Extracto
glyoxalase I (GLO1), una enzima de desintoxicación metilglioxal, está implicada en la progresión de tumores malignos humanos. El papel de GLO1 en el desarrollo de cáncer gástrico o la progresión Actualmente no está claro. La expresión de GLO1 se determinó en muestras de cáncer gástrico primarios que utilizan la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa, inmunohistoquímica (IHC), y análisis Western Blot. expresión GLO1 fue mayor en tejidos de cáncer gástrico, en comparación con la de los tejidos no cancerosos adyacentes. La expresión elevada de GLO1 se asoció significativamente con la invasión gástrica pared, metástasis en los ganglios linfáticos, y el estadio patológico, lo que sugiere un nuevo papel en el desarrollo de GLO1 cáncer gástrico y la progresión. La tasa de supervivencia a 5 años de los grupos de expresión GLO1 inferiores fue significativamente mayor que la de los grupos más altos de expresión (log rank
P = 0,0373
) en experimentos de IHC. La sobreexpresión de la GLO1 en líneas celulares de cáncer gástrico aumenta la proliferación celular, la migración y la invasión. Por el contrario, la baja regulación de GLO1 con shRNA dio lugar a una marcada reducción de las capacidades de migración e invasión. Nuestros datos sugieren fuertemente que la alta expresión de GLO1 en el cáncer gástrico mejora la capacidad de metástasis de tumor de células
in vitro
y
in vivo
, y apoyan su eficacia como un marcador potencial para la detección y pronóstico del cáncer gástrico
Visto:. Cheng WL, Tsai MM, Tsai CY, Huang YH, Chen CY, Chi HC, et al. (2012) glyoxalase-I es una novela pronóstico factor asociado con el cáncer gástrico progresión. PLoS ONE 7 (3): e34352. doi: 10.1371 /journal.pone.0034352
Editor: DunFa Peng, Vanderbilt University Medical Center, Estados Unidos de América
Recibido: 8 de Diciembre, 2011; Aceptado: 27 Febrero 2012; Publicado: 29 Marzo 2012
Derechos de Autor © 2012 Cheng et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por becas de la Universidad Chang Gung-, Taoyuan, Taiwán (NMRPD 150311, NMRPD170441-42, CMRPG 640042-43, 670291-93 CMRPG) y el Consejo Nacional de Ciencia de la República de China (NSC 95-2314-B-182 -027, 97-2314-B-182-009-MY2 99-2.314-B-182-022). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer gástrico es la cuarta forma de cáncer más común y la segunda causa de muerte por cáncer en todo el mundo [1]. La malignidad es la sexta causa principal de muerte por cáncer en Taiwán [2]. detección apropiado puede facilitar la detección de cáncer gástrico antes de desarrollo de los síntomas en una etapa curable [3]. Determinación de los perfiles de expresión de las moléculas clave en las varias vías que participan en la progresión del cáncer gástrico puede ayudar en el diagnóstico, el pronóstico y la predicción de la progresión del tumor
.
invasión tumoral y la metástasis son pasos esenciales en la determinación del fenotipo agresivo de los cánceres humanos y constituyen las principales causas de muerte relacionada con el cáncer [4]. De alta expresión de los factores relacionados con la migración, tales como la ciclooxigenasa 2 (COX-2) [5], factor de crecimiento vascular endotelial (VEGF) [6], quimioquinas CXC ligando (CXCL) -8 [7], de quimiocinas (CXC motivo) receptor (CXCR) -2, y CXCL-1 [8], se asocian con la progresión del cáncer gástrico. Varias vías oncogénicas potenciales (/proliferación de células madre, el NF-kB, y Wnt /β-catenina) están desreguladas en la mayoría de los cánceres gástricos [9]. Por lo tanto, una aclaración adicional de los eventos moleculares exactos que conducen a la progresión del cáncer gástrico y la identificación de marcadores de diagnóstico o pronóstico valiosas y nuevas estrategias terapéuticas podrían ser de valor clínico significativo.
glyoxalase I (también denominado GLO1) es un componente esencial en las vías que conducen a la desintoxicación de metilglioxal (MG), uno de los productos secundarios de la glucólisis [10], [11], [12]. expresión GLO1 se incrementa en varios cánceres humanos de colon, mama, próstata y melanoma [13], [14], [15], [16], [17]. Estudios recientes han informado de que la sobre expresión de GLO1 se asocia con la progresión del cáncer y la resistencia a fármacos [17]. De nuestros datos anteriores, se observó GLO1 upregulation en especímenes de cáncer gástrico utilizando cDNA microarray [18]. Sin embargo, el papel específico de GLO1 durante la tumorigénesis gástrico y su significado clínico aún no se han establecido.
