Extracto
Antecedentes
Helicobacter pylori
está asociado con la gastritis crónica, úlcera péptica y cáncer gástrico. El objetivo de este estudio fue evaluar la distribución topográfica de
H. pylori
en el estómago, así como la
vacA
y
cagA
genotipos en pacientes con y sin cáncer gástrico.
Metodología /Principales conclusiones
tres biopsias gástricas, desde regiones predeterminadas, se evaluaron en 16 pacientes con cáncer gástrico y 14 pacientes con síntomas dispépticos. De los pacientes con cáncer, las muestras de biopsia adicionales se obtuvieron de centros de tumor y los márgenes; entre estas muestras, la presencia de
H. pylori vacA
y
se evaluó cagA
genotipos. Positivo
H. pylori
era 38% y 26% en las biopsias obtenidas de los grupos de cáncer y no cáncer gástrico, respectivamente (
p
= 0,008), y 36% en los sitios tumorales. En pacientes con cáncer, encontramos una distribución preferencial de los
H. pylori
en el fundus y el cuerpo, mientras que en el grupo sin cáncer, la distribución es uniforme (
p
= 0,003). La mayoría de las biopsias fueron simultáneamente
cagA
gen-positivos y negativos. El fondo de ojo y el cuerpo demostraron una tasa de positividad más alta para el
cagA
gen en el grupo no-cáncer (
p = 0,036
). Una mezcla de
cagA
tamaños de genes también fue significativamente más frecuente en este grupo (
p
= 0,003). Noventa y dos por ciento de todos los sujetos mostraron más de un
vacA
genotipo del gen; S1B y m1
vacA
genotipos fueron hallados predominantemente en el grupo de cáncer gástrico. El más alto
vacA
diversidad -genotype señal de secuencia se encontró en el corpus y 5 cm de los márgenes del tumor.
Conclusión /Importancia
Alta
H. pylori
diversidad colonización, junto con el
cagA
gen, se encuentra predominantemente en el fundus y el cuerpo de los pacientes con cáncer gástrico. El genotipo diversidad observada a través de un muestreo sistemático de todo el órgano y tumor era notable. Nos encontramos con que no hay pruebas suficientes para apoyar la asociación de una cepa con una enfermedad específica, debido a la naturaleza de multistrain
H. pylori infección
muestra en este trabajo
Visto:. López-Vidal Y, Ponce-de-León S, Castillo Rojas G, Barreto-Zúñiga R, Torre-Delgadillo A (2008) gran diversidad de
vacA
y
Helicobacter pylori cagA
genotipos en pacientes con y sin cáncer gástrico. PLoS ONE 3 (12): e3849. doi: 10.1371 /journal.pone.0003849
Editor: Debbie Fox, del Instituto de Investigación de la Infancia del Hospital de Niños de Nueva Orleans, Estados Unidos de América
Recibido: 12 de mayo de 2008; Aceptado: 10 de noviembre de 2008; Publicado: Diciembre 3, 2008
Derechos de Autor © 2008 López-Vidal et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Esta investigación fue financiado por la subvención DGAPA-PAPIIT IN207302 de la Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM), UC-MEXUS y CONACYT-México 47749-M. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Helicobacter pylori
es un patógeno que infecta gástrica casi el 50% de la población mundial [1]. Se considera el principal agente etiológico de gastritis crónica activa y, en general es aceptado como la causa primaria de la enfermedad de úlcera péptica; también es un factor de riesgo conocido para el cáncer gástrico [2]. el desarrollo del cáncer gástrico se ha demostrado para abarcar varias décadas, comenzando secuencialmente con
H. pylori
infección y el desarrollo de gastritis crónica activa [3]. atrofia y la metaplasia intestinal glandulares finalmente se producen en un subgrupo de pacientes y terminan en el cáncer gástrico [4].
