Extracto
Las topoisomerasas son una familia de enzimas vitales capaces de resolver los problemas topológicos en el ADN durante diversos procesos genéticos. venenos de la topoisomerasa, el bloqueo de la reunión de las hebras de ADN escindidos y la estabilización de complejos de ADN división mediada por enzima, son clínicamente importantes los agentes antineoplásicos y anti-microbianas. Sin embargo, el rápido aumento de la resistencia a los medicamentos que impide la eficacia terapéutica de estos medicamentos que salvan vidas hace que el descubrimiento de nuevos compuestos de plomo cada vez más urgente. Presentamos aquí un sistema de cribado de alto rendimiento fácil para los agentes destinados a la topoisomerasa humana IIα (Top2α). El ensayo se basa en la medición de la anisotropía de fluorescencia de un 29 pb marcado con fluoróforo dúplex de oligonucleótidos. Dado que el ADN unido a la Top2α estabilizado-fármaco tiene una anisotropía mayor en comparación con el ADN libre, este ensayo puede funcionar si se puede utilizar un agente de disociación para interrumpir específicamente los enzimas /ADN complejos binarios pero no a los complejos ternarios estabilizado con las drogas. Aquí demostramos que NaClO
4, un agente caotrópico, sirve un papel crítico en nuestro método de cribado para diferenciar los complejos enzima /ADN estabilizado con las drogas de las que no lo son. Con esta estrategia que exhibió una biblioteca química de 100.000 compuestos y se obtuvieron 54 positivos hits. Se caracterizaron tres de ellos en esta lista y demostrar sus efectos sobre las reacciones mediadas por Top2α. Nuestros resultados sugieren que esta nueva estrategia de cribado puede ser útil en el descubrimiento de candidatos adicionales de agentes anticancerígenos
Visto:. Lin YS, Huang WC, Chen MS, Hsieh Ts (2014) hacia el descubrimiento de nuevos medicamentos anticancerosos orientación de la topoisomerasa IIα: Una estrategia de cribado Facile Adaptable a la plataforma de alto rendimiento. PLoS ONE 9 (5): e97008. doi: 10.1371 /journal.pone.0097008
Editor: Spies Maria, Universidad de Iowa, Estados Unidos de América
Recibido: 26 Diciembre, 2013; Aceptado: 14 de abril de 2014; Publicado: May 8, 2014
Derechos de Autor © 2014 Lin et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyada por las subvenciones del Programa Nacional de Investigación para productos biofarmacéuticos (ChemBank y selección de alto rendimiento Centro de recursos, NSC-101-2325-B-001-029), y el Consejo de Seguridad Nacional (NSC102-2325 y NSC103-2811). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
transacciones de ADN que transmiten y restaurar la información genética implican invariablemente desbobinado y rebobinado de las estructuras de doble hélice. Debido a la relación topológica entre las estructuras de ADN de orden secundario y superior, el resultado rebobinado helicoidal desenrollado /en el enredo y enclavamiento de los cromosomas y el ADN. Estos enredos topológicos tendrían que ser resuelto de una manera oportuna y precisa, sin la cual las células no pueden sobrevivir. Las topoisomerasas son la solución de la naturaleza de estas complejidades topológicos aparentemente insolubles [1] - [6]. Ellos llevan a cabo estas transformaciones topológicas través de un ciclo de transesterificación reversible entre el residuo de sitio activo y tirosil esqueleto de fosfato en el ADN. El aducto enzima /DNA transitorio crea una puerta de ADN a través de la cual otro segmento de ADN puede ser transportado y los resultados en los cambios topológicos. Basándose en la estructura y el mecanismo, las topoisomerasas se clasifican en dos tipos: tipo I enzima media la cadena de transporte a través de una sola puerta de DNA de cadena, mientras que la enzima de tipo II transporta segmento de ADN a través de una puerta de doble cadena. Ambos tipos de topoisomerasas se clasifican en dos familias, A y B, y estas enzimas son ubicuos en la naturaleza y tienen funciones esenciales para el crecimiento y desarrollo de todos los organismos [7], [8].