Nuestros experimentos muestran claramente que GLO1 es frecuentemente sobreexpresado en el cáncer gástrico y asociada con la metástasis del cáncer. En particular, la expresión de GLO1 es significativamente mayor en los estadios avanzados de cáncer gástrico. Además, las alteraciones de la expresión de GLO1 en líneas celulares de cáncer gástrico afecta a las capacidades de migración celular y la invasión.
Materiales y Métodos
Ética Declaración
El protocolo de estudio fue aprobado por el médico Comité de ética y humano de Ensayos clínicos del hospital Memorial Chang Gung (IRB NO. 95-0472B). escrito el consentimiento informado se obtuvo de todos los pacientes
Los sujetos
Los 114 pacientes (64 varones y 50 mujeres; media de edad, 66 años, rango 28-86 años). diagnosticadas con cáncer gástrico en el Memorial hospital Chang Gung 2000-2005 se inscribieron en este estudio. Todos los pacientes recibieron cirugía para el cáncer gástrico primario sin quimioterapia o radioterapia previa. Cada paciente fue sometido a resección gástrica (35 pacientes fueron sometidos a una gastrectomía total y el 79 gastrectomía parcial).
estudios Clinicopathological
especímenes resecados se examinaron patológicamente utilizando los criterios de las Normas Generales para el estudio japonés cáncer gástrico [19] y el Comité americano Conjunto sobre el cáncer (AJCC) sistema (pTNM) de clasificación [20]. parámetros clínico incluyen la edad del paciente y el género, la ubicación y el tamaño del tumor, el tipo de tumor macroscópico (de Borrmann), invasión de la pared, el margen de resección, el tipo histológico, metástasis en los ganglios linfáticos, invasión vascular, invasión linfática y la invasión perineural. Después del alta, todos los pacientes tenían visitas periódicas de seguimiento en la consulta externa del Hospital Memorial Chang Gung hasta la muerte o el comienzo de la preparación de este artículo.
reacción de transcripción inversa cuantitativa en cadena de la polimerasa en tiempo real (qRT-PCR )
QRT-PCR se realizó como se describe en un informe anterior [21]. Se utilizaron los siguientes cebadores: humana
GLO1
QRT-PCR (cebador directo, 5'-TGAGGATAAAAATGACATCCCTA- AAGA-3 'y el cebador inverso, 5'-TGTGTCAGCTCAAGTGTAGCTTTC-3'), 18S rRNA humanos QRT-PCR (cebador directo, 5'-CGAGCCGCCTGGATACC-3 'y el cebador inverso, 5'-CCTCAGTT CCGAAAACCAACAA-3').
Producción de anticuerpo anti-GLO1
El ADNc que codifica larga duración
GLO1
se clonó en pGEX-4T1. Los lisados de
E. coli cepa BL21
se purificaron con perlas de glutatión-agarosa (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Las proteínas solubles se purificaron usando cromatografía con perlas de glutatión-agarosa, de acuerdo con las instrucciones del fabricante, emulsionados con el adyuvante, y se utilizaron para inmunizar conejos. Los anticuerpos policlonales se produjeron y purificaron por afinidad, como se describe anteriormente [22]. La especificidad de GLO1 de la casa fue validada utilizando Western blot (Figura S1).
