Extracto
Hemos demostrado anteriormente que la gonadotropina coriónica humana β (hCGβ) migración y la invasión inducida en células de cáncer de próstata humano. Sin embargo, los mecanismos moleculares implicados son claros. Aquí, hemos establecido una línea celular de cáncer de próstata estables que sobreexpresan hCGβ y probamos hCGβ-desencadenó las vías que causan la migración celular y la invasión de señalización. ELISA mostró que la cantidad hCGβ secretada en medio aumentó con el tiempo de cultivo después de que las células transfectadas con hCGβ se incubaron durante 3, 6, 9, 12 y 24 h. Más hCGβ, estándares promovidos MAPK (/2 ERK1) fosforilación y el aumento de MMP-2 expresión y la actividad en ambas maneras dosis y del tiempo depende en hCGβ células no transfectadas. Además, promovió hCGβ ERK1 /2 fosforilación y el aumento de MMP-2 expresión y actividad de manera significativa en hCGβ transfectaron células DU145. Considerando que ERK1 /2 PD98059 bloqueador (25 mM) significativamente downregulated ERK1 fosforilados /2 y MMP-2. En particular, hCGβ promueve la migración celular y la invasión, sin embargo, el PD98059 disminuyó la motilidad celular inducida por hCGβ en esas condiciones. Estos resultados indicaron que hCGβ indujo motilidad celular a través de la promoción de ERK1 /2 fosforilación y MMP-2 upregulation en las células DU145 de cáncer de próstata humanos
Visto:. Li Z, Li C, Du L, Zhou Y, Wu W (2013 ) gonadotropina coriónica humana β induce la migración y la invasión a través de Activación de ERK1 /2 y MMP-2 en células de cáncer de próstata humano DU145. PLoS ONE 8 (2): e54592. doi: 10.1371 /journal.pone.0054592
Editor: V. Salvatore Pizzo, Duke University Medical Center, Estados Unidos de América
Recibido: 11 Junio, 2012; Aceptado 14 de diciembre de 2012; Publicado: 12 de febrero 2013
Derechos de Autor © 2013 Li et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue financiado por el plan de Ciencia y Desarrollo de la Comisión de Educación de Beijing (número de concesión: KM200910025008) y la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (número de concesión: 81272843). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de próstata es uno de los cánceres más comúnmente diagnosticados y la sexta causa principal de muerte en los hombres en el mundo [1]. Actualmente, los principales métodos para el tratamiento del cáncer de próstata son la prostatectomía radical, radioterapia externa, braquiterapia, terapia de privación de andrógenos y la quimioterapia sistémica, etc. [2] - [6]. Sin embargo, la eficacia terapéutica no es satisfactoria. Desarrollo de la nueva terapia como la terapia molecular es necesaria para el tratamiento de cáncer de próstata. Sin embargo, la caracterización de los mecanismos moleculares que causan cáncer de próstata es la base para establecer una nueva terapia. Si determinamos los objetivos terapéuticos moleculares que contribuyen al cáncer de próstata en primer lugar, entonces podemos tratar a los pacientes a través de la orientación esos marcadores tumorales para inhibir el cáncer de próstata, además de mejorar el pronóstico y bajar la mortalidad
.
gonadotropinas coriónicas humanas (HCGs) son glicoproteínas heterodiméricas secretadas por las células trofoblásticas en el embarazo normal. HCGs tienen algunas isoformas que contienen hCG intacta, hCGα, hCGβ, hiperglicosilados (hCGh), muescas (hCGn) y el núcleo fragmento de hCGβ (hCGβcf) [7]. HCGβ es una molécula con función independiente. Se ha demostrado que hCGβ libre es un marcador tumoral potencial producido por una variedad de tumores [8] - [10]. Hemos informado anteriormente de que hCGβ disminución de la expresión de E-cadherina conduce a la migración y la invasión de células de cáncer de próstata [11]. Sin embargo, los mecanismos implicados enteros no están claras.