H. pylori
la infección se ha sugerido para dar lugar a un aumento del riesgo relativo (RR), del orden de cuatro para nueve veces, para el desarrollo de condiciones gástricas precancerosas, especialmente cuando se produce la infección durante la infancia [5]. Dado que sólo una minoría de los
H. pylori
individuos infectados desarrollan esta enfermedad, se cree que el desarrollo de la enfermedad depende de la expresión de genes de virulencia bacterianas específicas, por ejemplo
cagA
y
vacA
[6] , ambos de los cuales se expresan altamente independientemente del estado de la enfermedad del huésped [7], [8]. Las asociaciones entre la topografía gástrica, la diversidad genotípica de la
H. pylori vacA
y
cagA
genes, y el desarrollo de cáncer gástrico sigue siendo controvertido. El objetivo del presente trabajo fue evaluar la distribución de la
vacA Opiniones y
cagA
genotipos de
H. pylori
a lo largo del estómago en pacientes con y sin cáncer gástrico
Hipótesis:. una mayor frecuencia de
H. pylori
se asocia con las primeras etapas de cáncer gástrico.
Métodos
pacientes remitidos para estudio endoscópico debido a la sospecha de cáncer o síntomas dispépticos fueron invitados a participar en un estudio prospectivo transversal . Todos los pacientes con cáncer se incluyeron, así como aquellos con dispepsia no ulcerosa y /o de reflujo gastro-esofágico. Los criterios de exclusión incluyeron alteraciones de la coagulación, anti-inflamatorio (NSAID) la ingesta de drogas no esteroides en las últimas 72 h, la hipertensión portal, y la presencia de linfoma en el estudio histológico.
Todos los pacientes firmaron un formulario de consentimiento informado por escrito antes de participar en el estudio. El protocolo de estudio fue aprobado por el Comité de Revisión Institucional del Instituto Nacional de Ciencias Médicas y Nutrición Salvador Zubirán (INCMNSZ), número de registro CIBH-1081.
endoscopia digestiva alta fue realizado de acuerdo con una técnica estándar. Se utilizó un esquema de biopsia de muestreo sistemático de la siguiente manera: a partir de cada paciente, tres biopsias gástricas se obtuvieron de cada uno de los cuatro sitios de estómago (antro, la porción angular, corpus, y del fondo de ojo). De los pacientes con cáncer gástrico, las muestras de biopsia adicionales se obtuvieron a partir del centro y el margen del tumor y a una distancia de al menos 2 a 5 cm de los márgenes del tumor.
Todas las muestras patológicas de pacientes con cáncer gástrico fueron evaluadas por un solo patólogo experimentado y clasificados de acuerdo con la clasificación de Lauren como difusa, intestinal o de tipo mixto [9]. La descripción de cáncer gástrico avanzado se basa en la clasificación Borrmann [10]. Morfológicas precoz del cáncer gástrico subtipos se clasifican de acuerdo con guías de la Sociedad Japonesa de endoscopia [11], [12].
H. pylori
se cultivó untando las muestras de biopsia en la superficie de placas de agar sangre de caballo (sangre de caballo al 10% en base de agar Casman [Microbiología de BBL Systems, Cockeysville, MD, USA]) [8].
cromosómicas se extrajo el ADN [13], y el
H. pylori 16S rRNA
y
cagA
gen fue amplificado por PCR como se describe anteriormente [7]. El
vacA
secuencia señal y la región media se tipificaron por PCR alélica específica del tipo, como se ha descrito anteriormente por Morales
et al.
[8].
cagA
amplificación del gen de la región variable. Los
cagA
3 'regiones de repetición de la
H. pylori
cepas estudiadas en esta investigación fueron clasificados de acuerdo a su longitud (debido a la presencia de un número variable de secuencias repetidas en la región 3 'del gen). Los productos de amplificación obtenidos se clasifican por tamaño en uno de tres grupos: corto (906 pb); medio (1008 pb) y largo (1110 pb), de acuerdo con Karita
et al
. [14]. La amplificación se llevó a cabo usando los cebadores 5 'cagRV17-F-acc CTG GTC GGT AAT GGA TTA TCT-3' y 5 'cag22-R-tta aga ttt ttg gaa acc acc ttt t-3', que se diseñaron basándose en secuencias recuperadas de GenBank utilizando alig (software científico y educativo) y ClustalW (BCM Buscar Launcher, múltiples alineamientos de secuencias).
