Extracto
Las deficiencias en el gen ATM son la causa subyacente de la ataxia telangiectasia , un síndrome caracterizado por neurológico, motor y defectos inmunológicos, y una predisposición al cáncer. Los microARN (miRNA) son herramientas útiles para elaborar perfiles del cáncer y la predicción de la respuesta terapéutica a los regímenes clínicos. Se investigaron las consecuencias de la deficiencia de cajero automático en la expresión de los genes miARN y la expresión de genes asociados en las células normales humanos epiteliales mamarias (HME-CC). Se identificaron 81 miRNAs significativamente expresadas diferencialmente en ATM con deficiencia de HME-CC mediante secuenciación de ARN pequeño. Muchos de éstos han sido implicados en la tumorigénesis y la proliferación e incluyen miRNAs abajo-regulados supresores de tumores, tales como HSA-mir-29c y hsa-miR-16, así como sobre-expresado miRNAs pro-oncogénicas, tales como HSA-miR 93 y hsa-miR-221. cambios microARN se integraron con los perfiles de expresión de genes en todo el genoma para investigar posibles genes miARN objetivos. mRNA objetivos previstos de los miRNAs regulan de manera significativa después de ATM incluye el agotamiento de muchos genes asociados con la formación y progresión del cáncer, tales como SOCS1 y el MAF proto-oncogén. Aunque se ha informado de una serie de miRNAs como alterado en las células cancerosas, se sabe poco sobre cómo estos pequeños RNAs podrían estar impulsando la formación de cáncer o cómo podrían ser utilizados como biomarcadores de susceptibilidad al cáncer. Este estudio proporciona datos preliminares para la definición de los perfiles de miARN que se pueden utilizar como biomarcadores de pronóstico o predictivos para el cáncer de mama. Nuestro análisis integrado de los genes miARN expresión de ARNm y nos permite obtener una mejor comprensión de la señalización implicada en la predisposición al cáncer de mama y sugiere un mecanismo para el fenotipo propensas al cáncer de mama observado en pacientes con deficiencia de ATM
Visto:. Hesse JE, Liu L, CL Innes, Cui y, Palii SS, RS Paules (2013) de genoma completo de RNA Secuenciación y análisis de expresión génica revela un perfil de microARN de susceptibilidad al cáncer en las células ATM-humano deficiente epiteliales mamarias. PLoS ONE 8 (5): e64779. doi: 10.1371 /journal.pone.0064779
Editor: P. Jin Cheng, H. Lee Moffitt Centro de Cáncer & amp; Research Institute, Estados Unidos de América
Recibido: 12 Diciembre, 2012; Aceptado: April 17, 2013; Publicado: 31 May, 2013
Este es un artículo de acceso abierto, libre de todos los derechos de autor, y puede ser reproducido libremente, distribuir, transmitir, modificar, construir, o de otra forma utilizado por cualquier persona para cualquier propósito legal. El trabajo está disponible bajo la advocación de dominio público Creative Commons CC0
Financiación:. Esta investigación fue apoyada por el Programa Intramural de los Institutos Nacionales de Salud, Instituto Nacional de Ciencias de Salud Ambiental (Z01 ES021157). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
La ataxia telangiectasia mutada (ATM) proteína juega un papel crítico en una amplia gama de respuestas celulares, incluyendo la regulación del ciclo celular, la apoptosis y la respuesta al daño del ADN. Los individuos con deficiencias completas en ATM sufren de la ataxia severa, trastornos inmunológicos, y han elevado riesgo de desarrollar cánceres linfoproliferativos [1]. Además de la pérdida completa de la funcionalidad ATM, se estima que hasta un 1% de la población de Estados Unidos llevan una copia mutada del ATM [2], [3] y están sujetos a las consecuencias de la haploinsuficiencia. Mientras que los portadores heterocigotos no sufren de síndrome de ataxia telangiectasia, tienen un mayor riesgo de desarrollar enfermedades del corazón, diabetes y cáncer, el cáncer de mama en concreto, en comparación con los individuos con niveles de expresión ATM normales [2], [3]. Los estudios epidemiológicos más recientes han demostrado que las mutaciones ATM, que causan la ataxia telangiectasia en el estado homocigoto, también son alelos de susceptibilidad al cáncer de mama en portadores heterocigotos [4], [5], [6], [7], [8], [9 ], [10]. Además, ha sido implicado que el silenciamiento epigenético de ATM a través de la metilación también pueden desempeñar un papel en la susceptibilidad de cáncer de mama [11], [12]. A pesar de esta relación entre los niveles reducidos de cajeros automáticos y el cáncer de mama, las deficiencias en la proteína ATM no se observan con frecuencia en poblaciones con cáncer de mama no familiares [13]. Esta observación sugiere la posibilidad de que las vías de señalización o patrones de expresión de genes que están bajo control ATM podría ser un mecanismo plausible que une estado de expresión ATM a predisposición al cáncer de mama. Aquí proponemos cambios cajero automático que dependen de la regulación epigenética, en particular, la regulación de la expresión génica de los genes miARN, desempeñar un papel en la formación de cáncer de mama.