El análisis por inmunotransferencia
lisados de células enteras, extractos nucleares y medios condicionales se prepararon a partir de tejido humano o GLO1 estables líneas celulares de derribo. Western Blot se realizó utilizando anticuerpos monoclonales contra HIF-1α humana (Abcam, San Francisco, CA), p65 (Epitomic, Burlingame, CA), o p50 (Millipore, Billerica, MA) o anticuerpos policlonales contra GLO1 humana (en la empresa, dilución, 1:500), CXCL1 (PeproTech Inc., Rocky Hill, NJ), CXCL8 (I + amp;.. D Systems Inc, Minneapolis, MN), VEGF (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA):
la inmunohistoquímica (IHC)
fijados en formalina y tejidos embebidos en parafina fueron examinados con IHC usando el anticuerpo policlonal contra GLO1 humana de producción propia (dilución, 1:3000) y el complejo avidina-biotina (ABC ), como se describió anteriormente [23], [24]. Las comparaciones se realizaron entre la intensidad de la tinción de las células de carcinoma de epitelio superficial y benigna, que se colocaron en la misma diapositiva. Para el análisis semi-cuantitativo de GLO-1 inmunoreactividad, se utilizó un sistema -scoring Histoscore (H) [25]. En pocas palabras, el grupo negativo consistía en las células de cáncer sin detectable (-) o sólo pequeñas tinción para GLO-1 (1). El grupo positivo consistía en células cancerosas con niveles moderados (2) o altas (+3) de GLO-1 inmunoreactividad. El H-puntuación se calcula y se promedió por dos patólogos independientes, cegados a la puntuación inicial para cada paciente. Los resultados se puntuaron multiplicando el porcentaje de células positivas (P) por la intensidad (I), de acuerdo con la fórmula: H = P × I. Por ejemplo, una sección en la que 10% del tejido tenía una puntuación de tinción de 1, 60% una puntuación de 2, y 30% una puntuación de 3, H = (10 x 1) + (60 x 2) + (30 x 3) = 220.
Establecimiento de GLO1 sobre-expresión en la línea celular SC-M1
se utilizó la línea celular SC-M1 que expresan menor nivel de GLO1. La transfección de
GLO1
ADNc se realizó con el reactivo Lipofectamina (Life Technologies, Grand Island, NY). Después de la incubación durante 24 h, las células se transfirieron a medio que contenía G418 para la selección, y luego se utilizaron en la proliferación, la migración, y ensayos de invasión.
Establecimiento de GLO1 caída en líneas celulares TSGH y AGS
Dos líneas celulares de cáncer gástrico humano, AGS, y TSGH, se emplearon. Los ARN corto horquilla (shRNA) secuencias de orientación
GLO1
(TRCN0000118630 y TRCN0000118631) fueron adquiridos de la Facilidad de interferencia de ARN Core Nacional (Instituto de Biología Molecular de la Academia Sinica, Taiwán). La represión específica de GLO1 se confirmó mediante análisis de transferencia Western.
La proliferación celular ensayo
Las células (1 × 10
4) se cultivaron en una placa de 6 cm a 37 ° C bajo 5 % de CO
2. En cada punto de tiempo, la tasa de crecimiento de las células se determinó por recuento celular. Los resultados se dan como el factor de cambio en relación con cada valor de control.
in vitro
ensayo de la migración y la actividad invasiva
El efecto del agotamiento GLO1 o sobre-expresión de la migración y la actividad invasiva de las líneas celulares de cáncer gástrico se evaluó mediante una rápida
in vitro
ensayo (técnica Transwell), como se describe anteriormente [26].
preparación de ARN y análisis de microarrays
El clon GLO1-silenciado TSGH (KG2) y el clon de células de control (C1) se enjuagaron brevemente con PBS enfriado con hielo y se lisaron en reactivo TRIzol (Invitrogen) para la extracción de RNA. los perfiles de expresión génica entre células KG2 y C1 se analizaron con el GeneChip humano U133A (Affymetrix, Santa Clara, CA) de acuerdo con el protocolo del fabricante [27].
El análisis estadístico
Las expresiones de Glo1 cada subgrupo de parámetros clinicopatholgoical en la Tabla 1 se expresan como media ± desviación estándar (dE) de la puntuación de IHC de los pacientes en este subgrupo. La prueba de Kolmogorov-Smirnov es una prueba no paramétrica para comparar las muestras con una distribución de probabilidad de referencia. En su caso, se aplicó la prueba de Mann-Whitney o la prueba exacta de Fisher para las comparaciones entre los dos grupos, mientras que se utilizó la prueba de chi-cuadrado de Kruskal-Wallis o de Pearson para comparar más de dos grupos. La relación entre los datos obtenidos a partir de los dos exámenes diferentes se analizaron con la prueba de correlación de Spearman. Los pacientes fueron controlados hasta el momento de la preparación del manuscrito o la muerte. resultado de supervivencia específica del cáncer se determina aplicando el método de Kaplan-Meier para todos los pacientes, excepto aquellos que murieron por complicaciones quirúrgicas. Se empleó la prueba de log-rank para comparar el significado pronóstico de las variables individuales en la supervivencia. El modelo de riesgos proporcionales de Cox se utilizó en el análisis multivariante para identificar los predictores independientes de la supervivencia.
