Extracto
Antecedentes
E
sophageal de células escamosas el carcinoma (CECA) es altamente prevalente en china y otros países asiáticos, como una de las principales causas de la mortalidad relacionada con el cáncer. CECA muestra anomalías cromosómicas complejas, incluyendo múltiples aberraciones estructurales y numéricas. Las anomalías cromosómicas, como amplificaciones y deleciones homocigóticas recurrentes, contribuyen directamente a la tumorigénesis mediante la alteración de la expresión de oncogenes clave y genes supresores de tumores.
Metodología /resultados principio
T
o comprender el papel de las alteraciones genéticas en CECA patogénesis e identificar objetivos críticos de amplificación /deleción, se realizó un análisis comparativo gama de 1 Mb de todo el genoma de hibridación genómica (aCGH) por 10 líneas celulares de uso común CECA. ganancias cromosómicas recurrentes fueron detectados con frecuencia en 3q26-27, 5p15-14, 8p12, 8p22-24, 11q13, 13q21-31, 18p11 y 20q11-13, con pérdidas frecuentes también se encuentran en 8p23-22, 11q22, 14q32 y 18q11-23 . Ganancia de 11q13.3-13.4 fue la alteración más frecuente en CECA. Dentro de esta región,
CCND1
oncogén fue identificado con el alto nivel de amplificación y sobreexpresión en CECA, mientras que
FGF19
y
SHANK2
fue también notablemente sobreexpresado. Por otra parte, una alta concordancia (91,5%) de la amplificación de genes y la sobreexpresión de la proteína de
CCND1
se observó en los tumores primarios CECA.
CCND1
amplificación /sobreexpresión también se correlacionó significativamente con la metástasis en los ganglios linfáticos de la CECA.
Conclusión
Estos hallazgos sugieren que el aumento de genómica de 11q13 es el principal mecanismo que contribuye a la amplificación. oncogenes novedosos identificados dentro del amplicón 11q13 incluyendo
FGF19
y
SHANK2
pueden desempeñar un papel importante en CECA tumorigénesis
Visto:. Ying J, L Shan, Li J, L Zhong , Xue L, Zhao H, et al. (2012) Selección de genoma completo de alteraciones genéticas en el cáncer de esófago por aCGH Identifica 11q13 amplificación oncogenes asociados con metástasis nodal. PLoS ONE 7 (6): e39797. doi: 10.1371 /journal.pone.0039797
Editor: Masaru Katoh, Centro Nacional del Cáncer, Japón
Recibido: 6 Octubre 2011; Aceptado: 30-may de 2012; Publicado: 25 Junio 2012
Derechos de Autor © 2012 Ying et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado por becas de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (# 30801344, 30928012 #) y el Programa Nova Pekín (núm 2009A70). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer esofágico es una de las neoplasias más agresivas originada en el tracto gastrointestinal, y se ubica como la sexta causa principal de muerte por cáncer en el mundo [1]. Su incidencia varía mucho entre las diferentes regiones del mundo, con China como una zona de alto riesgo. En algunos distritos del norte y el centro de China, su incidencia es superior a 100 casos /por 100.000 por año [2]. Histológicamente, el cáncer de esófago se clasifica como el adenocarcinoma de esófago y carcinoma esofágico de células escamosas (CECA). La mayor parte de los casos reportados en los Estados Unidos son los adenocarcinomas de esófago, sin embargo en China y otros países asiáticos, la CECA es el tipo predominante que representa aproximadamente el 90% de todos los casos. A pesar de los avances en las terapias multimodales, la CECA sigue siendo un grave problema de la atención del cáncer en muchos países con tasas de supervivencia a 5 años muy bajos (& lt; 30%) [3]. Por lo tanto, es de gran valor clínico para buscar biomarcadores sensibles y específicos para la detección temprana y el pronóstico de esta patología, así como nuevas dianas terapéuticas
.