Los microARN (miARN) son una amplia clase de regulación de ARN pequeños que han sido descrito para modificar la post-transcripcional de la expresión génica. El alto nivel de conservación de secuencias de genes miARN a través de especies hace hincapié en su papel regulador importante. El principal modo de acción para la regulación de los genes miARN de la expresión génica se unen a la región 3'UTR del ARN mensajero (ARNm), que conduce a una disminución en la cantidad de ARNm disponible en la célula, a través de ya sea la degradación del ARN o la prevención de la traducción. MicroARNs desempeñan papeles críticos en el desarrollo, la diferenciación y la progresión de la enfermedad, y se prevé que apuntar más de 60% de los ARNm en los seres humanos [14]. Más recientemente, miRNAs se han utilizado en el diagnóstico, identificación y predicción de las respuestas terapéuticas de cáncer [15], [16], [17], [18], [19], [20]. Perfiles de microARN de diferentes tipos de cáncer se ha utilizado para identificar miRNAs que causan cáncer, denominado oncomiRs, así como miRNAs supresores de tumores [20], [21], [22]. Muchos grupos han generado diferentes perfiles de miARN en células de cáncer de mama con el fin de desarrollar potenciales biomarcadores en el diagnóstico y el tratamiento [23]. Varios miRNAs aparecen en muchos de los genes miARN perfiles de los experimentos como ser desregulado en el cáncer de mama. Sin embargo, la mayoría de estos estudios se llevaron a cabo en las células cancerosas y los tumores. Aquí se investiga el papel de ATM en los niveles de expresión y la composición de miRNAs en células normales no cancerosas humanas epiteliales mamarias (HME-CC). Estamos interesados en la comprensión de cómo los cambios en la expresión de los genes miARN debido a la deficiencia de ATM pueden contribuir a la predisposición al cáncer y provocar alteraciones en las vías fisiológicas normales. Utilizando Illumina Next-Generation Sequencing, se realizó la secuenciación de todo el genoma de ARN pequeños de lo normal de tipo salvaje (WT) y ATM deficientes HME-CC. Además de secuenciación profunda de los pequeños RNAs, se realizó un análisis de expresión de genes del genoma completo utilizando Agilent microarrays de todo el genoma. La combinación de ambos perfiles de expresión génica y miARN nos permitió identificar posibles dianas génicas para miRNAs regulados significativamente. Mediante el conocimiento de la composición y la expresión de miRNAs en células epiteliales mamarias ATM-deficientes esperamos obtener información sobre los mecanismos y la fisiología subyacente a través del cual la formación de tumores de cáncer de mama avanza.
Materiales y Métodos
Cell
cultura y
El HME-CC-LacZ (tipo salvaje) y HME-CC-atm1 (ATM) con deficiencia de líneas de células epiteliales mamarias humanas se obtuvieron como se describe [24]. Las células fueron cultivadas y mantenidas en HuMEC Listo Media (Invitrogen 12752010) con 4 mg /ml blasticidina (Invitrogen 46-1120).
celular de cosecha y extracción de RNA
tipo salvaje y humana ATM-deficientes epiteliales mamarias células en crecimiento logarítmico se recogieron usando 0,25% de tripsina-EDTA (Invitrogen 25200072), que se neutralizó usando TNS (Lonza CC-5002). El ARN total se aisló usando el kit de aislamiento de Ambion mirVana miARN usando el protocolo estándar para el aislamiento de ARN total. A continuación, el ARN total aislado se dividió en alícuotas por lo que se utilizó el mismo ARN de pequeña secuenciación del ARN y para el análisis de la expresión génica.