kinase1 /2 (/2 ERK1) la activación regulada por señal extracelular se ha implicado en la carcinogénesis y la progresión del cáncer. El aumento /2 actividad ERK1 promueve la proliferación de células de cáncer y metástasis en varias líneas celulares de cáncer [12] - [15]. ERK1 /2 bloqueador, PD98059 resultó en una reducción del crecimiento celular y la invasión en el cáncer de próstata. En las células de Leydig MA-10, hCG activa transitoria activación ERK1 /2 a través de la proteína quinasa aguas arriba A (PKA) [12]. Además, hCG también induce la fosforilación de ERK1 2 /de una manera independiente de PKA en el endometrio y está implicado en la carcinogénesis [13], [14]. Además, hay evidencia de que las metaloproteinasas de matriz (MMPs) expresión estaba regulada por ERK1 /2 en los carcinomas invasivos. Los estudios demostraron que ERK1 /2 activada regula la actividad de las MMP extracelulares que conducen a la degradación de la matriz (ECM) y de la motilidad celular [13] - [15]. Muchos MMPs son considerados como proteasas esenciales en la degradación de ECM y remodelación [16]. Informe mostró que hCG estimula la secreción de MMP-2 y MMP-9 en una forma dependiente de la dosis en células citotrofoblásticas [17]. Además, hCG upregulated actividad de MMP-2 y promovió la motilidad celular en SGHPL-5 líneas de células [18]. En el cáncer de próstata humano, el aumento de la actividad de MMP-2 y MMP-9 contribuyó a la invasión tumoral y la metástasis [19] - [21]. Los estudios demostraron que la vitamina D y análogo de la vitamina D ZK191784 downregulated MMPs para inhibir la invasión en el cáncer de próstata [22] - [24]. Sin lugar a dudas, las MMP son los objetivos contra la invasión importantes. Por lo tanto, proponemos que hCGβ podría aumentar ERK1 /2 fosforilación y más regular al alza las MMP para promover la motilidad celular.
Por lo tanto, aquí vamos a investigar hCGβ disparado por las vías y la relación entre la expresión y la motilidad celular hCGβ señalización. A través de este estudio, esperamos que vamos a encontrar nuevas pistas en terapia molecular para tratar el cáncer de próstata.
(A) Análisis cuantitativo de hCGβ ARNm y la transcripción del mRNA β-actina en las células DH y DV mediante PCR en tiempo real . células DU145 transfectadas con el vector vacío;: DV DH: células DU145 transfectadas con cDNA hCGβ constructo. Tenga en cuenta que hCGβ mRNA fue altamente expresado versus control. (B) Análisis de hCGβ expresión de la proteína por transferencia Western. β-actina se utilizó para la igualdad de la carga y la normalización. Los resultados indicaron que hCGβ fue altamente expresado en las células DH. *, Indica
P & lt; 0,05
frente a las células de control DV. Los datos se muestran como medias ± SEM de tres pruebas separadas.
Materiales y Métodos
Materiales
normas
HCGβ fueron adquiridos de Abcam (Hong Kong). El constructo pVSneo-hCGβ contiene hCGβ cDNA se adquirió de Stratagene (La Jolla, CA). Las enzimas de restricción SalI, XhoI, EcoRI, BamHI, HindIII y ADN ligasa de T4, células competentes son los productos de Invitrogen (Carlsbad, CA). G418 y violeta cristal se adquirieron de Sigma (St. Louis, MO). cáncer de próstata humano DU145 y PC3 (a ser una copia de seguridad), las células fueron los productos de la cultura típica estadounidense Collection (Rockville, MD). Las células se cultivaron en medio DMEM (Hyclone) suplementado con 10% de suero fetal bovino (Invitrogen), 100 unidades /ml de penicilina, y 100 mg /ml de estreptomicina a 37 ° C, 95% de aire y 5% de CO
2. placas Transwell con inserciones interiores o las membranas basales artificiales se compraron de BD Biosciences (Bedford, MA). Anti-hCGβ era de Biodesign Internacional (Saco, ME); anti-ERK1 /2, anti-fosfo-ERK1 /2 y anti-MMP-2 fueron adquiridos de Señalización Cell Technology, Inc (Shanghai, China).