amplificaciones genómicas y deleciones contribuyen a la tumorogénesis humana mediante la alteración de la expresión niveles de oncogenes críticos y genes supresores de tumores (ETG). A pesar de su alta prevalencia, la CECA no se ha estudiado tan intensamente como su contraparte adenocarcinoma. Los esfuerzos se han puesto para identificar alteraciones del número de copias brutos de ambas líneas celulares y tumores CECA, incluyendo el cariotipo, fluorescencia
In situ
hibridación (FISH), la hibridación genómica comparativa convencional (CGH) y la pérdida de heterocigosidad (LOH) analiza . De acuerdo con los datos disponibles publicados por ahora, las amplificaciones cromosómicas más comúnmente citados en la CECA se 3T, 4T, 5p, 8p, 7q, 9Q, 10q21, 11q13-q22, 18p11.3, 20q y 22qtel [4] - [12]. Amplificaciones albergar oncogenes, por ejemplo, 11q13 (
CCND1
,
EMS1
), 3q26 (
EIF5A2
), 21q22 (
ETS2
), 8q24
(MYC)
, se han observado consistentemente en más de un estudios [4] - [12]. las pérdidas cromosómicas implican de forma recurrente 3p, 5q, 9p, 13q, 18q y 21q, en el que los genes, como
FHIT
,
APC
,
RB1
y
CDKN2A objetivo
están situados [4] - [12]. En los últimos años, a base de gama alta resolución CGH (aCGH) se ha aplicado para identificar los oncogenes diana y ETG través de la definición de las ganancias y pérdidas recurrentes en varios tipos de cáncer. Hasta hace poco, dos estudios realizados aCGH análisis sobre muestras primarias CECA, revelando recurrentes, amplificaciones de alto nivel en 3q27.1, 7p11, 8q21.11, 8q24.21, 11q13.3, 11q22, 12q15-q21.1, 18q11.2 y 19q13.11-q13.12 y deleciones homocigóticas en 4q34.3-q35.1 y 9p21.3 [13]; [14]. Sin embargo, en comparación con líneas celulares "puros" CECA, las muestras CECA primarios contienen gran cantidad de células normales que pueden afectar los resultados aCGH de diferentes maneras. Aunque se ha informado de varios estudios exhaustivos sobre todo el genoma líneas celulares CECA, las líneas celulares utilizadas son originados principalmente de la CECA japonesa (serie TE) y el Sur de África CECA pacientes, respectivamente [15] - [17]. Perfilado de múltiples líneas celulares CECA se originó a partir de diferentes zonas de alto riesgo en Asia a través de aCGH no sólo permitirá la identificación de cambios cromosómicas recurrentes en CECA de Asia, sino también proporcionar información valiosa para futuros estudios que utilizan estas líneas de células como modelos CECA.
En este estudio, hemos perfilado 10 líneas celulares CECA comúnmente utilizados procedían de china continental (CE 1, EC18 y EC109), china Hong Kong (HKESC1, HKESC2, HKESC3 y SLMT1) y japonés (KYSE70, KYSE410 y KYSE520) de los pacientes para de todo el genoma del número de copias de ADN alteraciones usando análisis aCGH. Entre las alteraciones identificadas, la amplificación de 11q13 es la ganancia más frecuente observado, la acogida
FGF19
,
SHANK2
y
CCND1
. Hemos encontrado además que
CCND1
expresión se upregulated con frecuencia en los tumores primarios CECA, y la amplificación del ADN contribuye a su sobreexpresión, que se correlaciona con metástasis en los ganglios linfáticos de los tumores primarios CECA.
Resultados
perfiles genómicos de CECA Cell Lines de 1 Mb aCGH
Diez líneas celulares CECA se analizaron utilizando 1-Mb aCGH (array clon Sanger 3040-BAC /PAC). relaciones de intensidad de señal para cada BAC se procesaron y se muestran como log2 parcelas utilizando el software SeeGH [18]. La Figura 1 muestra la representación karyograms SeeGH de una línea celular de la CECA (EC18) analizados, lo que demuestra la identificación de diversos ganancias y pérdidas. Otros karyograms SeeGH de líneas celulares CECA analizados se muestran en la Figura S1. La Figura 2 resume las regiones recurrentemente alterados (con log2 ratios más que 1 o menos de -1). En general, las ganancias cromosómicas fueron detectados con mayor frecuencia que las pérdidas. Las alteraciones más frecuentes incluyen la ganancia de 11q13 (70%) y la pérdida completa de 18q11-23 (50%). Otras ganancias que se producen en tres o más líneas celulares son 3q26-27 (40%), 5p15-14 (50%), 8p12 (30%), 8p22-24 (30%), 13q21-31 (30%), 18p11 ( 30%) y 20q11-13 (40%). Otras pérdidas que se producen en tres o más líneas celulares son 8p23-22 (40%), 11q22 (30%) y 14q32 (30%) (Fig. 2).
ratios de intensidad de señal log2 normalizados se representaron usando SeeGH software. Una relación señal log2 de 0 representa el número de copias equivalente entre la muestra y el ADN de referencia (detalles en Materiales y Métodos). patrón cytoband para cada cromosoma se muestra en la izquierda. Las líneas verticales indican las proporciones de señal log2 de -2 a +2, con el aumento de número de copias en el derecho y la disminución en la izquierda. Cada punto azul oscuro representa un único clon BAC.