Illumina Pequeño ARN-secuenciación
triplicado muestras biológicas de ARN total fueron presentado a la NIH intramural Centro de Secuenciación. Las bibliotecas de pequeños ARN de ADNc fueron creados usando el Illumina pequeños ARN de la muestra Protocolo v1.5 Preparación alternativa sólo con pequeñas desviaciones de protocolo del fabricante. Estas bibliotecas de cDNA fueron secuenciados en el Illumina Genoma Analizador IIX con 35 pares de bases se lee de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Cada biblioteca se ha ejecutado en un solo carril en la celda de flujo con 36 ciclos usando la versión 5 Illumina la química. Después de la alineación con el genoma, leen los recuentos se normalizaron cálculo de miRNAs por millón de alineaciones miARN. La lista de miRNAs regulados significativamente fue creado usando un análisis de la prueba t (p = 0.05) y doble cambio (≥1.5) de corte entre las células ATM deficientes en comparación con las células de tipo salvaje.
Agilent Genoma matriz
ARN total aislado se presentó a la instalación de NIEHS microarray Core para el análisis de microarrays. La expresión de genes se realizó utilizando Agilent Plenario del Genoma Humano 4 × 44 múltiplex matrices formato de oligo (Agilent Technologies, 014850) siguiendo el protocolo de análisis de expresión génica basada en microarrays de Agilent 1-color. A partir de 500 ng de ARN total, Cy3 cRNA marcado, se produce de acuerdo con el protocolo del fabricante. Para cada muestra, 1,65 ug de Cy3 marcado ARNc fueron fragmentados y se hibridaron durante 17 horas en un horno de hibridación de rotación. Las láminas fueron lavadas y luego escanea con un escáner de Agilent. Los datos se obtuvieron usando el software de extracción de características de Agilent (v9.5), utilizando los valores por defecto 1-color para todos los parámetros. La característica de Agilent software de extracción realizó el modelado de error, ajustando por el ruido aditivo y multiplicativo. Los datos resultantes fueron procesados y analizados utilizando (software Partek® Genómica Suite, versión 6.6beta, Copyright © 2009, Partek Inc., St. Louis, MO, EE.UU.) Partek Genómica Suite. Se realizó una prueba t entre el tipo salvaje y muestras ATM-deficientes, generando asociado
p-valores
. En combinación con un pliegue del cambio de +/- 1.5, un
se utilizó p-valor de
≤0.05 para generar una lista de genes expresados diferencialmente.
Integración de los microARN y datos de expresión génica
el uso de TargetScan 5.2 [14], [25], [26], una lista de objetivos biológicamente predichos de nuestra expresados diferencialmente se determinó miRNAs. Esa lista de objetivos a continuación, se comparó con nuestra lista de genes expresados diferencialmente para determinar la posible miARN -. Interacciones de ARNm
Funciones de análisis en Ingenio
miRNAs y mRNAs regulados Significativamente se analizaron con Ingenuity Pathway Analysis ( IPA) [25], [26]. Redes y análisis funcionales se generaron sobre la base de los 40 miRNAs significativas y 202 objetivos de genes predichos importantes anotados en IPA. Se utilizó una prueba exacta de Fisher de extremo derecho para calcular un valor de p para determinar la probabilidad de que cada función biológica y /o enfermedad asignado a ese conjunto de datos se debe a la casualidad. Las funciones con un
p-valor
de menos de 0,01 se consideraron significativos.
Acceso a datos
Los datos de microarrays y secuenciación de ARN pequeño utilizado en este estudio han sido archivados en el . Expresión génica Omnibus base de datos (GEO) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)
el número de acceso GEO para la secuenciación del ARN pequeño es GSE36267 y puede ser revisada en http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?token=jxezrakumucekru&acc=GSE36267
.
el número de acceso GEO para la expresión del genoma completo de datos de matriz de Agilent es GSE36082 anuncio puede siendo revisada en las http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?token=jvixzkwsaqiqwps&acc=GSE36082.