P
valores. & Lt; 0,05 se consideró significativo
Resultados
ARNm GLO1 y los niveles de proteína están regulados por incremento en pacientes con cáncer gástrico
Uso de ADNc microarrays, hemos identificado varios genes regulados positivamente a partir de tejidos gástricos, en comparación con los tejidos adyacentes nontumorous [18]. Entre estos genes, nos centramos en
GLO1
como una diana molecular para el cáncer gástrico. Expresión de GLO1 se midió en tejidos de cáncer, y se compara con la de la mucosa gástrica ni tumoral emparejados, utilizando QRT-PCR (n = 89) (Tabla 2) o IHC (n = 114) (Tabla 1). Los datos de los experimentos de QRT-PCR reveló GLO1 sobreexpresión (≥1.5 veces) en 51 (57,3%) de los tejidos de cáncer gástrico, en comparación con los tejidos no cancerosos. La media GLO1 expresión en tejidos tumorales es 2,87 veces más que en los tejidos cancerosos. Nuestros resultados confirmaron un aumento significativo en la expresión GLO1 en los tejidos tumorales (
P = 0,005
, de una sola muestra de prueba de Kolmogorov-Smirnov).
La expresión de proteínas en muestras pareadas GLO1 fue mayor analizaron mediante Western Blot. La Figura 1A presenta expresión GLO1 en ocho pacientes representativos. Igual cantidad de proteínas totales teñidas con azul de Coomassie después de SDS-PAGE se utilizaron como control de carga. Todos los tejidos de cáncer de muestras de cáncer gástrico (G1 a G8) muestran la expresión regulada por incremento GLO1, en comparación con la mucosa adyacente emparejado no canceroso (fig. 1A).
La sobreexpresión de la proteína GLO1 en el carcinoma gástrico. (A) de transferencia de Western que demuestra la presencia de la proteína GLO1 en tejidos de cáncer. proteínas Glo1 se sobreexpresa en la mayoría de los tejidos tumorales (T), en comparación con la mucosa adyacente no canceroso emparejados (N). Todos los tejidos de cáncer de especímenes de cáncer gástrico (G1 a G8) que se muestran regulación al alza de GLO1, en comparación con la mucosa adyacente no canceroso emparejado. Una cantidad equivalente (30 mg) de proteína se cargó para cada muestra y se somete a 12% de SDS-PAGE, seguido de tinción con azul de Coomassie como control de carga. Se utilizó el anticuerpo policlonal de conejo contra GLO1 humana producida de forma interna. (B) Los paneles A, C, E y G representan la mucosa no canceroso, mientras que los paneles B, D, F y H representan los tejidos de cáncer gástrico. La tinción positiva para GLO1 se indica como un color marrón oscuro. se observó expresión GLO1 predominantemente en células de cáncer gástrico y rara vez en las células del estroma. La barra de escala representa 100 micras.
Inmunoticción demuestra proteína GLO1
Para establecer además si la regulación positiva GLO1 se correlaciona con la progresión clínica de cáncer gástrico, se llevó a cabo sobre-expresión en tejidos cancerosos gástricos IHC en tejidos de cáncer gástrico en parafina y fijado emparejado mucosa no canceroso de 114 pacientes. Cuatro pares de casos representativos (a /b, c /d, e /f, y g /h) se muestran en la Figura 1B. datos de IHC para homólogos no cancerosos de la mucosa (a, c, e, y g) y tejidos de cáncer (b, d, f, y h) se compararon en pares. inmunotinción de color marrón oscuro prevaleció sobre todo en las células cancerosas mientras que los niveles de tinción fueron más bajos en las células del estroma o fibroblastos de tejidos de cáncer gástrico. tinción fuerte para GLO1 se observa con frecuencia en las células tumorales gástricas avanzada, en contraste con débil o ninguna tinción en las células epiteliales gástricas normales (Fig. 1B, panel superior). La tinción fue más intensa en las etapas avanzadas de cáncer gástrico [etapa III de la figura. 1B (f, h)], en comparación con las etapas I [fig. 1B (b)] y II [Fig. 1B (d)]. Entre los 114 pacientes analizados, la puntuación media IHC en los tejidos tumorales fue 139,8 ± 62,8, que fue significativamente mayor que la (36.7 ± 40.4) en la mucosa adyacente a juego (n = 87) (
P
& lt; 0,001 , los signos de Wilcoxon test). Además, la comparación de la inmunorreactividad emparejado para GLO1 (n = 87) revelaron que los resultados de IHC tejidos cancerosos fueron más altos que los de las contrapartes no tumorosas en 77 (88,5%) pacientes, igual en tres pacientes (3,4%), y más baja en siete pacientes (8,0%).