Las anomalías se muestran con frecuencia ≥20% en 10 líneas celulares CECA. * Las regiones con anormalidades en líneas celulares ≥50% se muestran en negrita.
La amplificación y sobreexpresión de genes en 11q13 CECA líneas celulares
Entre las regiones identificadas con alteraciones recurrentes, la amplificación de 11q13 0,3 a 13,4 es la ganancia más frecuente en CECA (Fig. 3A), especialmente en aquellas líneas celulares derivadas de pacientes chinos (6/7 líneas celulares, 85%). Varios genes con potencial oncogénico funciones se han identificado en este locus, incluyendo
CCND1
y
CTTN
. Por lo tanto, 11q13 se procedió a investigar para la confirmación de las ganancias y la identificación de los genes amplificados, por dúplex de ADN genómico por PCR en 10 líneas celulares CECA.
CCND1
se asigna al centro del amplicón 11q13, y la amplificación de alto nivel
CCND1
se confirmó en 6/10 líneas celulares (Fig. 3B, C), mientras que
CTTN
exhibió el segundo más alto nivel de amplificación (5/10 en líneas celulares).
, aCGH perfiles de seis líneas celulares CECA en el
CCND1
locus. Se representaron proporciones de señal log2 normalizados. Las amplificaciones se define como la intensidad de señal log2 ≥1. Las líneas horizontales indican las proporciones de señal log2 desde -1 a 3 con el aumento de número de copia hacia arriba. Cada punto negro /colorido representa un único clon BAC. También se muestran los nombres de los clones BAC relacionados. mapa Transcripción del amplicón 11q13 núcleo se muestra en la parte inferior.
B Opiniones, dúplex de ADN genómico análisis de PCR semi-cuantitativa de
CCND1
en 10 líneas celulares CECA y 3 muestras normales PBMC. relaciones de intensidad de señal de
CCND1
/
GAPDH
se muestran.
C
, Resumen del número de copias de genes cambios en varios genes dentro del amplicón 11q13. Los números mostrados en la tabla son pliegues de número de copias de las líneas celulares de la CECA relativos a los valores medios de tres muestras de PBMC. CMSP, periférica de células mononucleares de sangre.
Varios genes en torno a
CCND1
en 11q13 fueron examinados por semi-cuantitativos RT-PCR en líneas celulares CECA. Los resultados mostraron que
FGF19
y
SHANK2
también se sobreexpresa notablemente en líneas celulares CECA, mientras que sólo se expresa débilmente o no en el esófago normal o inmortalizado las células normales (Fig. 4), aunque no la amplificación obvio de
SHANK2
se detectó en estas líneas celulares.
FGF3 gratis (datos no mostrados) y
4
, básicamente, no se expresaron en cualquier línea celular CECA o el esófago normal. La sobreexpresión de
CCND1
y
CTTN
también se observó en la mayoría de las líneas celulares CECA, en comparación con el esófago normal, aunque se expresan generalmente en el esófago normal y inmortalizan las células (Fig. 4). Tomados en conjunto, estos datos confirman que es la amplificación de 11q13 más frecuente en CECA y delineados varios genes, incluyendo
CCND1
,
CTTN
,
FGF19
y
SHANK2,
oncogenes como potenciales críticos afectados.
el estado de amplificación de 11q13 región por aCGH y
CCND1 fotos: por PCR multiplex de ADN se enumeran en la parte inferior. +, Amplificada; -, No amplificado. 23x, 25x, 30x: ciclos de RT-PCR. Todos los otros genes fueron examinados por RT-PCR con 30 ciclos, con
GAPDH Opiniones de sólo 23 ciclos.