Curiosamente, el roturas en el ADN transitorios y reversibles mediadas por las topoisomerasas, tan importante para sus funciones bioquímicas y biológicas, también crean un talón de Aquiles de las células. Muchos agentes citotóxicos, hecho por el hombre o de la naturaleza de producción, el objetivo en este paso de la reacción de la topoisomerasa y estabilizar la escisión intermedios generando así potencialmente letales roturas de la cadena de ADN [5], [9] - [14]. Algunos de estos agentes de la topoisomerasa de metas han demostrado ser clínicamente importante fármacos contra el cáncer y antibióticos. La eficacia terapéutica de estos medicamentos que salvan vidas con frecuencia se ve comprometida debido a la subida de la resistencia a las drogas en las células tumorales o microbianos. La búsqueda de nuevas modalidades y las drogas se hace cada vez más urgente si queremos mantener el ritmo de la amenaza de la resistencia a los medicamentos. Debido a la función esencial de las topoisomerasas en la proliferación celular y porque son objetivos de los fármacos probados clínicamente útiles, es razonable esperar que los intensos esfuerzos deben dedicarse a descubrir más fármacos dirigidos a las topoisomerasas. Sin embargo, los ensayos bioquímicos que con mayor frecuencia se utilizan para el seguimiento de las actividades de la topoisomerasa no son fácilmente adaptables para la automatización y la plataforma de alto rendimiento. Para los ensayos bioquímicos los ensayos más versátiles se basan en el uso de electroforesis en gel de agarosa, ya que puede detectar el ADN transiciones estructurales asociados a las actividades de escisión de cadena y el paso de las topoisomerasas. El carácter intensivo en mano de obra y el engorroso proceso de adquisición de los datos hacen poco probable electroforesis en gel de un método de elección para la automatización y la cuantificación
.
Para subsanar esta dificultad, hay una serie de enfoques desarrollado recientemente que son adaptables para automatizada plataforma de alto rendimiento para identificar compuestos de la topoisomerasa-focalización [15] - [18]. Son todos los ensayos de actividad de la topoisomerasa basados en fluorescencia, por lo tanto más susceptibles para la cuantificación automatizada. Sin embargo, también se caracterizan por el uso de un plásmido de ADN en el proceso de ensayos. Presentamos aquí nuestro esfuerzo en el desarrollo de un nuevo enfoque mediante un dúplex de oligonucleótidos fluoróforo etiquetado como un sustrato para el ensayo de la formación de complejos de la topoisomerasa /ADN estabilizados en presencia de un agente candidato específico. Describimos nuestra pantalla inicial usando esta técnica ensayar de una biblioteca química con 100.000 compuestos y caracterización de tres de los éxitos positivos. Este procedimiento de selección puede ofrecer un enfoque alternativo para descubrir nuevos agentes de la topoisomerasa-focalización y enriquecer nuestro arsenal para combatir tumores y patógenos microbianos.