expresión GLO1 y correlaciones clínicas
GLO1 expresión en el tejido tumoral no se asoció significativamente con la edad, localización del tumor o el tipo histológico (Tablas 1 y 2). Niveles más altos de GLO1 fueron evidentes en los grupos de T3 /T4 donde la superficie serosa de la pared gástrica fue invadida por el cáncer, en comparación con los que en los grupos T1 /T2, donde no hay invasión fue evidente (
P
= 0,015 para QRT - PCR y
P = 0,001
para IHC; la figura 2A; Tablas 1 y 2).. Expresión de GLO1 se incrementó de manera significativa, con metástasis en los ganglios linfáticos (
P
= 0,001 para QRT-PCR y
P
& lt; 0,001 para IHC; Fig. 2B; Tablas 1 y 2) . mayor expresión fue evidente en los pacientes con invasión linfática (
P = 0,001
y
P = 0,016
para QRT-PCR y IHC, respectivamente; las Tablas 1 y 2) y la invasión perineural (
P
= 0,024 para QRT-PCR, Tabla 2). El aumento de expresión GLO1 no se asoció con invasión vascular o metástasis a distancia, incluyendo la siembra peritoneal o metástasis de hígado, en ambos experimentos QRT-PCR y IHC. Expresión de GLO1 fue significativamente mayor en pacientes con estadios patológicos más avanzados (III /IV) de cáncer gástrico, en comparación con aquellos en las etapas patológicas anteriores (I /II) (
P
= 0,001 y
P Restaurant & lt; 0,001 para QRT-PCR y IHC, respectivamente) (figura 2C;. Las tablas 1 y 2)
(a) diagrama de dispersión de acuerdo con la profundidad de la invasión de la pared (
P
= 0,001, T1 /T2 vs T3 /T4). (B) Diagrama de dispersión de acuerdo con metástasis en los ganglios linfáticos (
P Hotel & lt; 0,001, N0 frente N1-3). plot (C) de la dispersión de acuerdo con el estadio patológico (
P Hotel & lt; 0,001, estadios I /II frente estadios III /IV). Las curvas de supervivencia (D) de Kaplan-Meir de dos grupos de pacientes con cáncer gástrico definidos por un valor de punto de corte de 90 GLO1 expresión, establecidos sobre la base de IHC puntuación. La tasa de supervivencia a 5 años de los grupos de expresión inferiores (n = 24) fue significativamente mejor que la de los grupos de expresión más altos (n = 90; 69,6% vs. 43,3%; log rank
P = 0,0373
) .
resultados de supervivencia
la duración media del período de seguimiento de 52 sobrevivientes fue de 70,4 meses (rango, 28-119 meses). Cuatro pacientes murieron de complicaciones postoperatorias y seis de otras causas. Cincuenta y dos pacientes murieron debido a la progresión del cáncer gástrico. La tasa de supervivencia a cinco años, sumadas, de los 114 pacientes fue de 49,3% después de la gastrectomía. Para determinar la influencia de la expresión GLO1 el resultado de supervivencia, el paciente se dividió en dos grupos, las expresiones más altas y más bajas, de acuerdo con el valor de corte que demostrar una diferencia significativa (log rank
P Hotel & lt; 0,05) en las tasas de supervivencia entre 2 grupos. La mediana (= 140), el cuartil superior (= 180 o 75
percentil), y el cuartil inferior (= 90 ó 25
percentil) de IHC resultados de nuestro paciente se ensayaron inicialmente para determinar los valores de corte. Entre ellos, sólo el cuartil inferior podría mostrar una diferencia significativa en los resultados de supervivencia. Higo. 2D ilustra las curvas de supervivencia acumulada de los pacientes en los grupos Glo1 de expresión más bajos y más altos, divididos de acuerdo con una puntuación de IHC punto de corte de 90. La tasa de supervivencia a 5 años de los grupos de menor expresión Glo1 fue significativamente mayor que la de los grupos más altos de expresión ( 69,6% vs. 43,3%; rango
P = 0,0373
) en experimentos de IHC iniciar la sesión. El análisis univariante reveló una serie de factores pronósticos significativos, incluyendo el estado de la metástasis de los ganglios linfáticos, metástasis a distancia, la diseminación peritoneal, la invasión vascular, invasión linfática, profundidad de la invasión, el estadio patológico, la metástasis del hígado y la invasión perineural, además de Glo1 expresión. Otros parámetros significativos fueron el tipo histológico, tamaño del tumor, y el tipo bruto (Tabla 1). Además, en el análisis multivariado, los factores pronósticos independientes que influyen en la supervivencia de los pacientes incluidos metástasis en ganglios linfáticos (riesgo relativo = 5,954; IC del 95% = 1,183 a 29,977,
P = 0,031
) y metástasis a distancia (riesgo relativo = 2.464, 95% CI = 1,030 a 5,896,
P = 0,043
).