La transfección
A través de la transfección, se línea celular estable comprobado que sobreexpresa en las células DU145 hCGβ. El pVSneo-vector de control vectorial se hace cortando hCGβ ADNc mediante enzimas de restricción primero y luego autoligation como se describe anteriormente [11]. Las células se sembraron en placas de seis pocillos con DMEM medio de crecimiento. Cuando las células llegan a 90% de confluencia, las construcciones que contienen el pVSneo-hCGβ o pVSneo-Vector fueron transfectadas en células DU145 siguiente reactivo FuGene HD transfección (Roche, EE.UU.) y las instrucciones del fabricante. Después de que las células se incubaron a 37 ° C durante 48 horas, las células se sometieron a digestión con tripsina-EDTA y se cultivaron en el G418 que contiene medio de selección (1,2 mg /ml). Además, las células se incubaron durante dos semanas más. Las células sin la integración del gen hCGβ estaban muertos y flotando en el medio y las colonias individuales que expresan de forma estable se recogieron hCGβ. Las células seleccionados se cultivaron en medio de selección (600 mg /ml G418) durante dos semanas más hasta que no se encontraron células muertas. Las células seleccionadas se mantuvieron en medio que contiene 600 mg /ml G418 para su posterior ensayo. Hemos tenido éxito en el establecimiento de las líneas celulares estables en el trabajo previo [11]; Aquí hemos utilizado un nuevo reactivo de transfección para mejorar la eficiencia de transfección.
-PCR en tiempo real
Las células fueron cultivadas como los procedimientos de rutina en el medio de cultivo. Luego, el ARN total fue aislado utilizando el reactivo Trizol (Invitrogen, EE.UU.). HCGβ ADNc se realizó utilizando la transcriptasa reversa Kit (Takara, China) con 1,5 g de ARN total siguiendo las instrucciones del fabricante. PCR en tiempo real se realizó en un instrumento Stratagene Mx3000P. De ciclos térmicos en tiempo real, se utilizaron partes alícuotas por triplicado de ADNc en una mezcla de reacción que contiene 250 nM de cada cebador en un volumen de reacción de 25 l por el equipo de reactivos RT PrimeScriptTM (Takara, China). El programa de ciclo de PCR se realizó con un paso inicial predenaturation a 94 ° C durante 60 s, a continuación, con un ciclo de 40 de etapas de amplificación, a 94 ° C durante 30 s, 57 ° C durante 30 s, 72 ° C durante 20 s. Los cebadores fueron los siguientes:
hCGβ (hacia delante): 5'-TCTGTGCCGGCTACTGCCCC-3 ';
hCGβ (inverso): 5'-TTGGGACCCCCGCAGTCAGT-3';
β-actina (hacia delante): 5'-AACTCCATCATGAAGTGTGACG -3 '; .
Β
β-actina (inverso): 5'-GATCCACATCTGCTGGAAGG-3 '
se recogieron y analizaron
Los datos siguiendo las instrucciones del manual del fabricante
ELISA
..
HCGβ es una proteína secretada, que puede interactuar con algunos receptores, tales como receptor de la hormona luteinizante, etc, para jugar un papel en la activación de las vías de señalización. Por lo tanto necesitamos para asegurarse de que hCGβ expresado se secreta en medio celular. Después de que las células DU145 estables fueron cultivadas a 70% con fl uidez en el medio de cultivo, las células se lavaron tres veces con medio DMEM libre de suero. Luego, las células se cultivaron en medio DMEM libre de suero a las 3, 6, 9, 12 y 24 h. El medio se recogió en los puntos de tiempo indicados y el ELISA se realizó para probar secretada hCGβ a través de un kit de β-hCG ELISA (DRG Diagnostics, Nueva Jersey, EE.UU.) siguiendo las instrucciones del fabricante. En el estudio anterior, hemos tenido éxito en la detección de la secreción hCGβ en las células transfectadas hCGβ a través de un kit de detección hCGβ, F-hCGβ ccubind ELISA, desde Monobind (Costa Mesa, CA) [11]. Con el fin de reproducir y confirmar estos resultados, se utilizó un kit de β-hCG ELISA para determinar la secreción hCGβ.