La sobreexpresión del gen CCND1 en CECA primaria y su Asociación Clinicopathological
La expresión de la proteína del gen CCND1 se procedió a investigar por inmunohistoquímica en microarrays de tejidos CECA (TMA) de 171 CECA primaria y márgenes quirúrgicos histológicos tejidos normales adyacentes esofágicas. Los casos con & gt; 10% de las células tumorales que muestran tinción positiva nuclear se anotó para la sobreexpresión del gen CCND1. Noventa y cuatro de los 171 casos (55%) mostraron sobreexpresión del gen CCND1, incluyendo 42 casos de grado 1 +, 35 casos de grado 2 + y 17 casos de grado 3+ (Fig. 5A). En contraste, sólo dispersos se encontraron células positivas en las células basales del epitelio esofágico normal.
.
Un
,
Los paneles superiores
, la tinción inmunohistoquímica para
CCND1
.
izquierda, positividad dispersa de
CCND1
, especialmente en la capa basal, que se ve en el epitelio esofágico normal (aumento original, × 200).
Medio
, un caso de la CECA es negativo para
CCND1
expresión (ampliación original, × 200).
derecho, difusa y fuerte tinción nuclear para
CCND1
en este caso de la CECA (ampliación original, x200).
Los paneles inferiores
, análisis FISH. Señales verdes se refieren a hacer referencia a la sonda de chr 11 centrómero mientras que las señales rojas son sonda diana para
CCND1
.
, sin amplificar en el epitelio normal del esófago,
Medio
, un caso sin amplificar la CECA izquierda.
derecho, un caso CECA amplificado.
B Opiniones. Los resultados de
CCND1
niveles de amplificación y expresión en 94 CECA primaria incluido en parafina.
A continuación, probamos la correlación entre la sobreexpresión del gen CCND1 y las características clínico-patológicas, incluyendo el tamaño del tumor, grado, los ganglios linfáticos metástasis, y la edad del paciente. la sobreexpresión del gen CCND1 se asoció significativamente con metástasis en los ganglios linfáticos (
p
= 0,006) (Tabla 1), pero no con PT, grado o edad del paciente (
p Hotel & gt; 0,05, respectivamente). En los casos con sobreexpresión del gen CCND1, no hubo una diferencia significativa con respecto a la metástasis de los ganglios linfáticos, entre los grupos de alta expresión CCND1 (grado 2+ y 3+) y el grupo de baja expresión (grado 1 +) (
p
= 0,37).
la sobreexpresión del gen CCND1 Como resultado de amplificación génica pero no activado β-catenina señalización
Para confirmar la amplificación del gen de
CCND1
en CECA primaria e investigar la asociación con su sobreexpresión, se aplicó hibridación in situ fluorescente (FISH) con el análisis comercial
CCND1
sonda junto con CEP 11 sonda en 94 casos.
CCND1
se amplificó en 50 casos (53,2%) y no amplificado en 44 casos (46,8%) (Fig. 5B). Por otra parte, la amplificación génica mediante FISH y la sobreexpresión de la proteína mediante técnicas de inmunohistoquímica para
CCND1
mostró 91,5% (
κ
= 0,69) concordancia.
Por inmunohistoquímica, la tinción nuclear de β-catenina fue positiva en solo 4/94 casos (4,3%). Todos los casos positivos β-catenina fueron negativos para CCND1 mediante técnicas de inmunohistoquímica.
Discusión
CECA es el sexto cáncer más mortales en todo el mundo y representa el 90% de todos los casos de cáncer de esófago en China [19]. Aunque la incidencia de la CECA es baja en los países occidentales, este tumor es común en Asia, especialmente en algunas regiones de China como la provincia de Henan y la ciudad de Shantou [20]; [21]. Al igual que otros tipos de cáncer, los factores ambientales y genéticos contribuyen a la patogénesis CECA. Tabaco, alcohol, bebida /comida caliente, deficiencia en la dieta y la acalasia se han considerado como los principales factores de riesgo ambiental para la CECA, según lo revelado por estudios epidemiológicos [21]; [22]. Mientras tanto, los análisis genéticos moleculares y citogenéticas demostraron múltiples anomalías genéticas en la CECA, incluidas las pérdidas y ganancias cromosómicas. La elucidación de estas aberraciones conducirá a una mejor comprensión de la patogénesis CECA, y desarrollar terapias y biomarcadores para la predicción de metástasis y el pronóstico. En este estudio, hemos llevado a cabo una investigación exhaustiva de las alteraciones genómicas en CECA por CGH basada en matrices de alta resolución, para delimitar las regiones cromosómicas mínimas de amplificaciones y deleciones. Los resultados proporcionan imágenes detalladas de múltiples lesiones genéticas en el genoma CECA, y también dan consejos para su posterior identificación de oncogenes críticos y ETG en esta neoplasia