La sobreexpresión de la GLO1 en SC-M1 mejora las actividades de proliferación celular, la migración y la invasión.
Para determinar los efectos de la sobre-expresión de
GLO1 Hoteles en células SC-M1, la proliferación celular, la migración y la invasión actividades fueron ensayadas. Después de dos semanas de la transfección, se estableció la expresión estable de la proteína GLO1. La figura 3A muestra 2,36 veces y 2,29 veces más alta expresión GLO1, respectivamente. La proliferación celular se determinó mediante el recuento de células y se indica como un pliegue del control de hasta cinco días.
GLO1
células expuestas significativamente overexpressing (
P Hotel & lt; 0,01) mayores tasas de proliferación (1.86- o 2,06 veces) que las transfectadas con el vector de control en el día 5 (Figura 3B.). Por otra parte,
GLO1
-overexpressing células que se muestran de forma significativa (
P Hotel & lt; 0,01) mayores tasas de migración (5.53- o 4,57 veces) y capacidades invasivas (3.7- o 3,47 veces) que su homólogos de control (Fig. 3C y D). Imágenes de densidad celular se muestran para dos de control y dos sobre-expresión de las líneas celulares (paneles de la izquierda en las Figs. 3C y D).
Dos SC-M1-Glo1 sobre-expresión clones (OG1 y OG2), y se establecieron dos líneas celulares de control (C1, C2). (A) Expresión de GLO1 se determinó usando análisis de transferencia Western. β-actina se utilizó como control interno. (B) La proliferación celular, (C) de migración, y (d) capacidad de invasión se ensayaron como se describe en "Materiales y Métodos". Los datos se presentan como pliegues de al menos tres experimentos independientes realizados por duplicado. Los cambios veces (B-D), y las diferencias examinadas usando el método de Mann-Whitney para comparar los valores con el control de vectores. **
P
. & Lt; 0,05
Abajo-expresión de GLO1 en TSGH o células AGS reduce las actividades de migración celular y la invasión
Nuestros resultados confirman la alta expresión de GLO1 en el cáncer gástrico avanzado, en comparación con la mucosa gástrica no canceroso. Para determinar si la expresión GLO1 se asocia con la capacidad invasora de las líneas celulares de cáncer gástrico, se evaluaron los efectos del agotamiento GLO1 utilizando horquilla corta (sh) ARN plásmidos en las actividades de invasión de células tumorales o células AGS TSGH. shRNA vectores de expresión que codifican la secuencia antisentido GLO1 se transfectaron en líneas celulares TSGH y AGS que expresan altos niveles de GLO1 endógeno. expresión GLO1 fue reprimida significativamente en sublíneas TSGH-KG1, -KG2 (0.32- y 0,14 veces) y AGS-KS1, -KS2 (0.26- y 0,21 veces), respectivamente, en comparación con la de las células transfectadas con los vectores de control ( C1, C2;. Figs 4A y B). -agotadas las células GLO1 KG1 y KG2 exhibieron significativamente (
P Hotel & lt; 0,05) la tasa de migración (0.16- o 0.044 veces, respectivamente) y capacidades de invasión (0.43- o 0,29 veces, respectivamente) que en el control de vectores Las células transfectadas (Fig. 4C y D). Se obtuvieron resultados similares con células AGS-KS (KS1 y KS2) (Figs. 4E y F). Nuestros resultados sugieren colectivamente que GLO1 regula positivamente las capacidades de migración y la invasión de células de cáncer gástrico.
