresión de GAK aumenta significativamente durante la progresión del cáncer de próstata a la independencia de andrógenos [8]. Para determinar si la expresión de GAK se ve aumentada en los núcleos de las células cancerosas, las inmunotransferencias se utilizaron para medir los niveles de proteína GAK en fracciones citoplasmáticas y nucleares de varias líneas celulares de cáncer. En las células de cáncer de próstata humano de la hormona insensible (PC-3), GAK se expresó a un nivel superior en el núcleo que en el citoplasma; este resultado se confirmó usando dos anticuerpos monoclonales diferentes (carriles 3 y 4 en la Fig. 1). Aunque la cantidad de GAK era bajo, los núcleos de las células de cáncer de próstata humano sensibles a las hormonas (LNCaP) también expresaron GAK (carril 6 en la Fig. 1). Por otra parte, la banda GAK nuclear migró más rápido que la banda GAK citoplásmica, lo que sugiere distintas modificaciones de la proteína en estos compartimentos celulares. También se observaron resultados similares para las células MCF-7 de cáncer de mama MDA-MB231 y, así como células de cáncer cervical HeLaS3 (Fig. 1). Por el contrario, GAK estaba presente en niveles más altos en la fracción citoplásmica de la fracción nuclear de TIG-1 fibroblastos normales (Fig. 1). En particular, las células cancerosas de la hormona insensible (PC-3 y MDA-MB231) expresaron GAK en niveles más altos que las células cancerosas sensibles a las hormonas (LNCaP y MCF-7). Tomados en conjunto, estos resultados indican que GAK se modifica y se sobreexpresa en células de cáncer, especialmente las células metastásicas.
análisis de transferencia Western de GAK, lamin A /C, y α-tubulina (control) en citoplasmática (Cyt) y nuclear (Nuc) extractos de cáncer de próstata (PC-3 y LNCaP), cáncer de mama (MDA-MB231 y MCF-7) y líneas celulares de cáncer cervical (HeLaS3). Lamin A /C se utilizó como un marcador nuclear. Se utilizaron dos anticuerpos anti-GAK diferentes. Las flechas y puntas de flecha indican las bandas GAK identificados principalmente en las fracciones nucleares y citoplasmáticas, respectivamente.
Nuclear GAK se expresa en altos niveles en muestras quirúrgicas de pacientes con cáncer de próstata
Para determinar si se produce sobreexpresión nuclear de GAK
in vivo
, análisis inmunohistoquímico de muestras quirúrgicas normales y cancerosas de pacientes con cáncer de próstata 42 se llevaron a cabo. Aunque GAK solamente se expresó débilmente en los tejidos normales, la proteína se expresó en niveles altos en los núcleos de las células cancerosas (Fig. 2A-E). Una prueba de chi-cuadrado reveló una correlación positiva estadísticamente significativa entre GAK inmunotinción y la puntuación de Gleason (Tabla 1 y Tabla S1).
A-D, hematoxilina y eosina (HE) y la tinción (A, B) y anti inmunotinción -GAK tejidos de pacientes con cáncer de próstata (n = 42) (C, D) de las secciones de prostatectomía radical representativas de cancerosos (A, C) y normal (B, D). Barra de escala = 50 micras. E, una mayor ampliación del poder del área de caja se muestra en C. Barra de escala = 50 micras.
Para instalar sobre la activación de la señalización AR se asocia con la progresión de próstata andrógeno-dependientes-cánceres. Debido GAK interactúa con el AR
in vitro
[8], se utilizó la inmunotinción para determinar si GAK también colocaliza con el AR
in vivo
. Se detectó la localización nuclear de GAK y la AR en los núcleos de las células de cáncer de todos los especímenes quirúrgicos GAK-positivos (n = 4 pacientes con una puntuación de Gleason ≤7 y n = 5 pacientes con una puntuación de Gleason ≥8) (Fig. S1) . Sin embargo, a pesar de su localización nuclear, la fosforilación directa de la AR por GAK no fue detectado por un
in vitro
ensayo de quinasa en la (Fig. S1E). Por otra parte, en tres muestras independientes de pacientes, GAK y la AR no colocalize con Ki-67, un antígeno de cáncer que se encuentra principalmente en las células en crecimiento y está ausente en las células (Fig. S2) descansando. Este hallazgo sugiere que la colocalización de GAK y la AR no se correlaciona necesariamente con el crecimiento de las células cancerosas.