De acuerdo con resultados anteriores [4] -. [14], ganancias recurrentes, incluidos 11q13 (
CCND1
,
EMS1
), 3q26 (
EIF5A2
), 21q22 (
ETS2
) y 8q24
(MYC)
, y las pérdidas incluyendo 3p, 5q, 9p, 13q, 18q y 21q con genes diana tales como
FHIT
,
APC
,
RB1
y
CDKN2A
, fueron identificados en las líneas celulares CECA en este estudio. Entre amplicones detectados, 11q13.3-13.4 es la región cromosómica más amplificado con frecuencia. Dos genes,
CCND1
y
CTTN
situado en esta región, se identificaron con amplificaciones de alto nivel en múltiples líneas celulares CECA. Si bien investigado en el ARNm, hemos encontrado varios genes, incluyendo
CCND1 CTTN, FGF19
y
SHANK2
, se sobreexpresa frecuentemente en líneas celulares CECA. Recientemente, informó Sawey et al que
CCND1
y
FGF19
eran dos oncogenes de conducción en el carcinoma hepatocelular [23]. En este estudio, nos centramos en
CCND1
. Nuestro estudio confirmó la amplificación frecuente (53,2%) y la proteína concordantes sobre-expresión (51.1%) de
CCND1
en CECA primaria. Por otra parte, una correlación positiva entre la
se observó amplificación del gen CCND1
/sobreexpresión y metástasis en los ganglios linfáticos en CECA, lo que indica que
CCND1
puede servir como un marcador pronóstico para la CECA, en línea con otros estudios ([ ,,,0],24] - [27] Además de la amplificación, CCND1 sobreexpresión puede ser impulsado por la regulación transcripcional, tales como la vía de señalización Wnt Beta-catenina es un miembro clave de la vía de señalización Wnt, que se ha sugerido que participan en la iniciación del cáncer de esófago.. y la progresión [28]. en este estudio, sólo el 4,3% (4 de 94) de CECA casos fueron identificados con beta-catenina expresión nuclear. los resultados indican que la ganancia genómico de 11q13 en CECA es el mecanismo primario que resulta en
CCND1
amplificación y sobreexpresión. Este mecanismo también ha sido reportado en otros tipos de tumores como el carcinoma de cabeza y cuello [29], tumores de la hipófisis [30], y el cáncer de mama [31].
CTTN es una actina asociada a la proteína de andamiaje, se une y activa complejo proteína relacionada con actina (Arp2 /3) y de este modo regula las redes de actina ramificados en la formación de actina cortical estructuras dinámicas asociadas.
CCND1
y
CTTN ¿Cuáles son frecuentemente co-amplificado en cáncer [32] - [34]. Anteriormente,
CTTN
ha sido identificado como un
de buena fe
oncogén situado en 11q13 implicados en la carcinogénesis CECA, contribuyen a la metástasis de diversas Caners incluyendo la CECA, de mama, hepatocelular, y la cabeza y el cuello escamoso carcinomas de células [32] - [34]. FGF19, un factor de crecimiento de fibroblastos, junto con CCND1, se informó recientemente a un importante oncogén conductor en el carcinoma hepatocelular [23]. La participación de FGF19 y otros nuevos oncogenes identificados en CECA patogénesis y los mecanismos de moléculas relacionadas necesita de mayor investigación.
Entre otras ganancias cromosómicas frecuentes, 3q26-27 es una novela amplicón detectado en CECA. oncogenes conocidos que residen en esta región incluyen
EVI1
,
EIF5A2
y
PIK3CA
, que hayan sido comunicadas a exponer posibles funciones oncogénicas. Además,
TRIO
y
CTNND2 Restaurant at 5p,
MYC
en 8q22,
KLF5
y
POU4F1
en 13q y
NKX2.2 Restaurant at 20p también se considera que juegan un papel oncogénico en otros tumores [35]; [36] y podría contribuir a la CECA la carcinogénesis. Regiones de supresiones alta que contengan conocidos o también se detectaron ETG candidatos, incluyendo 18q11-23 que contiene
SMAD2, SMAD4
y
DCC gratis (CE 1, EC109, HKESC3, SLMT1 y KYSE70), 8p22 que contiene
DLC1 gratis (CE 1, KYSE70, 410 y 520) y una región en 14q32 contiene
Dlk1
y
MEG3 gratis (CE 1, EC109 y KYSE70). Otras eliminaciones de alto nivel que contienen ETG candidatos incluyen 4q21.23-21.3 (
MAPK10
,
PTPN13
y
ARGAP24
), 7p21.2 (
DGKB
), 7q35 (
CNTNAP2
), 8q11 (
CEBPD
), 10p11 (
Pard3
), 13q31.1 (
SPRY2
) y 16q22 -23 (
ATBF1
). La mayoría de estas regiones suprimidas de la CECA también han sido reportados en uno o más de otros tipos de cáncer [37]; [38]. Es importante destacar que las interrupciones /epigenéticos o genéticos alterados los niveles de expresión de algunos candidatos TSG mencionados anteriormente, incluyendo
SMAD2
,
SMAD4
,
DCC
,
DLC1 Opiniones y
Pard3, España se han reportado en los tumores CECA y líneas celulares, lo que indica que estudio aCGH el uso de múltiples líneas celulares de tumor podría facilitar la identificación de los genes del cáncer críticos en tumores humanos. [39] - [42].