inmunotransferencia
Después de las células DU145 se cultivaron durante el tiempo requerido, se recogieron las células y se lisaron con tampón de lisis (25 mM Tris-HCl pH 7,6, NaCl 150 mM, 1% inhibidores de 0,1% de SDS, desoxicolato de sodio al 1% y la proteasa NP-40,, Thermo Scientific, EE.UU.). El lisado celular se centrifugó a 18.000 g durante 20 min. Las concentraciones totales de proteínas fueron probados por Kit de ensayo de proteínas BCA (Invitrogen). El ochenta microgramos de proteína se cargó en 10% de geles de SDS-PAGE y se ejecuta por el tiempo requerido en función del peso molecular, después se transfirió a membranas de nitrocelulosa a través de la transferencia semi-seco. Las membranas fueron bloqueadas en 1,5% de BSA en tampón TBS-T durante 1 h a temperatura ambiente con agitación suave, a continuación, se incubaron con anticuerpos primarios por separado, a 4 ° C, durante la noche. Después de lavar con TBST 3 x 10 minutos cada uno, las membranas se sondearon con el anticuerpo secundario marcado con fluorescencia (LI-COR Bioscience, Lincoln, NE) durante 1 h a temperatura ambiente. Después de tres lavados, las membranas fueron escaneadas en los 700 o 800 canales utilizando el sistema de infrarrojos Odyssey Imaging (LI-COR Bioscience, Lincoln, NB, EE.UU.). β-actina se utilizó para la igualdad de la carga y la normalización. Los anticuerpos se diluyeron apropiadamente.
Gelatina Zymography
Después se aplicó la PD98059 ERK1 /2 bloqueador (25 M) para el tratamiento de las células DU145 durante 2 h, se cambió el medio DMEM bovino fetal al 10% de suero en medio libre de suero, y se cultivaron durante 24 horas. Medium con hCGβ secretada se recogió de un número igual de células y se mezcló con cantidades iguales de tampón de muestra no reducida. Los volúmenes iguales de medio se sometieron a electroforesis en 10% geles de SDS-poliacrilamida que contiene 1 mg /ml de gelatina como sustrato de la proteasa. El gel se lavó en solución X-100 2,5% de Triton a temperatura ambiente con agitación suave y se empapó en el tampón (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 0,2 M NaCl, mM CaCl 5
2 · 2 H
2O, y 0,02% de Brij-35, pH 7,6) a 37 ° C durante 42 horas. Después de la incubación, el gel se tiñó durante 30 minutos con solución de tinción (0,5% Coomassie Brilliant Blue, 25% de isopropanol, y ácido acético al 10%). A continuación, el gel teñido se destiñó con una solución apropiada de Coomassie R-250 decolorar (50% de metanol, 10% de ácido acético). En el área de metaloproteinasas de la matriz, bandas claras contra un fondo azul oscuro se mostrará. Para mostrar la igualdad de carga, un gel SDS paralelo se llevó a cabo para poner a prueba la MMP-2 y β-actina a través de Western blot.