clones dos clones silenciados-TSGH-GLO1 (KG1 y KG2), dos AGS-silenciados-GLO1 sublíneas (KS1 y KS2) y líneas celulares de control (TSGH-C1 y C2; AGS-C1 y C2) se establecieron. (A, B) Expresión de GLO1 se determinó usando análisis de transferencia Western. β-actina se utilizó como control interno. La migración celular (C, E) y la invasión (D, F) habilidades se ensayaron como se describe en "Materiales y Métodos". Los datos se presentan como pliegues de al menos tres experimentos independientes realizados por duplicado. Los cambios veces (C-F), y las diferencias examinadas usando el método de Mann-Whitney para comparar los valores con el control de vectores. **
P
. & Lt; 0,05
Abajo-expresión de los resultados Glo1 en la reducción de expresión de los genes implicados en las vías asociados a metástasis
Para determinar si la GLO1 proteína afecta a los genes relacionados con metástasis, se comparó la expresión de todo el genoma de KG2 y C1. Se seleccionaron varios genes regulados positivamente (≥1.5 veces) en C1, en comparación con KG2,. MetaCore ™ análisis [28] reveló que las vías moleculares de alto rango alterados en los clones eran KG adhesion_cytokines y vías de adhesión. Las proteínas [tales como las metaloproteinasas de matriz (MMP), CXCL8, CXCL1 y] que participan en estas vías se redujeron regulado en GLO1 silenciamiento. Entre las vías relacionados con las citoquinas, la alta expresión de VEGF, CXCL8, CXCR2, y CXCL1 están asociados con la metástasis del cáncer y la progresión [8], [29]. Anteriormente, Daniel J.
et al.
[30] informaron de que la sobre expresión de GLO1 podría mejorar de células estromales derivadas del factor-1 (SDF-1), CXCR4, y la expresión del VEGF en hipoxia endotelial cultura células progenitoras en los altos de glucosa. Por lo tanto, también se analizó la expresión de VEGF en líneas estables KG.
Hemos validado aún más los patrones de expresión de proteínas en el VEGF o caminos relacionados con las citoquinas a través de Western blot. Los niveles de los genes diana, incluyendo CXCL1, CXCL8, CXCR2, y VEGF, se inhibieron significativamente en líneas celulares estables TSGH-kg (KG1 y KG2), en comparación con los controles transfectados con vector (Fig. 5A). Por otra parte, los niveles de NF-kB y HIF1-α, conocidos factores de transcripción de factores de crecimiento pro-angiogénicos (como CXCL8, CXCL1, y VEGF) [31], se redujeron en los núcleos de líneas celulares estables TSGH-KG , en comparación con células de control (Fig. 5A). MMP2 y MMP9, las enzimas clave para el colágeno de tipo IV degradantes, se cree que desempeñan un papel crítico en la invasión tumoral y la metástasis [32]. En particular, el agotamiento de GLO1 condujo a la supresión marcada de las actividades de MMP2 y MMP9 (Fig. 5B). Nuestros datos indican que GLO1 regula la activación de vías de señalización asociados a metástasis en células de cáncer gástrico. Sobre la base de estos resultados, proponemos que GLO1 media la migración de células de cáncer gástrico y la invasión al menos parcialmente mediada por la activación de CXCL1, CXCL8, y VEGF.
(A) HIF-1α, NF-kB, VEGF, CXCL8 , los niveles de proteína CXCL1, y CXCR2 en células transfectadas con TSGH GLO1 shRNA (KG1 y KG2) y control de shRNA (C1 y C2). El gel se tiñó con azul de Coomassie (CB), que se utilizó como control de carga de los medios condicional. β-actina se utilizó como control interno para los lisados de células totales, y la lamina A /C para las proteínas nucleares. (B) Derribo de GLO1 suprime la activación de MMP-2 y MMP9. Se recogieron los medios condicionados de C1, C2, KG1 y células KG2 y se sometieron a zimografía de gelatina. (C) Secciones de formol-fijos y tejidos embebidos en parafina de tres tejidos de tumores gástricos humanos se immunostained con anticuerpos anti-GLO1 (ayb), anti-CXCL1 (C y D) o anticuerpos anti-CXCR2 (E y F). La coexpresión de GLO1, CXCL1, y las proteínas CXCR2 detectados en los tejidos humanos de cáncer gástrico (b, d, y f). mucosa gástrica no canceroso con la expresión negativa o inferior de GLO1, CXCL1 y proteínas CXCR2 (a, c, y e). La barra de escala representa 200 micras.