En conclusión, se detectaron múltiples regiones mínimas de deleciones y amplicones en 10 líneas celulares ESCC comúnmente utilizados en este estudio, y varios nuevos oncogenes ubicados en la región más amplificado con frecuencia 11q13, incluyendo
FGF19
,
SHANK2
y
CCND1
, han sido identificados. Este estudio proporciona datos cruciales para su posterior identificación y caracterización de oncogenes críticos y ETG involucrados en CECA patogénesis.
Materiales y Métodos
Líneas Celulares
Diez líneas celulares CECA (CE 1, EC18, EC109, HKESC1, HKESC2, HKESC3 y SLMT1 son de pacientes chinos, mientras KYSE70, KYSE410 y KYSE520 son de pacientes japoneses) y tres líneas inmortalizadas normales de esófago de células epiteliales (Het-1A, NE1 y NE3) fueron utilizados en el estudio [ ,,,0],43]. Las líneas celulares se mantuvieron en RPMI-1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA) suplementado con 10% de suero bovino fetal (Hyclone, Logan, UT), cultivadas en 5% de CO
2 a 37 ° C.
Las muestras tumorales
se obtuvieron un total de 171 (FFPE) muestras fijadas en formalina embebidos en parafina chinos CECA (de 2007 a 2008) y los márgenes quirúrgicos histológicos tejidos adyacentes normales del esófago, después de consentimiento informado por escrito de los pacientes que reciben e institucional Junta de Revisión de la aprobación (IRB) del hospital del cáncer, Academia china de Ciencias médicas, Beijing, china. Todos los pacientes habían sido tratados previamente (es decir, sin la quimioterapia o la radioterapia), con tumores primarios resecables. La edad media de los pacientes fue de 58 años (rango 33-78), y la razón hombre-mujer era 4.2: 1 (138: 33). Hematoxilina y eosina (HE) secciones teñidas se revisaron para confirmar el diagnóstico y definir las zonas tumorales. El estadio tumoral (pT) y grado se define de acuerdo a la actual clasificación de la OMS de los tumores.
Array CGH Análisis
cromosómica alto peso molecular se aisló el ADN de líneas celulares usando el kit Qiagen (Qiagen , Hilgen, Alemania). La pureza y el peso molecular de DNA fueron examinados en geles de agarosa. 1-Mb de resolución de matrices de todo el genoma con 3040 BAC /PAC clones fueron proporcionados por Sanger Institute, Reino Unido (http://www.sanger.ac.uk/Projects/Microarrays/) [44]. Clones detalles se enumeran en Ensembl (http://www.ensembl.org/Homo_sapiens/index.html)
Array-CGH se llevó a cabo con ligeras modificaciones [43] - [45].. Brevemente, el ADN de la muestra (600 ng) se marcó con Cy5-dCTP (Amersham Pharmacia), mientras que de referencia de ADN de las células mononucleares de sangre periférica normal (PBMC) de donantes chinos sanos con Cy3-dCTP usando el CGH Genomic Sistema de etiquetado BioPrime Array (Invitrogen, Carlsbad, CA). Los nucleótidos no incorporados se eliminaron utilizando el Módulo de Purificación suministrado en el sistema de etiquetado. muestras marcadas y el ADN normal (50 l cada uno) se mezclaron y se precipitaron con etanol junto con 67,5 l de humano Cot-1 DNA (Invitrogen). A continuación, la mezcla de ADN se resuspendieron en 30 l de tampón de hibridación, desnaturalizado y prehibridado en una cámara de humedad en el interior de un horno de hibridación a 5 rpm durante 2 horas a 37 ° C. La mezcla de prehibridación se preparó como sigue: 80 l de ADN de esperma de arenque se precipitaron (10 mg /ml, Sigma) y 67,5 l de humano Cot-1 DNA (Invitrogen), se resuspendieron en 120 l de tampón de hibridación y se desnaturalizó durante 10 min a 72 ° C. Después de la prehibridación, se añadió la sonda prehybridized sobre el portaobjetos, y se incubó a 5 rpm durante 48 horas a 37 ° C. Las láminas fueron lavadas y se lavó tres veces, y se almacena a 4 ° C se seca al aire.