motilidad celular Ensayos
El cáncer de próstata migración celular se hizo en un 24 pocillos placa con la cámara interior; el fondo de la cámara tiene 8 micras poros. Total 1 × 10
5 células se sembraron en la cámara superior con 500 l de medio libre de suero, y se añadió 1 ml de medio DMEM con suero bovino fetal al 10% en la cámara inferior. Después las células se cultivaron durante 6 horas, las células en la cámara superior se retiraron con un hisopo de algodón. Las células migradas (o pseudópodos) en el fondo de la cámara se fijaron con metanol al 100% durante 10 min a -20 ° C, después se tiñeron con una solución de cristal violeta 0,5% a temperatura ambiente durante 10 min. Después de mover lejos la solución de cristal violeta, las células se enjuagaron con agua destilada hasta que el exceso de tinte no fue visto. Las células o pseudópodos migrado se fotografiaron y se cuentan a partir de 5 áreas seleccionadas al azar; las imágenes fueron fotografiadas con la cámara con un microscopio Leica DM IRB a 200 × magnificación. ensayo de invasión se realizó por la invasión del sistema (8 micras de poro, BD BioCoat) Tumor. La parte inferior del inserto de cultivo celular se recubre con la membrana basal artificial revestido con matrigel. La membrana basal es células epiteliales subyacentes de la matriz extracelular delgadas. Matrigel es un producto comercial extraído de un sarcoma de ratón rico en proteínas de matriz extracelular. El principal componente es la laminina, seguido por el colágeno IV y sulfato de heparina proteoglicanos. Los otros procedimientos son los mismos que en el ensayo de migración.
Análisis estadístico
Los datos se sometieron a análisis de varianza con pruebas posteriores para la comparación entre grupos específicos. Los datos se expresaron como medias ± SEM y se analizaron para la significación estadística mediante análisis de varianza (ANOVA). se utilizaron correcciones de Bonferroni para comparaciones múltiples contra un solo grupo.
P Hotel & lt; 0,05 fue considerado estadísticamente significativo. El número mínimo de experimentos repetitivos era 3.
Resultados
HCGβ Expresión
En primer lugar se construyó un vector de control como se ha descrito anteriormente; a continuación, las células DU145 se transfectaron con construcciones, ya sea con o sin hCGβ cDNA. Después del establecimiento de las líneas celulares estables, las células se mantuvieron en el medio que contiene 600 mg /ml G418 para estudios adicionales. Para probar hCGβ expresión en células DU145 transfectadas, tanto en tiempo real PCR y Western blot se utilizaron para determinar mRNA y expresión de la proteína después de que las células se incubaron durante 24 horas, respectivamente (Figure1A, Figure1B). Estos resultados mostraron que hCGβ fue altamente expresado tanto en ARNm y los niveles de proteína frente a las células transfectadas DU145 (DV) vacía-vector. De cualquier hCGβ ARNm o la cantidad de proteína fue poco en las células de control en estas condiciones experimentales
HCG secreción
ELISA mostró que hCGβ se secreta en medio tremendamente en 24 horas.; la cantidad era de hasta 150 ng /ml (Figura 2). La cantidad de secreción hCGβ se incrementó en un tiempo de incubación. Tenga en cuenta que se estableció una línea celular estable que sobreexpresan hCGβ. HCGβ podría desempeñar un papel importante en la señalización entre las comunicaciones intracelulares y extracelulares.
Los datos mostraron que había hCGβ secreta en medio celular. Además, el nivel de hCGβ secretada en medio aumentó con el tiempo después de que las células transfectadas hCGβ se incubaron durante 3, 6, 9, 12 y 24 h.
HCGβ activado ERK1 /2
normas HCGβ para tratar las células DU145 no transfectadas en dosis de 25, 50, 100 y 200 ng /ml durante 24 h, Western blot mostró que ERK1 /2 expresión se incrementó después de una tendencia dependiente de la dosis, y ERK1 /2 fosforilación llegó a su punto máximo con un tratamiento de 200 ng /ml hCGβ (Figura 3A). En consecuencia, se trataron las células a 0 (CON, control), 5, 15, 30 y 60 min para determinar ERK1 /2 fosforilación. Los resultados mostraron que ERK1 /2 fosforilación siguió una manera dependiente del tiempo y vino a pico a 30 min de tratamiento con 200 ng /ml hCGβ (Figura 3B). Además, ERK1 /2 fosforilación se encontró significativamente mayor en el hCGβ transfectaron células DU145 (DH) que las células de control. Sin embargo, PD98059 (25 mM), un bloqueador específico, impidió ERK1 /2 fosforilación significativamente en comparación con las células no tratadas (Figura 3C). Tenga en cuenta que hCGβ causó la activación de ERK1 /2 siguientes modalidades y dosis-dependientes del tiempo
.