IHC muestra coexpresión de GLO1 con proteínas CXCL1 y CXCR2 y su sobre-expresión en tejidos cancerosos gástricos
Los estudios anteriores han informado de que la interacción del receptor de citoquinas y VEGF vías de señalización están asociados a características de malignidad en el cáncer gástrico [8], [33]. Anteriormente, nuestro grupo mostró una asociación significativa de CXCR2 y CXCL1 la sobre expresión (n = 116) con la progresión del cáncer gástrico [8]. Consistentemente, en el análisis IHC, se encontró una correlación significativa positiva exclusivamente entre las puntuaciones de GLO1 y CXCL1 o CXCR2 en los tejidos de cáncer (coeficiente de correlación de Spearman = 0,238 y 0,293;
P = 0,013
y
P
= 0,003, respectivamente). Además, la inmunotinción de secciones consecutivas reveló expresión significativa de proteínas GLO1, CXCL1, y CXCR2 en células epiteliales tumorales [Fig. 5C (b), (d) y (f)], en contraste con no o baja expresión en tejidos no cancerosos [Fig. 5C (a), (c) y (e)].
Discusión
A medida que la segunda causa más frecuente de muerte relacionada con el cáncer, el cáncer gástrico sigue siendo una enfermedad difícil. Los datos de este estudio demostraron que la regulación positiva de GLO1 en tejidos de cáncer gástrico se asocia significativamente con la progresión del tumor y las etapas avanzadas de la enfermedad. Concordantemente, los pacientes con niveles más bajos Glo1 tenían un mejor pronóstico de la enfermedad. Por otra parte, QRT-PCR e IHQ experimentos revelaron una correlación de la expresión aumentada GLO1 con la progresión local del tumor y la invasión de los ganglios linfáticos. Se ha observado una marcada disminución en la metástasis y la invasión de las células habilidades Glo1 deficientes, concomitantes con niveles reducidos de varios factores asociados a metástasis, incluyendo VEGF, CXCL1, CXCL8, MMP, y CXCR2. En el estudio de IHC, se observó una correlación significativa positiva entre GLO1 y patrones de expresión de CXCL1 en las muestras de resección de cáncer gástrico. Por otra parte, elevado GLO1 y CXCL1 concomitante de expresión en pacientes con cáncer gástrico se correlacionaron significativamente con la supervivencia. Nuestros resultados proporcionan pruebas directas de apoyo a la participación de GLO1 en la progresión del cáncer gástrico y la fuerza a través de la alternancia de sus aguas abajo vías de migración y la invasión.
alta expresión de GLO1 se ha relacionado con varios tipos de cáncer [16], [17] . Estudios recientes han sugerido un papel vital de GLO1 en varios tipos de cáncer en la eliminación de metilglioxal (MG), que se considera carcinostático, lo que resulta en el desarrollo de inhibidores de Glo1 como agentes anti-tumorales [34], [35]. Por lo tanto, la alta expresión de GLO1 está implicado en la resistencia de células de cáncer a la apoptosis inducida por agentes anti-tumorales [36]. Sakamoto
et al.
[36] propone que GLO1 no es sólo un tumor, sino también un marcador de resistencia a los medicamentos. Consistentemente, los Glo1 desmontables clones fueron sensibles a varios agentes quimioterapéuticos, tales como camptotecina, etopósido (datos no mostrados). Clínicamente, nuestros resultados indican que GLO1 es altamente expresado en el cáncer gástrico y significativamente asociado con la progresión del tumor y las etapas avanzadas de la enfermedad
.
alteraciones glucolíticas en células de cáncer representan una adaptación metabólica a tumores hipóxicos a través de la acción de hipoxia factor de la transcripción inducida por (HIF-1) [37], [38]. Además, los factores de transcripción, HIF1-alfa y NF-kappa B, juegan un papel crucial en diversos procesos, tales como la inflamación, la destrucción microbiana y la progresión del cáncer [39]. La hipoxia tumoral parece estar fuertemente asociado con la propagación del tumor, la progresión maligna, y la resistencia a la terapia. La vía de HIF-1α está claramente implicado en la carcinogénesis del cáncer gástrico [39]. Además, la expresión inmunohistoquímica de los genes diana HIF-1α (GLUT1, VEGF, CA9, iNOS) está asociada con la progresión de tumor gástrico [40]. Entre las vías oncogénicas, la señalización de NF-kappa B es elevada en una proporción significativa de los cánceres gástricos [9]. Además, varias líneas de evidencia apoyan la diafonía entre las vías de señalización de HIF-1a NF-kappa B y [41]. En nuestros experimentos, los niveles de HIF-1α y NF-kB se redujeron en los núcleos sobre el silenciamiento GLO1 en las líneas celulares de cáncer gástrico, junto con los genes diana (VEGF, CXCL1, CXCL8, MMPs).
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