Materiales y Métodos
Purificación de Top2α humano
Hemos utilizado un YEpWob6 ingeniería, un vector con hexahistidina de etiquetado Top2α humano bajo un
GAL1
promotor inducible, para expresar Top2α humana recombinante en la levadura [19]. Se recogieron las células de levadura después de la inducción de galactosa, se resuspendieron en tampón hipertónico (1 M sorbitol, 20 mM de fosfato de potasio pH 7,4, 20 mM 2-mercaptoetanol) y se lisaron mediante la adición de la enzima lítica (zimoliasa 100T, Amsbio). Los núcleos se recogieron por centrifugación (20 min a 55,000X
g
), se resuspendieron en un tampón de 20 mM de fosfato de potasio pH 7,4, 0,2% Triton X-100, 5 mM 2-mercaptoetanol con un cóctel inhibidor de la proteasa incluyendo PMSF 1 mM, 2 mg /ml de leupeptina, y 1 mg /ml de pepstatina A, y se homogeneizó. Se extrajeron Top2α de los núcleos mediante el aumento de la concentración de NaCl a 500 mM y eliminado pellet nuclear por centrifugación a 15,000X
g
para 25 min. El sobrenadante se fraccionó por 3 etapas cromatográficas (GE Healthcare). El primero fue un crudo HisTrap FF columna Ni-quelante y Top2α se eluyó a imidazol 40 mM con un gradiente de imidazol 20 a 200 mM, en 20 mM de fosfato de potasio pH 7,4, NaCl 500 mM y 0,1% de Triton X-100. Las fracciones agrupadas se diluyeron tres veces por 20 mM de fosfato de potasio pH 7,4, y se purificó adicionalmente a través de la columna HiTrap SP. Top2α eluyó a NaCl 500 mM en un gradiente de NaCl 2-800 mM. Las fracciones agrupadas se diluyeron tres veces por 20 mM de fosfato de potasio pH 7,4, y se cargan a la columna GL 5/50 del Mono S. Top2α se eluyó a NaCl 500 mM y se combinaron las fracciones, se dializaron durante la noche contra 50% de glicerol, 15 mM de fosfato de sodio pH 7,5, NaCl 150 mM, EDTA 0,1 mM, PMSF 1 mM y 5 mM 2-mercaptoetanol, y se almacena a -20 ° DO. La fracción final Top2α es más del 90% puro y tiene una actividad específica de al menos 10
6 unidades /mg con una unidad se define como la cantidad de enzima necesaria para relajarse 0,5 g de ADN de pUC19 en 30 min.
Los sustratos de ADN
sustrato de ADN fluorescente (Integrated DNA Technologies, Inc., Coralville, IA) fue diseñado similar a lo que se describió previamente (Smiley, Collins et al., 2007), un dúplex de oligonucleótidos de 29 pb que contiene una sitio de escisión top2 en el centro y Alexa Fluor 488 en el extremo 3 '. ADN plásmido pUC19 purificado por CsCl doble anillado, se utilizó la extracción con fenol-cloroformo y precipitación con alcohol para la relajación y la escisión ensayos (Sander y Hsieh 1983).
Pre-HTS (High Throughput Screening) Anisotropía Ensayo
En 50 l de tampón de reacción que contiene 10 mM Top2 Tris-HCl pH 7,9, mM MgCl 5
2, NaCl 50 mM, EDTA 0,1 mM, ATP 0,5 mM. 50 nM Alexa Fluor 488 DNA marcado, 1,25 M Top2α humano, y tenipósido (VM26) en un intervalo de concentraciones de 60 a 300 mM, la mezcla de reacción se incubó a 37 ° C durante 30 minutos. Antes de medir la anisotropía,
4 se añadió NaClO para dar una concentración final de 250 mM. Experimentos probar los efectos de NaClO
4 concentraciones mostró que dentro de un rango de 100 a 750 mM tiene un efecto similar en la modulación de anisotropía de fluorescencia (que se detalla en la sección Resultados).
Para probar los efectos de orden de adición, 50 nM Alexa Fluor 488 DNA marcado, 250 nM humana Top2α, y NaClO 250 mM
4 con o sin 300 mM VM26 se introdujeron en un orden diferente al tampón de reacción 50 microlitros. El tiempo de reacción global fue de 30 min a 37 ° C, a menos que se indique lo contrario.