(A) Hemos demostrado que la concentración de 200 ng /ml hCGβ normas celular inducida por la invasión [11]. Por lo tanto, aquí se trataron células no transfectadas DU145 con diferentes dosis de 0, 25, 50, 100, y 200 ng /ml hCGβ por 1 h. Western blot mostró que las normas hCGβ fosforilados ERK1 /2 en una tendencia dependiente de la dosis. A la concentración de 200 ng /ml, ERK1 activación /2 alcanzó el pico. células DU145 transfectadas-no (B) en medio libre de suero se trataron con 200 ng /ml hCGβ de 0, 5, 15, 30 y 60 min. Western blot mostró que hCGβ activa ERK1 /2 de una manera dependiente del tiempo. En el punto de tiempo de 30 minutos, ERK1 /2 fosforilación alcanzó el pico y luego cayó al suelo. (C) Las células se trataron previamente con PD98059 (25 mM) 30 min y después se incubaron durante 24 h en medio libre de suero, Western blot mostró que hCGβ activa ERK1 /2, pero PD98059 disminución de la activación de ERK1 /2. *, Indica
P & lt; 0,05 frente a
DV. Los datos se muestran como medias ± SEM de tres pruebas separadas.
HCGβ inducida por MMP-2 expresión a través de la activación de ERK1 /2
MMP-2 se ha demostrado estar implicado en el cáncer de células la migración y la invasión. Aquí se investigó la expresión inducida por hCGβ MMP-2 en las células DU145 no transfectadas hCGβ. normas HCGβ se añadieron en el medio libre de suero a las dosis de 0 (CON, control), 25, 50, 100 y 200 ng /ml. Western blot mostró que hCGβ aumentó MMP-2 expresión de una manera dependiente de la dosis, MMP-2 expresión se aumentó a pico cuando se trataron con 200 ng /ml hCGβ (Figura 4A). Además, se trataron las células con PD98059 (25 mM), los resultados mostraron que la MMP-2 expresión en células de DH fue notablemente downregulated (Figura 4B), lo que indica que MMP-2 upregulation resultado de ERK1 /2 fosforilación.
(a) Se trataron las células no transfectadas DU145 con 0, 25, 50, 100, y 200 ng /ml hCGβ de 1 h, Western blot indicó que las normas hCGβ upregulated MMP-2 de una manera dependiente de la dosis, a la concentración de 200 ng /ml, MMP-2 expresión alcanzó el pico. (B) células tratadas DH y DV con o sin PD98059 (25 mM) 30 min y después se incubaron durante 24 h con medio libre de suero, Western blot mostró que hCGβ upregulated MMP-2 expresión y PD98059 abolió aquellos aumento. Los tamaños de pro-MMP-2 y MMP-activa-2 son de 72 Kd y 64 Kd, respectivamente. *, Indica
P & lt; 0,05 frente al control
. Los datos se muestran como medias ± SEM de tres pruebas separadas.
HCGβ El aumento de MMP-2 Actividad través de la activación de ERK1 /2
ensayo de gelatina zymography mostró que la actividad de MMP-2 se redujo por PD98059 (25 M) (Figura 5), lo que indica que hCGβ activa MMP-2 a través de ERK1 /2 fosforilación.
Nos recogió el medio condicionado a los tratamientos arriba para el ensayo era geltin zimografía como los métodos. Los resultados mostraron que hCGβ aumento de la actividad de MMP-2 y PD98059 reduce estos efectos. *, Indica
P & lt; 0,05 frente al control
. Los datos se muestran como medias ± SEM de tres pruebas separadas. El panel inferior de gel de imágenes mostró una carga igual que un gel SDS paralelo se llevó a cabo para poner a prueba β-actina a través de Western blot.