Los datos fueron analizados con fines descriptivos utilizando frecuencias relativas y las medias aritméticas (desviación estándar [dE]), según se considere apropiado. Las comparaciones entre grupos se realizaron mediante χ
2 análisis, así como con Fisher-Freeman-Halton prueba exacta de las tablas de contingencia. El grupo de cáncer gástrico se comparó con los pacientes con dispepsia no ulcerosa y /o reflujo gastroesofágico. Los pacientes con cáncer fueron estratificados como principios para el estadio TNM 0, I o II y avanzado para III o IV. El nivel alfa se fijó en 0,05. Teniendo en cuenta que se llevaron a cabo comparaciones múltiples simultáneas, una corrección alfa-valor nominal se introdujo siguiendo el procedimiento de Bonferroni. En consecuencia, considerábamos asociaciones con
P
valores entre 0,05 y 0,01 como sospechoso. Por el contrario, los resultados en el
p
≤0.0063 nivel se considera razonablemente significativa. Los valores comprendidos entre 0,01 y 0,0063 eran considerados como marginales. Todos los análisis se realizaron utilizando el software estadístico Stata (Stata intercooler 7.0 para Windows 98/95 /NT Paquete, 2002) y Stat-Xact (v. 4.0.1., Cytel Software Corp., 1999).
Resultados
Treinta y dos pacientes fueron incluidos en este estudio. Con base en el diagnóstico endoscópico, 18 fueron clasificados en el grupo de cáncer gástrico y 14 en el grupo sin cáncer. Debido a la evidencia histológica de linfoma gástrico, sin embargo, dos pacientes en el grupo de cáncer gástrico tuvieron que ser excluidos, dejando a 16 personas en ese grupo. La edad media de los pacientes en el cáncer gástrico y grupos de dispepsia fue de 57,6 ± 16,7 años (56% varones) y 47,2 ± 13,3 años (14% varones), respectivamente. Diez pacientes (63%) muestran un tumor difuso de acuerdo con la clasificación de Lauren. Cinco pacientes tenían principios de cáncer gástrico (tipo I, tres; II, uno; IIB, uno) y 11 tenían cáncer avanzado (IIIA tipo, cuatro; IIIB, tres; IV, cuatro) gástrica, según la Sociedad Japonesa de Investigación para el cáncer gástrico directrices y la clasificación Borrmann.
En nuestros 411 muestras de biopsia,
H. pylori
fue identificado por cualquiera de cultivo o PCR en el 38% (78/203) de las muestras de biopsia del grupo de cáncer gástrico, el 26% (54/208) del grupo sin cáncer (
p
= 0,008) y 36% (40/110) de los sitios de tumor (véanse los cuadros 1 y 2).
H. pylori
demostró una distribución topográfica diferencial en pacientes con cáncer gástrico, con una tasa de positividad más alto en el fundus y el cuerpo (
p
= 0,003), la tabla 1. El grupo sin fines de cáncer no mostraron distribución topográfica diferencial . A algo más alta positividad de
H. pylori
se encontró en los sitios del tumor por la cultura o en los márgenes del tumor por PCR; sin embargo, estos aumentos en la positividad no fueron estadísticamente significativas (Tabla 2). No hubo correlación significativa entre el
H. pylori
tasa de positividad y la etapa del cáncer TNM (temprana versus tardía).
Nos encontramos
H. pylori cagA
positividad en el 72% de las muestras gástricas del grupo cáncer gástrico, el 73% del grupo sin cáncer (
p = NS
) (Tabla 3), y el 83% del tumor sitios (
p
= no significativo [NS]). El
H. pylori cagA
distribución topográfica no fue estadísticamente significativa en el grupo de cáncer gástrico, mientras que el grupo no-cáncer demostró una tasa de positividad más alto en el fundus y el cuerpo; sin embargo, la importancia de este hallazgo es cuestionable (
p
= 0,036) (Tabla 3). Una vez más, en los sitios tumorales, encontramos un modelo de distribución importante para el
cagA
fracción positividad, tampoco había una diferencia entre los pacientes con cáncer gástrico temprano y avanzado.