Para examinar los éxitos positivos por ensayo de anisotropía en condiciones a granel, la reacción se realizó en 50 l de tampón de reacción que contenía 50 nM Alexa Fluor 488 ADN marcada con, 250 nM humana Top2α, y el compuesto de ensayo 15 mM. La mezcla de reacción se incubó a 37 ° C durante 30 minutos antes de añadir NaClO
4.
ensayos de anisotropía en condiciones a granel se midieron por Fluorolog-3 Espectrofluorímetro (Hiroba Scientific) equipado con dos polarizadores en las rutas de excitación y emisión utilizando el método de L-formato. La longitud de onda de excitación y emisión fueron 492 nm y 515 nm, respectivamente, cada uno con un ancho de ranura de 2 nm, y el valor de ganancia G fijado en 1.
High Throughput Screening anisotropía
Para HTS , las proyecciones se realizaron en el Centro de Investigación Genómica de la Academia Sinica en Taiwán, siguiendo el protocolo previamente publicado y el uso de la biblioteca química generados y recogidos en ellos [20]. En pocas palabras, las proyecciones se realizaron en placas de 1536 pocillos usando el sistema de la selección de alto rendimiento (HTS) fabricado por sistemas GNF (GNF, San Diego, CA). El sistema está integrado con HTS dispensadores, una herramienta de transferencia de 1,536 pines, incubadoras y un lector de placas Viewlux (Perkin Elmer Inc.). El volumen de reacción fue de 4 l por pocillo que contiene 100 nM Alexa Fluor 488 de ADN marcado con con 150 nM humana Top2α en el tampón de reacción. Después de 30 minutos de incubación a 37 ° C, 100 mM NaClO
4 se añadió a cada pocillo para detener la reacción y se midió el valor de anisotropía. El cribado se llevó a cabo con una biblioteca representativa de 100.000 productos químicos a una concentración de 12,5 mM. 300 M tenipósido (VM26) se incluyó como control positivo, mientras que 5% de DMSO era el control negativo. Z se calculó utilizando la siguiente formulación:. SD de MAX y MIN son SD de la desviación estándar de los controles positivos y negativos. Un procedimiento de cribado adecuado para la plataforma de HTS tendrá un factor Z superior al 0,5. Con la primera vuelta de selección de más de 100.000 productos químicos, 107 compuestos de ensayo se calificó como positivo por los criterios que se describen en el texto. Segunda ronda de selección se llevó a cabo mediante pruebas de las lecturas de anisotropía a 8 concentraciones diferentes de cada compuesto candidato utilizando diluciones de dos veces a partir de 12,5 mM. Sólo los compuestos que resulta en 20% de incremento en las señales detectadas a través de los controles negativos, y que muestra las respuestas dependientes de la dosis en dos o más puntos se definieron como hits. Había 54 éxitos obtenidos en la segunda ronda de selección.
Ensayos
Relajación
20 l de tampón de reacción que contenía 8,5 nM Top2 negativo supercoiled pUC19, 0,125 nM humana Top2α con 5% de DMSO, o 60 micras compuestos de ensayo, las reacciones se realizaron a 37 ° C durante 5, 10 o 15 minutos, terminó por adición de SDS al 0,25%, EDTA a 10 mM y proteinasa K a 0,4 mg /ml, se incubaron adicionalmente a 50 ° C durante 1 hora, y se analizaron por electroforesis en gel de agarosa al 1,2%.
Escote Ensayos
en un tampón de reacción que contiene 8,5 nM negativo superenrollado pUC19, 3,75 nM humana Top2α y 150 tenipósido mu M (VM26) o como se especifica en los textos, las reacciones se incubaron a 37 ° C durante 15 minutos, y se terminó por SDS añadiendo a 0,25%, EDTA a 10 mM y proteinasa K a 0,4 mg /ml, o mediante la adición de NaClO
4-500 mM durante 2 minutos seguido de la adición de proteinasa K a 0,4 mg /ml. La incubación se continuó a 50 ° C durante 1 hora y las muestras se analizaron por electroforesis en gel de agarosa al 1,2% que contenía 0,15 g /ml de bromuro de etidio. Para el ensayo de las reacciones de escisión con un sustrato de ADN lineal, pUC19 se digirió con ScaI para producir una molécula de longitud unidad. La enzima de restricción tratado ADN se purificó y se usó en las reacciones de escisión.