Accompanying datos suplementario consiste en 7 mesas que se pueden encontrar en línea.
Resultados
Secuenciación y Análisis de Datos
Illumina secuenciación profunda se utilizó para generar ARN pequeño lee de 3 réplicas biológicas cada uno de tipo salvaje y deficientes ATM-HME-ccs no cancerosas. Filtrado basado en las puntuaciones de calidad y artefactos de secuenciación permitidos para la selección de la única secuencia lee robusta (Figura 1A). Usando el kit de herramientas FastX [27], las secuencias adaptadoras se cortaron a partir del extremo 3 'de la secuencia lee y secuencias con ninguna secuencia de adaptador o con menos de 16 nucleótidos restantes después de la retirada del adaptador fueron excluidos del análisis. Acortado dice estaban alineados utilizando Bowtie [28] para la construcción hg19 genoma humano. Nos permite hacer sin falta de coincidencias en la región de semilla de 15 pb de la secuencia lee y permite un máximo de 3 alineaciones por secuencia leer. Alineaciones se anotan con la pequeña pista genoma UCSC (WgRNA) en hg19. Leer los recuentos se normalizaron mediante el cálculo de las etiquetas por millón de alineaciones miARN (TPM). filtrado de secuencia, el recorte adaptador, y la alineación de Bowtie se realizaron utilizando una combinación de programas de línea de comandos y la web abierta basada plataforma Galaxy [29], [30], [31]. Resumen de las estadísticas de los 6 muestras fueron rastreados para asegurar similitud en la secuencia se ejecuta, alineaciones, y anotaciones (Figure1B).
Una visión general de tuberías de RNA Secuenciación). B) Las estadísticas de resumen de los datos de secuenciación de ARN pequeños en diferentes etapas de análisis de datos.
Composición de los miARN en Wild Type y ATM con deficiencia de células
La siguiente generación de secuenciación profunda permite que un gran rango dinámico en la detección de miRNAs (Tabla S1). Al considerar todas nuestras muestras, se identificaron 390 miRNAs presentes en dos de cada tres muestras en las muestras, ya sea de tipo salvaje o ATM-deficientes con al menos 1 TPM (Figura 1B). Para restringir el análisis a sólo los miRNAs más robustos, hemos considerado sólo miRNAs con al menos 10 TpM en dos de cada tres muestras en las muestras, ya sea de tipo salvaje o ATM-deficientes en su posterior análisis. 259 miRNAs se consideraron presente en todas las muestras y se trasladó a la siguiente etapa de análisis (Tabla S2). etiquetas de secuencias por millón de alineaciones miARN (TPM) se importaron en Partek Genómica Suite para su posterior análisis (software Partek® Genómica Suite, versión 6.6beta, Copyright © 2009 Partek Inc., St. Louis, MO, EE.UU.). Una mirada precursora en los niveles de expresión de los 259 miRNAs destaca el amplio rango dinámico de la expresión detectada por secuenciación de próxima generación de profundidad. Hemos sido capaces de detectar miRNAs con sólo unas pocas transcripciones, así como miRNAs con la expresión robusta, como hsa-miR-21, que tiene un promedio de expresión de WT 113.949 TPM. Una revisión de alto nivel de la miARN perfil preliminar revela efectos específicos del agotamiento de cajero automático en la expresión. Hemos observado no sólo miRNAs quién expresión se vio afectada por la pérdida de ATM, pero también hemos sido capaces de identificar miRNAs que parecen ser afectados por el agotamiento del cajero automático.