Hibridizada diapositivas fueron escaneados utilizando un escáner Axon 4000B (Axon Instruments Inc, Union City, CA) y se analizaron con la imagen de la GenePixPro 4.0 software de análisis donde se definen los puntos y se calcularon las intensidades de fluorescencia media. Las intensidades de fluorescencia de fondo sustraído se importaron en una plantilla de hoja de cálculo de Microsoft Excel de diseño personalizado. Un punto en particular se excluyó a las dos manchas tienen una diferencia de & gt; 10%. Los valores medios de los puntos duplicados se presentan en la salida gráfica en forma de media log2 ratio (Cy5 /Cy3) en contra de la distancia a lo largo de cada cromosoma individuo (Mb). el número de copias cambios cromosómicos se anotó como la pérdida hemizygous si la relación se log2 que van desde -0.2 -0.7 a la, y la eliminación homocigótica si & gt; -0.7, o ganancia genómica para log2 ratio de 0,2 a 0,5, y la amplificación si & gt; 0,5. número de copias cambios observados en los cromosomas sexuales fueron excluidos del análisis.
Multiplex PCR genómico
La PCR múltiple permite una evaluación semicuantitativa de la amplificación de ADN /pérdida.
GAPDH
gen fue seleccionado como un control interno. Estamos amplificado
CCND1
y el control interno de forma simultánea. Para
CCND1
, un par de cebadores (directo: 5 '-tgctgcgaagtggaaaccat e inversa: 5'-caacaagttgcagggaagtc) generado un producto de PCR de 227 pb. Para
GAPDH
, un par de cebadores (directo: 5 '-gcctcactccttttgcagac e inversa: 5'-gatgaccttgcccacagcct) generado un producto de PCR de 157 pb. Las reacciones de PCR se realizaron en un volumen final de 20 l que contenía 200 mM de desoxinucleótido trifosfatos, MgCl 2,5 mM
2, 50 ng de ADN, 0,5 mM cada oligonucleótido y 0,5 GOLD U AmpliTaq (Applied Biosystems, Foster City, CA). Las condiciones de reacción fueron como sigue: una desnaturalización inicial a 95 ° C durante 10 min seguido de 30 ciclos de 95 ° C durante 30 s, 60 ° C durante 30 s, 72 ° C durante 30 s y una extensión final a 72 ° C durante 10 minutos. Los productos de PCR se separaron en geles de agarosa al 2% y se visualizaron. Todas las reacciones se llevaron a cabo al menos dos veces en experimentos independientes.
semi-cuantitativa con transcripción inversa PCR
El ARN total se extrajeron de los sedimentos celulares utilizando el reactivo TRI (Molecular Research Centre, Cincinnati, OH). La transcripción inversa PCR (RT-PCR) se realizó como se describe [43], utilizando
GAPDH
como control. Los cebadores para todos los genes se pueden proporcionar a petición. El programa de PCR utilizado una desnaturalización inicial a 95 ° C durante 10 min, seguido de 30 ciclos de reacción (94 ° C durante 30 s, 55 ° C durante 30 s y 72 ° C durante 30 s) (o 23, 25 ciclos de CCND1), con una extensión final a 72 ° C durante 10 minutos.