El ochenta un
H. pylori
cepas fueron estudiados (80
cagA
+), incluyendo 46 cepas de pacientes con cáncer gástrico y 35 de pacientes sin cáncer. Sólo dos
cagA
tamaños de genes se obtuvieron a partir del 80
H. pylori
cepas estudiadas; ninguno de los ya
No se encontraron secuencias cagA
. En ambos grupos, el más corto
cagA
fue la más detectada. Los resultados se resumen en la Tabla 4. Curiosamente, ambos
cagA
tamaños fueron amplificados de 12 (15%) de las cepas, lo que sugiere que estos pacientes fueron co-infectados con múltiples
H. pylori
cepas. Se obtuvo este hallazgo con más frecuencia en el grupo de pacientes no oncológicos (28,6%) que en el grupo de cáncer gástrico (4,4%) (
p
= 0,003).
El predominante señal de secuencia de genotipo en pacientes con cáncer gástrico, presentes en el 39% del grupo, fue S1B. La combinación s1b /s2 estaba presente en 20% del grupo y s2 estaba presente en 12%. Dieciséis por ciento de los pacientes con cáncer gástrico tenía una secuencia señal no identificable (S0). No hubo distribución estadísticamente significativa de
vacA
genotipos a través del estómago (
p = NS
) (véase la Figura 1). Las más frecuentes
vacA
genotipo en el grupo no-cáncer fue S1B, que estaba presente en el 59% del grupo, seguido de la combinación S1A /S1B en el 11%, S1A /S1B /s2 en el 7%, y una secuencia señal no identificable en el 9% (
p
= 0,06), Figura 1. Análisis de la distribución de los genotipos topográfico mostró que el genotipo de S1B
vacA
era predominante en todas las zonas (fondo de ojo, corpus , la porción angular, y el antro) del estómago en los dos grupos estudiados (Figura S1). Se encontró una diferencia clara y marginalmente significativo en los patrones de distribución de estos genotipos entre los grupos de cáncer y sin cáncer (
p
= 0,01). Tanto el cuerpo y fondo del grupo de cáncer gástrico exhibieron una mayor diversidad de la secuencia señal de genotipos, al igual que el corpus en el grupo no-cáncer (Figura S1).
Las más frecuentes
vacA
genotipos para cada uno de los sitios de tumor (centro y los márgenes del tumor, y al menos 2 a 5 cm de los márgenes del tumor) fueron S1B y s2, que estaban presentes en el 19%; S1A /S1B y S1B /s2 estaban presentes cada uno en el 17%, y S1A /S1B /2, S1A /s2, y s0 estaban presentes en el 8%. No se encontró asociación significativa entre el genotipo y el tumor sitio de proximidad (Figura 2). La distribución de este genotipo en los sitios tumorales y anatómicas en pacientes con cáncer no fue estadísticamente significativa (
p
= 0,06) (Figuras 1 y 2). Una asociación significativa (
p
= 0,02) entre el genotipo y el tumor de las etapas se identificaron: S1A /S1B, S1A /S1B /s2, y los genotipos S1b /S2 fueron predominantes en el grupo de cáncer gástrico precoz, mientras que S1B, s2 , y los genotipos S1a /s2 eran relativamente abundantes en el grupo de cáncer gástrico avanzado (Figura 3).
el genotipo de la región media más frecuente en pacientes con cáncer gástrico fue m1, que estaba presente en 44% de los pacientes, seguido de m0 (genotipo untypeable) en 26%, m2 en 21%, y la combinación m1 /m2 en 10% (Figura 1). En el grupo sin cáncer, los más frecuentes
vacA
genotipo fue m1, que estaba presente en el 52% de los pacientes, seguido de M0 en el 32%, el /la combinación m2 m1 en el 11%, y en m2 5%; hubo un patrón de distribución distinto para estos genotipos, con un nivel de significación dudosa (
p
= 0,03) (Figura 1). El análisis de la distribución topográfica a través de zonas anatómicas del genotipo región media mostró que el genotipo M1 era predominantemente (50%) en la porción angular, con la que queda en el fondo de ojo (48%) y el corpus (42%). El genotipo m0 era predominantemente en el antro (39%) en el grupo de cáncer gástrico (Figura S1). En el grupo sin cáncer, el genotipo M1 era más abundante en el fondo de ojo (77%); 56% estaba en el corpus, y el 43% estaba en el antro. El genotipo m0 se detectó en la parte angular (62%), sin diferencias estadísticamente significativas entre los grupos de estudio (Figura S1). Una distribución casi uniforme de los diferentes genotipos se encontró en los sitios de tumor, (Figura 2). No hubo diferencias entre las zonas anatómicas y sitios de tumor en pacientes con cáncer gástrico (Figura 1 y 2) o entre los primeros y avanzados tumores (Figura 3).