Los cambios en los perfiles de expresión de miRNAs después del agotamiento de los cajeros automáticos
Para evaluar la magnitud y la importancia del cambio en la expresión de los genes miARN después del agotamiento de ATM, se realizó una prueba t en 259 miRNAs consideradas presente tanto en el tipo salvaje y muestras ATM-deficientes. Asociados
p-
valores se calcularon y se combinan con un factor de cambio para generar una lista de manera significativa regulados diferencialmente (
p
≤0.05; ≥ 1,5 veces el cambio) miRNAs. Este identificados 81 miRNAs como significativamente expresados diferencialmente entre los dos genotipos HME-CC (Figura 2 y Tabla amp; S3), por tanto, más del 30% de los genes miARN considerado presente en nuestro análisis están significativamente regulados diferencialmente después de la depleción de ATM. Encontramos varios miRNAs bien caracterizados que fueron estadísticamente sin cambios después del agotamiento de los cajeros automáticos, incluyendo la familia let-7 y hsa-miR-21. Entre los 81 miRNAs regulados significativamente, hay 55 miRNAs con niveles más altos de expresión y 26 con los niveles más bajos de expresión en comparación con el tipo salvaje HME-CC. Curiosamente, estos miRNAs regulados incluyen varios que han sido implicados en la formación de cáncer o metástasis. Utilizando la herramienta de TAM para miRNAs anotando [32] y la base de datos de la enfermedad miARN humana [33], se identificaron 4 supresores tumorales miARN reprimidos y 7 sobre-expresados oncomiRs [21], [22], [34] en las células ATM-deficientes (por ejemplo, véase la Figura 3). Esta observación de la desregulación de miRNAs importantes en la formación del cáncer o la supresión sugiere cajero automático que dependen los cambios de expresión de miRNA pueden alterar las vías biológicas y funcionalidades que promueven la formación de cáncer. Sobre la base de cáncer de miARN perfiles de proyectos, varios miRNAs ATM-dependientes merecen un examen más detallado (Figura 3). Por ejemplo, la pérdida de los resultados de ATM en una disminución en la expresión de los miRNAs supresores tumorales, miR 96, que es conocido por objetivo KRAS [35], y la familia de miR-29, que incluye el miR-29b-1, MIR-29b- 2, y miR-29c. Una disminución en la expresión de los tres miembros de la familia miR-29 se ha implicado en muchos tipos de cáncer [36] y tiene una correlación con el pronóstico [37]. Además, la pérdida de ATM se traduce en un aumento de la expresión de miR-10b, que está altamente expresado en cánceres de mama metastásicos [38], [39] y miR-221, que puede inducir la proliferación y supervivencia de células [40]. Con el fin de entender mejor los efectos biológicos de los cambios en la expresión de los genes miARN, se realizó el análisis de la expresión de genes del genoma completo.
La expresión diferencial de los genes miARN entre el tipo silvestre y ATM deficientes HME-CC obtenida a partir de tres repeticiones independientes de cada uno. El
y
eje x muestra el cajero automático con deficiencia al WT ratio de expresión, el
x
eje x muestra el promedio de expresión de cada miARN; ambos ejes están en escala logarítmica. diferencialmente expresado miRNAs de
p-valor
≤0.05 y al menos 1,5 veces el cambio son de color azul. miRNAs significativas representativas están etiquetados. Cada muestra tenía una biblioteca de secuenciación generados por separado y se llevó a cabo en un carril de secuenciación individual.
A) Lista de 4 supresores de tumores conocidos y 8 oncomiRs con los cambios de expresión significativos tras el agotamiento de los cajeros automáticos. B) Los niveles de expresión, las etiquetas por millón (TPM), de cuatro ejemplos de miRNAs desregulados. barras de color gris oscuro representan la expresión de tipo salvaje y las barras claras grises representan la expresión en células ATM-deficientes. Las barras de error son el error estándar de la expresión de 3 repeticiones independientes de cada genotipo.