HCGβ aumento de la motilidad celular a través de ERK1 /2 fosforilación
en el estudio anterior, hemos demostrado que hCGβ induce la migración celular y la invasión del cáncer de próstata. En el presente estudio se confirmó además cómo las células migratorias y comportamientos invasivos hCGβ inducido. Para saber si hCGβ la motilidad celular inducida por el resultado de ERK1 /2 fosforilación, los ensayos de migración y la invasión se llevaron a cabo con o sin PD98059 (25 mM). Los métodos exactos fueron como se describe en los métodos. Los resultados mostraron que hCGβ aumentó significativamente tanto la migración celular y la invasión; pero PD98059 disminuyó significativamente estos efectos (Figura 6A, la Figura 6B). Tenga en cuenta que hCGβ aceleró exactamente la migración celular y la invasión a través de ERK1 /2 fosforilación.
(A) Sembramos 1 × 10
5 células en una placa de 24 pocillos con insertos de células, se añadieron las células con /sin PD98059 (25 mM) durante 6 h para detectar la migración celular, los resultados mostraron que hCGβ promueve la migración de células significativamente versus control. (B) En las mismas condiciones que se incubaron las células en la cámara de invasión con membrana basal artificial, se añadieron las células con /sin PD98059 (25 mM) durante 12 h para detectar la invasión de células, los resultados mostraron que hCGβ promueve la invasión de células de manera significativa. Se realizaron todos los procedimientos como se describe en Métodos. *, Indica
P & lt; 0,05 frente al control
. Los datos se muestran como medias ± SEM de tres pruebas separadas.
Discusión
El cáncer de próstata representa el 29% de todos los cánceres en los hombres [25]. las células de cáncer de próstata tienen una sorprendente tendencia a la metástasis, y la metástasis es la causa principal de mortalidad en pacientes con cáncer [26]. Por lo tanto, es necesario encontrar y caracterizar las dianas moleculares para inhibir la invasión y la metástasis a través de la orientación de genes.
HCGβ es un marcador importante de la transformación maligna. Casi todos los cáncer humano produce hCGβ hasta cierto punto [27]. Los estudios demostraron que hCGβ promueve la proliferación de células cancerosas y también podría promover la metástasis. Por ejemplo, Laurence A Cole descubrió que hCGβ puede competir con un TGF para unirse a un receptor de TGF, como un antagonismo del receptor de TGF para controlar la apoptosis y promover la invasión por las metaloproteinasas de activación [28]. Además, otro informe mostró que hCGβ y VEGF juegan un papel coordinado a través de sus propiedades angiogénicas e invasoras en el desarrollo de adenocarcinomas de Barrett [29]. A través de los resultados anteriores se puede inferir que hCGβ podría desempeñar un papel importante en el cáncer de promoción a través de múltiples vías de señalización. Por lo tanto, es esencial investigar hCGβ activada por vías en la migración tumor y la invasión de señalización.
En el estudio anterior demostramos que hCGβ cambió la morfología de células de cáncer, la aceleración de la motilidad celular, la regulación negativa de la migración de inhibición de la proteína E-cadherina, promoción de la migración cáncer de próstata humano y la invasión [11]. Sin embargo, los mecanismos además para hacer que la migración y la invasión mantienen desconocido. En el presente estudio, se encontró que algunas vías de señalización están relacionados con la migración y la invasión. Aquí demostramos que hCGβ upregulated ERK1 /2 y MMP-2 que conduce a la migración celular y la invasión. Uso de la ERK1 /2 fosforilación bloqueador de PD98059, descubrimos que MMP-2 upregulation resultado de ERK1 /2 fosforilación. ERK1 /2 se han demostrado para contribuir a un tumor proliferación, la migración y la metástasis, y varios estudios informaron que la hCG promueve la activación de ERK1 /2 en algunos tipos de células [30], [31]. Obviamente, estos resultados son consistentes con nuestros resultados que la hCG inducida ERK1 /2 fosforilación de la dosis y tiempo dependiente de maneras en las células DU145. La ruta relacionada ERK es una de las vías de señalización más críticos en la aparición del tumor, el desarrollo y la expansión clonal. En particular, MMP-2 es la molécula clave en la invasión tumoral. Nuestros resultados que hCGβ activa MMP-2 a través de ERK1 /2 fosforilación en células DU145 son muy importantes. Estos resultados no sólo revelan la relación entre hCGβ y el cáncer, sino también indicaron que hemos encontrado una vía clave novedoso para inhibir el cáncer. Obviamente, el /ERK1 /2 /MMP-2 vía hCGβ es vital en la invasión tumoral, por lo menos en el cáncer de próstata. En otras palabras, encontramos enfoques más útiles para inhibir la invasión tumoral y, además, podemos desarrollar fármacos dianas moleculares.