Tabla 5 muestra el análisis de la distinta
vacA
genotipos encontrados dentro de cada individuo para el cual se estudió más de una biopsia. Noventa y dos por ciento (12/13) de los pacientes con cáncer tenía más de un genotipo presente. Se observó un hallazgo similar en el grupo no-cáncer. Tres sujetos en el grupo de no-cáncer fueron consistentemente positivo para el
cagA
gen, y otros tres poseían ambos tipos (positivos y negativos) de forma simultánea. En el grupo de cáncer, seis individuos fueron positivos para
cagA
y siete para ambos tipos. Ninguno de los sujetos fueron siempre negativos para este gen. La figura 4 muestra el número de biopsias por individuo y el número de
distintos genotipos de vacA
segmento de señal del gen (SS). El menor número de genotipos en pacientes de 10 o más biopsias tenía dos años, y la más alta fue de cinco
Discusión
El presente estudio dio lugar a cuatro conclusiones principales:. Primera ,
H. pylori
se distribuye uniformemente a través del estómago en pacientes que tienen síntomas dispépticos única; en segundo lugar,
H. pylori
tiene una preferencia por el fundus y el corpus en pacientes con cáncer gástrico; En tercer lugar, en los pacientes con síntomas dispépticos,
H. pylori cagA
tiene una distribución preferencial en el fundus y el cuerpo y hay una alta frecuencia de mezclado
cagA
tamaños; En cuarto lugar, el genotipo S1B fue predominante en ambos grupos de estudio, y el genotipo S1 A sólo estaba presente en el grupo dispépticos.
El alto
H. pylori
positividad en el fondo de ojo de los pacientes con cáncer gástrico puede haber sido debido a su proximidad con el corpus, una zona que está colonizada en
H. pylori
gastritis inducida. atrofia Corpus-predominante, o la pérdida de tipos de células glandulares especializados como parietal y células principales, parece ser crítica para la progresión del cáncer [15], y es probable que el fondo de ojo se trata, ya sea antes o después del corpus ya se dedica a la cáncer.
a relativamente alta positividad para
H. pylori
fue encontrado en el lugar del tumor a pesar de las declaraciones anteriores que
H. pylori
no se puede desarrollar en la mucosa atrofiada y que la metaplasia intestinal es un medio desfavorable [16]. Tang
et al.
, Sin embargo, sugirió que
H. pylori
podría sobrevivir en el epitelio gástrico en la presencia de una lesión cancerígena [17]. También se ha especulado que ciertos factores de virulencia pueden jugar papeles importantes en la persistencia de
H. pylori
en la mucosa gástrica [18].
En el presente estudio, se observó que
H. pylori
demuestra la colonización similar de las regiones anatómicas del sitio de estómago y tumores.
H. También se encontró pylori
positividad en los grupos de cáncer gástrico precoz y avanzado a ser muy similares; Tang
et al
. Sin embargo, se observa los resultados inversos [17]. Creemos que la diferencia observada entre estos dos estudios se debe a que el número de biopsias estudiadas en cada paciente; hemos demostrado que el muestreo sistemático modifica la asociación de