citoplasmática GAK regula las vías de señalización mediada por EGFR
El descenso de regulación de GAK reduce la tirosina quinasa actividad del EGFR y altera sus vías de señalización corriente abajo [5]. Para determinar si esta regulación está mediada por la actividad de la quinasa Ser /Thr de GAK, se investigó el comportamiento de la EGFR en MEFs GAK-kd [12]. Un análisis de inmunotransferencia de tipo salvaje (WT) y MEFs KD-GAK reveló la presencia de dos proteínas de EGFR en ambas muestras, la mayor de las cuales era predominante en MEFs KD-GAK (Fig. 3A). La banda más grande desapareció después del tratamiento de las células con λ-fosfatasa (Fig. 3B, carril 2), lo que sugiere que representaba una forma fosforilada de la EGFR. El inhibidor de la Tyr-fosfatasa Na
3Vo
4, pero no el inhibidores de la fosfatasa Ser /Thr NaF, β-glicerofosfato, y ácido okadaico, abolió este efecto de λ-fosfatasa, lo que sugiere que los residuos de Tyr de la EGFR son constitutivamente fosforilada en MEFs GAK-kd en ausencia de EGF estímulo (Fig. 3B). Del mismo modo, cuando los MEFs se mueren de inanición de suero durante 11 h, se trató con cicloheximida durante 1 h para inhibir la síntesis de nueva proteína y, a continuación, estimulado por la adición de EGF, la fosforilación de la EGFR fue más prominente en MEFs GAK-kd que WT MEFs (Fig . 3C y 3D). En particular, se detectó una proteína EGFR aún mayor en ambos WT y GAK-KD MEFs 10 min después de la estimulación de EGF (Fig. 3C y 3D), lo que sugiere que el EGF incrementa el número de residuos fosforilados en Tyr el EGFR. Este hiperfosforilación aceleró la desfosforilación de quinasas fosforiladas extracelulares reguladas por señales 1/2 (pERK1 /2) (Fig. 3C), que son los efectores de la EGFR, lo que sugiere la disminución prematura de la señalización de EGFR.
A , análisis de transferencia de Western de la expresión de EGFR en WT (GAK-KD
+ /+) y mutante (GAK-kd
- /- MEF). B, los efectos de un inhibidor de la Tyr-fosfatasa (Na 50 mM
3Vo
4) y los inhibidores de la fosfatasa Ser /Thr (NaF 50 mM y 50 mM β-glicerofosfato, o 2,5 M de ácido ocadaico) sobre la inhibición de fosforilación de EGFR por λ-fosfatasa (λPPase; 200 U). A, B, las flechas indican la proteína EGFR fosforilado. Alfa-tubulina (α-Tub) se utilizó como control de carga. (C, D) Análisis Western blot de niveles de expresión del EGFR y ERK1 /2 en WT (+ /+) y GAK-kd (- /-) después de la estimulación MEFs EGF durante los tiempos indicados. Se añadió cicloheximida (50 mg /ml) al medio de cultivo 1 h antes de EGF (10 mg /ml) para inhibir la síntesis de proteínas novela. Las flechas inclinadas y horizontales indican las bandas fosforiladas EGFR e hiper-fosforilados, respectivamente. GAPDH se utilizó como control de carga. C, las puntas de flecha indican la expresión diferencial de ERK1 fosforilados /2 y en WT MEFs GAK-KD. D, NT, no tratada. E, la inmunotinción de la proteína EGFR en WT (+ /+) y mutantes (- /-) MEFs tratadas con o sin el inhibidor del proteasoma MG132 (50 mg /ml). paneles notables están rodeadas por líneas de color turquesa y verde. F, el número de células EGFR-positivos en WT y células GAK-kd (Homo) en presencia o ausencia de MG132. Los datos se representan como la media ± SEM de n = 3 experimentos independientes en cada punto de tiempo.