La expresión de genes previsto para ser miARN objetivos
El uso de los microarrays de todo el genoma humano Agilent, hemos reunido gen los datos de expresión de las mismas muestras HME-CC y el WT-ATM deficiente. Con una combinación de
p-valor
(≤0.05) y doble cambio (≥1.5) puntos de corte, se identificaron 1086 sondas cambiado significativamente en representación de 988 genes o áreas genéticas (Tabla S4). Con el fin de identificar los genes posiblemente dirigidos por los cambios en la expresión de los genes miARN, que utilizó TargetScan 5.2 para predecir mRNA objetivos de los 259 miRNAs regulados significativamente. Hemos limitado los mRNA objetivos previstos, en primer lugar sobre la base de los genes regulados significativamente en nuestro análisis de la expresión génica y la segunda en objetivos ya sea comprobado experimentalmente o altamente predicho por TargetScan. Además, con base en el conocimiento de que miRNAs predominantemente regular la expresión génica a través de una inhibición de la expresión, sólo se conservaron las combinaciones de los genes miARN-mRNA que se correlacionan inversamente, reconociendo podemos estar excluyendo funcionalmente importantes interacciones reguladoras de los ARNm. Comenzando con nuestras 81 miRNAs regulados significativamente, se identificaron 40 que había pronosticado altamente mRNA objetivos con cambios significativos en la expresión de genes asociados. Se identificaron 202 objetivos de mRNA significativamente regulados que se correlacionaron inversamente con los miRNAs predijo dirigirse a ellos (cuadro S5). Muchos de los miRNAs se predice para apuntar varios mRNAs regulados significativamente y muchos de los mRNAs son potencialmente blanco de los miRNA más de un ATM-dependiente. Estos fenómenos podrían sugerir la redundancia funcional en la regulación de los genes miARN de los genes diana.
El uso conjunto de genes de enriquecimiento de análisis (GSEA) [41], que determina las familias de genes representados por los genes predichos pueden ser objetivo de miRNAs en un cajero automático -dependiente (Figura 4A). Este enfoque proporciona una visión funcional de los genes en nuestra lista utilizando la base de datos de firmas moleculares [41]. Las familias de genes comparten características comunes, tales como la actividad bioquímica y la homología. Curiosamente, muchos de los genes objetivo previsto de los miRNAs son regulados significativamente los factores de transcripción (que se muestran en la Tabla S6), lo que sugiere que muchos de los miRNAs ATM-dependientes pueden controlar una gran respuesta fenotípica basado en la regulación de la expresión del factor de transcripción. La participación de la regulación de los genes miARN de factores de transcripción se ha predicho y modelado en varios tipos diferentes de cáncer [42], [43], [44]. Nuestros resultados muestran cambios en miRNAs, así como la alteración de la expresión del factor de transcripción que se está produciendo después de la pérdida de la ATM. Además, nuestros resultados sugieren que esta alteración de los factores de transcripción puede estar ocurriendo antes de que las células se hacen malignas (Tabla S6). Por ejemplo, aumento de la expresión de factores de transcripción oncogénicos tales como MAF y CEBPA indican miRNAs pueden regular grandes redes de genes implicados en la formación de cáncer. Por otra parte, 6 oncogenes y un supresor tumoral conocida, SOCS1, se prevé que sean los genes miARN objetivos. Esto es consistente con informes previos que sugieren miRNAs pueden desempeñar un papel crítico en la formación y la progresión en el cáncer. La comprensión de los efectos tempranos de miRNAs en la regulación de factores de transcripción y la formación de cáncer puede conducir a la comprensión de los tratamientos preventivos y de pronóstico.
A) Las familias de genes que representan a los 202 genes regulados significativamente determinados mediante GSEA para dar una visión general funcional de los tipos de genes afectados por los cambios en la expresión de los genes miARN. B) Funciones Top análisis de cajero automático que dependen miRNAs correlacionados y los posibles objetivos de mRNA de IPA. grupos funcionales seleccionados significativas sólo se representan. La línea discontinua indica un
p-valor
de 0,01.
Camino /Análisis funcional de los objetivos previsto
Con el fin de obtener información adicional sobre las funciones biológicas y las redes se ven afectadas por los cambios ATM-dependientes en la expresión de los genes miARN, se utilizó el análisis Ingenuity Pathway (IPA) [45]. Análisis funcional y análisis de red a través de la generación de IPA nos permite examinar todas las posibles funciones de miRNAs y cambiado de manera significativa sus objetivos de genes predichos por la minería de la Knowledge Base IPA para identificar la conectividad y las relaciones entre nuestros genes y miRNAs de interés. Cinco redes se vieron afectados significativamente después de la depleción de ATM, incluyendo las funciones celulares de la morfología, ciclo celular, el crecimiento celular y la proliferación. Al menos 76 grandes grupos funciones fueron significativamente (P & lt; 0,01) afectados después del agotamiento de ATM, con varios cáncer y tumor funciones específicas están muy afectados (Figura 4B). La función biológica afectada significativamente más era cáncer (
p
& lt; 1 × 1010), con otras funciones afectadas significativamente incluyendo la morfología del tumor, el daño y reparación del ADN, y la muerte celular. (Tabla S7 muestra genes representativos de varios de estos grupos funcionales). La desregulación de estas funciones biológicas en las células no cancerosas sugiere la pérdida de ATM, con cambios asociados en los niveles de expresión de los genes miARN, pueden predisponer o conducir las primeras etapas de la formación del cáncer.