hCG se compone de dos subunidades, hCGα y hCGβ. Estas dos subunidades hacen un complejo, que se une al receptor de la hormona luteinizante y activa vías de señalización. Sin embargo, no sabemos si hCGβ también se une al receptor de la hormona luteinizante por separado. Este estudio nos dio la nueva pista y nos empuje para caracterizar hCGβ receptor específico.
Además, las MMP fueron considerados para ser moléculas que promueven la metástasis con muchos tipos de isoformas. Tienen potencial para degradar la matriz extracelular y la membrana basal. MMP-2 se ha implicado a ser un miembro clave de las MMP. Más, ERK1 /2 podría trasladar al núcleo y activar algún factor transcripcional AP-1 para regular la transcripción de genes [32]. AP-1 se localiza en la región del promotor de MMP-2 de gen MMP-2, por lo tanto, ERK1 /2 podría promover la MMP-2 de la transcripción y suelte [33], [34]. Por lo tanto, con el fin de investigar el papel de ERK1 /2 en la regulación de la migración celular y la invasión, se determinó con éxito MMP-2 expresión y actividad. Se encontró que hCGβ aumentó significativamente MMP-2 expresión y actividad. Estos efectos fueron reprimidos por PD98059 notablemente en hCGβ transfectaron células DU145. Estos resultados mostraron una diafonía entre ERK1 /2 y MMP-2. Coincidentemente, también encontramos que hCGβ promovido ERK1 /2 fosforilación y MMP-2 expresión que sigue los mismos patrones de dosis y de tiempo. Estos resultados indicaron que hCGβ activa ERK1 activación /2 resultó en MMP-2 upregulation y aumentó la actividad de MMP-2. En consecuencia, hCGβ-causaron la migración y la invasión resultado de la activación de ERK1 /2. Sin embargo, no tenemos pruebas suficientes ya sea causada hCGβ-MMP-2 upregulation juega un papel importante en la migración y la invasión. La transfección con MMP-2 constructo y knock out de MMP-2 estudio podrían ayudar a responder a estas preguntas. Además de la caracterización de la señalización hCGβ nos ayudará a encontrar más marcadores de metástasis para satisfacer las necesidades terapéuticas.
En realidad, algunos expertos han comenzado la investigación sobre anticuerpos relacionados hCGβ en el campo del cáncer [35], [36]. Aquí hemos descubierto que hCGβ fosforilados ERK1 /2 y más upregulated MMP-2 para aumentar la motilidad del cáncer en células de cáncer de próstata. Nuestros resultados pueden dar a los nuevos conocimientos sobre los mecanismos moleculares de la regulación hCGβ, y proporcionar una base sólida para la investigación relacionada con hCGβ en el agente supresor de tumores.
Hemos encontrado unos nuevos objetivos moleculares para inhibir la invasión y metástasis de cáncer de próstata cáncer. El tratamiento eficaz del cáncer de próstata es de gran importancia. El bloqueo de la señalización de hCGβ es una estrategia terapéutica potencial para tratar el cáncer de próstata y otros cánceres. Es necesario seguir trabajando para caracterizar los receptores hCGβ; desarrollo de hCGβ bloqueadores de señalización será un campo potencial para reducir la invasión y la metástasis.
Reconocimientos
Agradecemos al Dr. Ameae Walker, Universidad de California, Riverside por su tipo de dirección en el diseño original del proyecto . También agradecemos al Dr. Jiang Tao, el Hospital Tiantan, Capital Medical University por su ayuda en los experimentos.