H. pylori Vaya con la enfermedad.
Una mayor prevalencia de
H. pylori cagA
gen-positividad fue encontrado en el cuerpo y fondo de los pacientes con dispepsia. Anteriormente, Semino-Mora
et al
. demostró que este patrón no está presente en los pacientes con cáncer gástrico [19], aunque se utilizó un
fragmento de amplificación de cagA
diferente en el presente trabajo. la transformación neoplásica gástrica es inducida y sostenida, al menos en parte, por
in vivo
intracelular
cagA
expresión; este efecto podría desempeñar un papel no sólo durante la carcinogénesis gástrica temprano, pero, sobre la base de nuestros datos, también podría ocurrir más adelante en este proceso [19]. Hemos observado que el 15% de las cepas poseía una mezcla de
cagA Estrellas: 3 'repetir tamaños región, lo que sugiere la presencia de coinfección con múltiples
H. pylori
cepas, principalmente en el grupo de no-cáncer. Kidd
et al
obtenido resultados diferentes.; si bien estos autores estudiaron a un mayor número de pacientes [20], se estudió un mayor número de biopsias gástricas de los cuales incluye varios sitios específicos dentro del estómago.
previamente observado la presencia de la diversidad genotípica en el corpus de la úlcera péptica [8]. Esta diversidad se ha propuesto para reflejar las acciones sinérgicas que están asociados con este proceso [21]. La predominante
vacA
secuencia señal genotipo detectado en ambos grupos de estudio fue S1B, de acuerdo con nuestro informe anterior [22].
Los hallazgos importantes de nuestro estudio son que hay una distribución topográfica de
vacA
señal de secuencia, el genotipo S1B es comúnmente asociada con el grupo sin cáncer y la combinación S1B /s2 o genotipos s2 se encuentran únicamente en el grupo de cáncer gástrico. No hay estudios previos en individuos con cáncer gástrico han considerado las cuatro zonas tumorales evaluados en el presente trabajo. Se encontró que el genotipo s1c ser el genotipo más frecuente en Asia; sin embargo, su asociación con el cáncer gástrico está disminuyendo [22], [23]. La diversidad de la
vacA
genotipo de los
H. pylori
ha sido explicado por un modelo de co-evolución [21].
En cuanto a
vacA
alelos de la región media, encontramos genotipos M1 y M2, en los dos grupos estudiados, con m1 genotipo es el más frecuente en las regiones predeterminadas del estómago evaluado [8].
en ambos grupos estudiados, encontramos
H. pylori
cepas que eran untypeable para las secuencia señal y la región media alelos debido a la variación significativa en el
vacA
gen [8], [24]. Hemos encontrado consistentemente que el
cagA CD - y
vacA
diversidad -allele fue mayor en el tumor, lo que sugiere que
H. pylori
puede permanecer en el tumor sin estrés ambiental.
La diversidad genotípica observada a través de órganos enteros sistemáticas y tumores en el presente trabajo fue notable. El director de la implicación práctica de este hallazgo es la necesidad de buscar un esquema de muestreo exhaustiva similares con el fin de asociar un factor de patogenicidad con la enfermedad. Se encontró que la asociación de un solo aislamiento derivado desde una sola biopsia con enfermedad no es suficiente debido a la naturaleza de multistrain
H. pylori
la infección se demuestra en el presente trabajo
.
Las limitaciones de este estudio están relacionadas con su naturaleza observacional y su diseño transversal. No podemos excluir la posibilidad de que existe una variable de confusión asociada tanto con la presencia de la
Helicobacter pylori
infección y el cáncer o el estado dispépticos. Además, la falta de un seguimiento longitudinal impide confirmar la aparición secuencial de los acontecimientos, al igual que el desarrollo del cáncer y la infección inicial con la cepa (s) de
Helicobacter pylori Windows que se detectaron con el tiempo.
declaración de conflicto de intereses
Los autores declaran no tener conflictos de interés.
Apoyo a la Información
Figura S1. .
Secuencia señal topográfica y la distribución de alelos región media del gen vacA en pacientes con y sin cáncer gástrico
doi: 10.1371 /journal.pone.0003849.s001 gratis (3.81 MB TIF)
Reconocimientos
agradecemos a Rosa Isabel Amieva-Fernández, Ana Karina Martínez-Díaz, Leonor Jacobo-Albavera, y Fernando Vargas Romero por su excelente asistencia técnica para la amplificación de ADN.