Discusión
a través de la secuenciación profunda de todo el genoma, hemos obtenido información sobre prácticamente todos los pequeños ARN presentes en tanto de tipo salvaje y las células mamarias humanas normales ATM-deficientes epiteliales, no sólo aquellos que son altamente expresado. Se identificaron 259 miRNAs expresadas robusta presentes en tanto de tipo salvaje y las células mamarias humanas normales ATM-deficientes epiteliales. Mientras ATM ha sido implicado en la biogénesis de miRNAs después de daño en el DNA [46], una investigación completa del efecto del agotamiento del ATM en HME-CCs revela que el agotamiento de sí mismo ATM tiene tanto la esperada baja regulación de miRNAs, así como una número significativo de miRNAs hasta reguladas. Sólo un tercio de los miRNAs regulados significativamente haber disminución de la expresión después de la depleción de ATM. Sobre la base de la presencia de miRNAs regulados hasta el agotamiento siguientes ATM, se especula que el papel de cajero automático en efectuar la expresión de los genes miARN no se limita a los genes miARN la biogénesis y podría estar ocurriendo a través de múltiples mecanismos. Además, la pérdida de ATM se ha asociado con un mayor nivel de estrés oxidativo [47], [48]. Especulamos el mayor nivel de estrés oxidativo provocado por la pérdida constitutiva de ATM puede tener un efecto sobre los niveles de expresión de muchos miRNAs. El agotamiento o pérdida, de la ATM pueden estar impulsando cambios en la expresión de los genes miARN a través del aumento del estrés oxidativo. Varios miRNAs que podían tener una expresión alterada después del agotamiento de los cajeros automáticos también se han demostrado ser regulado por el estrés oxidativo elevada, tal como HSA-mir-200c [49]. Se necesitan estudios adicionales para determinar si las especies reactivas de oxígeno carroñeros pueden mitigar los cambios miARN o cambios fenotípicos observados con el agotamiento o pérdida de la ATM.
Cuando se comparó la expresión de los genes miARN entre el tipo salvaje y deficientes ATM HME- CC descubrimos que los miRNAs des-regulados después del agotamiento de ATM muestran una correlación inusualmente alta con miRNAs implicados en el cáncer. De los 81 miRNAs regulados significativamente, el agotamiento de los cajeros automáticos condujo a la represión de 4 conocidos supresores de tumores miARN y la sobre-expresión de 7 oncomiRs conocidos. Esta observación inicial sugiere un medio por el cual la pérdida de ATM podría predisponer a las células de cáncer o aumentar la susceptibilidad al cáncer.
Para investigar más a fondo el papel de los miRNAs en las células ATM-deficientes, se combinaron los miARN significativamente reguladas y los datos de expresión génica para predecir y evaluar las posibles combinaciones de destino miARN-mRNA. Aproximadamente la mitad de los miRNAs regulados significativamente había predicho objetivos que también son regulados diferencialmente, como se ha visto en nuestro análisis de la expresión génica. Cuando investigamos más a fondo estas miARN y posibles objetivos destacamos evidencia adicional de un perfil de susceptibilidad al cáncer en las células epiteliales mamarias humanas ATM-deficientes. Esto incluye el aumento de la regulación de los oncogenes y MAF CEPBA, así como la regulación disminuida de la supresor de tumores SOCS1
.