La inmunotinción mostró que los niveles de EGFR en el citoplasma de MEFs KD-GAK fueron inferiores a los de la citoplasma de WT MEFs, lo que sugiere la internalización anormal del EGFR en las células knockout (columna 2 paneles de la Fig. 3E). Se obtuvieron resultados similares cuando el experimento se repitió en presencia de inhibidor del proteasoma MG132, lo que sugiere que la anomalía no se debe a la degradación de proteínas EGFR (columna 4 paneles de la Fig. 3E). Por otra parte, el número de células EGFR-positivos fue menor en MEFs KD-GAK que WT MEFs, y este fenotipo también fue independiente de la inhibición del proteasoma (Fig. 3F). Estos resultados sugieren que constitutiva hiper-fosforilación del EGFR causada por una falta de actividad GAK dificulta la localización correcta del receptor, lo que lleva a la activación reducida de la señalización de crecimiento mediada por EGFR. Los resultados descritos anteriormente son consistentes con un informe reciente que MEFs de ratones knockout condicional GAK y células GAK desmontables preparados usando pequeños ARN de horquilla de presentación alterado el tráfico intracelular de EGFR, se someten a la detención del crecimiento, y han reducido pERK1 /2 señalización [11]. Tomados en conjunto, estos datos sugieren que la falta de actividad GAK perturba correcta activación de vías de señalización mediada por EGFR.
La luteolina y gefitinib inhiben la actividad quinasa de GAK
El gefitinib inhibe GAK, el EGFR, y receptor de interacción con la serina /treonina quinasa
in vitro
[14]. Para determinar si gefitinib inhibe la actividad de GAK directamente, un
in vitro
ensayo de quinasa se realizó con PP2A B'γ, un objetivo conocido de GAK, como sustrato [22]. Gefitinib inhibe GAK autofosforilación y la fosforilación mediada por GAK de PP2A B'γ de una manera dependiente de la dosis, lo que sugiere que el gefitinib inhibe la actividad quinasa GAK directamente (Fig. 4A). Los efectos de otros inhibidores de quinasa, tales como el bien conocido erlotinib inhibidor de EGFR [24] y la p38 y GAK inhibidor SB203580 [25], en la actividad GAK también se examinaron. Ambos de estos compuestos inhibieron la actividad de GAK de manera similar, aunque eran ligeramente menos potente que gefitinib (Fig. 4A).
in vitro
ensayos quinasa también se utilizaron para determinar los efectos de la luteolina (un flavonoide) y el resveratrol (un polifenol) sobre la actividad GAK; estos compuestos inhiben el crecimiento de líneas celulares de cáncer de próstata [20], [26]. Notablemente, 10 mM inhibió la actividad de luteolina GAK drásticamente, mientras que la misma concentración de resveratrol tenía sólo un ligero efecto inhibidor (Fig. 4B). Un análisis más detallado reveló que 2 M de luteolina se requería para inhibir la actividad GAK (Fig. 4C). Estos resultados indican que, además de gefitinib, erlotinib luteolina y son nuevos inhibidores de GAK.
A-C, el análisis de SDS-PAGE representante de las proteínas sometidas a
in vitro
ensayos de quinasa en el uso de
32P-γATP, GAK (~ 100 g /ml) como la enzima, PP2A B'γ (~ 10 g /ml) como sustrato, y las concentraciones indicadas de gefitinib, erlotinib, y SB203580 como inhibidores. Las señales incorporadas fueron detectados por autorradiografía y las cantidades de proteínas cargadas fueron evaluados mediante tinción con azul brillante de Coomassie (CBB). Los gráficos muestran las relaciones de intensidad de fosforilados PP2A B'γ y GAK relación a la de las muestras no tratadas. Los datos se representan como la media ± SEM de n = 3 experimentos independientes para cada concentración.
La coadministración de gefitinib y luteolina causa la muerte de las células PC-3
A continuación, se examinó el efecto de la co-administración de gefitinib y luteolina en el crecimiento de las células PC-3 de cáncer de próstata. Hemos utilizado por primera secuenciación del ADN genómico para examinar la presencia de mutaciones en el gen EGFR en células PC-3 que anteriormente se presentaban con frecuencia para ser albergado por las células de cáncer de pulmón [27]. Como se muestra en la Fig. S3, no se encontraron mutaciones en estos sitios en el genoma de PC-3, lo que sugiere que una baja concentración de gefitinib (~ 1 M) puede no ser eficaz en las células PC-3. De hecho, se requiere una mayor concentración de gefitinib (60 M) para detener el crecimiento de células PC-3. Curiosamente, cuando el número de células proliferantes se contaron después de la exposición de las células a 60 M luteolina, 60 gefitinib mu M, o una combinación de estos medicamentos durante 24, 48, o 72 h, se encontró un efecto inhibitorio acumulativo de gefitinib y luteolina en el crecimiento celular (Fig. 5A). Las células de control se trataron con dimetilsulfóxido (DMSO) solo.