CECA Tissue microarrays (TMA)
en cada caso, tanto en tejidos tumorales y normales se duplicaron con un diámetro de 1 mm en un portaobjetos de vidrio. Se observó antes de la adquisición de muestras, HE-manchado diapositivas FFPE de cada caso bajo un microscopio y se rodeó las ubicaciones de la morfología típica característica de la CECA y de los tejidos circundantes normales. Se tomaron muestras de los lugares encerrados en un círculo en el bloque de parafina utilizando el Beecher Instrumentos de tejidos Arrayer (Silver Springs, MD). Para cada bloque, dos núcleos de 1 mm fueron perforados desde las regiones con un círculo en el bloque donante y dispuestos en el bloque receptor para asegurar la representación de las muestras, y evitar la información que falta debido a una pérdida de núcleos de tejido. Un total de 171 especímenes CECA, 54 muestras de mucosa normal correspondientes fueron dispuestos en dos bloques receptores. secciones de microarrays de tejidos (4 M) se cortaron 24 h antes de la inmunohistoquímica.
Automated Inmunohistoquímica
La inmunohistoquímica se realizó con una Ventana Benchmark XT de tinción automática (Ventana, Tucson, EE.UU.), usando anti-conejo monoclonal CCND1 humana /ciclina D1 (SP4 clon) y el ratón monoclonal β-catenina anti-humano (clon β-catenina-1) de DAKO (Glostrup, Dinamarca) con los kits Ventana Ultraview (Ventana, Tucson, EE.UU.). Las láminas fueron incubadas durante 24 minutos a 37 ° C con anticuerpos primarios. se utilizó diaminobencidina o 3-amino-9-etilcarbazol como cromógenos y los portaobjetos se contratiñeron con hematoxilina antes del montaje. Ambos cromógenos utilizados en las secciones regulares completos antes de la prueba TMA dieron resultados concordantes tanto en términos de superficies e intensidades de inmunotinción. Los controles negativos fueron creados por omisión del anticuerpo primario y sustitución con solución salina tamponada con fosfato (PBS)
.
Los niveles de expresión y CCND1 β-catenina se determinaron semi-cuantitativamente usando un sistema de puntuación de cuatro niveles, basado en el positivo fracción nuclear tinción de las células tumorales (grado 0 = 0-10%; grado 1+ = 11-25%; grado 2 + = 26-50%; grado 3+ = 51-100%). Una puntuación de 0 se considera negativo, mientras que una puntuación de 1+, 2+ o 3+ se consideró positiva. Para β-catenina, la tinción en el citoplasma puede haber estado presente, pero no se incluye en la determinación de la positividad.
Hibridación Fluorescente In Situ (FISH)
Para el análisis FISH de
CCND1
amplificación de genes, se utilizaron dos sondas directas marcado, Vysis
CCND1
/CEP11 FISH sonda Kit que incluye LSI
CCND1 gratis (11q13) SpectrumOrange contra
CCND1 gratis (11q13) y CEP11 SpectrumGreen (Vysis /Abbott, IL, EE.UU.) contra el centrómero del cromosoma 11. FISH análisis se realizó de acuerdo a "LSI Locus sondas de ADN específicas de identificación" de Vysis. El
CCND1
gen en el cromosoma 11 centrómero relación se midió en al menos 60 núcleos de las células tumorales y fue tomada una puntuación media. Observando más de dos copias de
CCND1 Opiniones de cada cromosoma 11 se considera que es una señal positiva para los
CCND1
amplificación de genes.
Análisis estadístico
Estadística El análisis se realizó con el programa SPSS versión 12.0. La asociación entre el pescado y los resultados de IHC y las variables clínico-patológicas se realizó a través de χ
2-prueba. Para todas las pruebas, un
p-valor de
& lt; 0,05 se consideró estadísticamente significativa
Apoyo a la Información
Figura S1..
perfiles Todo el genoma de 10 líneas celulares CECA por 1 Mb aCGH. relaciones de intensidad de señal log2 normalizados se representaron usando el software SeeGH. Una relación señal log2 de 0 representa el número de copias equivalente entre la muestra y el ADN de referencia (detalles en Materiales y Métodos). cytoband patrón para cada cromosoma está a la izquierda de cada parcela. Las líneas verticales indican las proporciones de señal log2 -2-2 con el número de copias aumenta hacia la derecha y disminuye hacia la izquierda. Cada punto negro representa un único clon BAC
doi:. 10.1371 /journal.pone.0039797.s001 gratis (TIF)
Reconocimientos
agradecen a la Dra Tzer Jing Seng para el ayuda de CGH-array, Profs Gopesh Srivastava y George Tsao (Universidad de Hong Kong) para algunas líneas de células del epitelio normal del esófago CECA y, y DSMZ (Colección alemana de microorganismos & amp; cultivos celulares). para líneas celulares KYSE (Shimada et al, El cáncer 69: 277-284, 1992)
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