La comprensión de los perfiles de miARN en todo el genoma de las células epiteliales mamarias no cancerosas normales y ATM con deficiencia puede ayudarnos obtener una mejor comprensión de las funciones de cajero automático y miRNAs en el proceso tumoral en el cáncer de mama y la transición de no canceroso de tejido mamario maligno
.
de particular interés es la posibilidad de utilizar los niveles de expresión de los genes miARN para predecir la susceptibilidad al cáncer o la formación antes de que pueda ser detectada por los métodos de diagnóstico convencionales. Las células en nuestro estudio son células epiteliales mamarias humanas normales que no se derivan de las células cancerosas. Por lo tanto, el aumento de expresión de oncomiRs y la represión de algunos miRNAs supresores de tumores en células ATM-deficientes sugieren que puede ser posible desarrollar biomarcadores para la predisposición al cáncer de mama. La utilización de perfiles de biomarcadores miARN consistentes con predisposición al cáncer de mama podría permitir la identificación temprana de los pacientes que están en riesgo y tal vez conducen a principios de monitorización, detección y tratamiento.
Conclusión
En conclusión, 81 miRNAs con expresión cajero automático que dependen han sido identificados. Estos miRNAs, junto con sus objetivos de mRNA putativo, sugieren que pueden desempeñar un papel en las primeras etapas de transición de células normales a células epiteliales mamarias cancerosas. Este estudio proporciona los datos preliminares que sugieren que la combinación de micro ARN y la expresión de mRNA puede ser de valor para el desarrollo de un biomarcador para predecir la predisposición al cáncer de mama. Mediante la identificación de las células y los pacientes con un mayor riesgo de formación de cáncer de mama, se pueden hacer recomendaciones que implica la supervisión y la intervención temprana.
Apoyo a la Información sobre Table S1.
secuencia de cuenta para todos los 939 miRNAs anotados. Etiquetas por millón recuento (TPM) secuencia para todas las 939 microARNs anotados en la pista hg19 WgRNA de la UCSC Genome Browser
doi: 10.1371. /Journal.pone.0064779.s001 gratis (PDF) sobre Table S2.
secuencia de cuenta para 259 miRNAs presentes. cuenta de secuencia de los 259 miRNAs considerado como presente (por encima del 10 TPM), ya sea en 2 de cada 3 repeticiones de tipo salvaje o 2 de cada 3 repeticiones ATM deficientes
doi:. 10.1371 /journal.pone.0064779.s002 gratis ( PDF) sobre Table S3.
81 miRNAs ATM-dependiente. 81 microRNAs determinado a tener un cambio significativo en la expresión en las células ATM deficientes en comparación con los controles de tipo salvaje. T-test
p
≤0.05; Doblar el Cambio +/- 1,5 o mayor
doi:. 10.1371 /journal.pone.0064779.s003 gratis (PDF) sobre Table S4.
1086 ARNm ATM-dependiente. 1086 sondas de ARNm determinado que tienen significativos los cambios de expresión en células ATM-deficientes en comparación con células de control de tipo salvaje. T-test
p
≤0.05; Doblar el Cambio +/- 1,5 o mayor
doi:. 10.1371 /journal.pone.0064779.s004 gratis (PDF) sobre Table S5.
40 y 202 miARN objetivos de mRNA. Lista de los 40 miRNAs regulados significativamente con una correlación negativa predijo mRNA objetivos y el ARNm 202 predijo objetivos con cambios significativos en la expresión génica. La dirección del cambio (aumento o disminución) de las células ATM-deficientes en comparación con las células WT está indicado tanto para los miRNAs (columna 2) y los objetivos de genes (ARNm) (columna 4) guía doi:. 10.1371 /revista .pone.0064779.s005 gratis (PDF) sobre Table S6. Los posibles factores de transcripción
objetivo. Los factores de transcripción identificados como posibles objetivos de miRNAs regulados significativamente utilizando la base de datos de firmas moleculares de GSEA
doi:. 10.1371 /journal.pone.0064779.s006 gratis (PDF) sobre Table S7.
genes representativos de las categorías funcionales específicas. Los ejemplos de genes diana implicados en el cáncer, la regulación del ciclo celular y la replicación del ADN, la recombinación y reparación basan en Ingenuity Pathway Analysis
doi:. 10.1371 /journal.pone.0064779.s007 gratis (PDF)
Agradecimientos
los autores desean reconocer el NIEHS Microarray Core y los NIH Intramural de Secuenciación del Core por su trabajo en este manuscrito. Además, los autores desean el agradecimiento Dres. Paul Wade y Douglas Bell por sus útiles sugerencias y evaluación crítica del manuscrito.