Para probar los efectos de los éxitos positivos en reacción de escisión, los compuestos de ensayo se diluyeron en tres concentraciones diferentes, 16, 64 y 256 mM, y las reacciones se llevaron a cabo y analizado como se describió anteriormente.
glicerol gradiente de sedimentación y de detección de la topoisomerasa por inmunotransferencias
un gradiente de 3,5 ml de glicerol 30-60% en tampón de reacción Top2 se preparó en un tubo de polialómero centrifugación , y en capas con un 80 l de mezclas de reacción Top2 como se describe en los textos. La centrifugación se realizó a 55.000 rpm durante 16 horas a 20 ° C en TFT-80.4 Rotor (Thermo Scientific). Una aguja de calibre 22 se utiliza para perforar el tubo y las fracciones se recogieron de la parte inferior. 50 muestra l de cada fracción se cargó en una membrana de PVDF puesto en remojo previamente usando un colector de transferencia en ranura (Hoefer PR 648) aparato. Después de la carga, la membrana se bloqueó durante 1 hora a temperatura ambiente en 5% de leche desnatada hecho en tampón TBS (25 mM Tris-HCl pH 8,0, NaCl 125 mM). membrana bloqueada se incubó durante la noche a 4 ° C con un anticuerpo de cabra contra Top2α humana (1:5000; Santa Cruz Biotechnology, sc-5348). La membrana se procesó para quimioluminiscencia ECL con el reactivo (Millipore, WBKLS0500) siguiendo las recomendaciones del fabricante.
Ensayo de citotoxicidad
Ensayo de citotoxicidad se realizó con células HCT116 utilizando el CellTiter 96 AQ
ueous Una célula de soluciones kit Ensayo de proliferación de acuerdo con el protocolo del fabricante (Promega). Brevemente, las células HCT116 se sembraron en las placas de 96 pocillos a una densidad celular de 7.500 células por pocillo en DMEM durante 24 horas. Después de la eliminación de medio, las células en crecimiento exponencial se incubaron con 1 l de compuesto de ensayo a 6 diluciones de dos veces en un volumen final de 100 l en cada pocillo. Después de una incubación de 72 horas a 37 ° C, las células se rellenaron con medio fresco que contiene 10 l de MTS tetrazolio y se incubaron durante una hora. El formazan convertida por las células vivas se monitorizó a 490 nm. Las células de control contienen 1% de DMSO sin compuesto de ensayo. Todos los experimentos se repitieron al menos tres veces.
Resultados
Se utilizó humano de longitud completa Top2α y marcado con fluoróforo oligonucleótido purificado, de doble cadena que contiene un sitio de unión de la topoisomerasa para desarrollar la fluorescencia basadas ensayo (Fig 1A). El esquema de detección de compuestos Top2α-segmentación se ilustra esquemáticamente en la figura 1B. Este ensayo se basa en la medición de la polarizabilidad de fluorescencia (anisotropía) como una indicación de si una proteína se une a ADN fluoróforo de etiquetado. Tras la excitación con luz polarizada, la emisión del fluoróforo del sustrato de ADN si permanecer inmóviles, también está polarizada. difusión de rotación cambia la dirección del momento de transición y provoca la despolarización. El complejo topoisomerasa-DNA, covalente o no covalente, tiene una tasa de movimiento de rotación inferior y resultados en una anisotropía mayor. Por otro lado, el ADN libre tiene una tasa de volteo más alto y por lo tanto una anisotropía inferior. Desde ensayo de anisotropía puede ser fácilmente automatizado, podemos llevar a cabo la selección de alto rendimiento (HTS) para identificar compuestos de plomo potenciales dirigidos contra Top2α. Sin embargo, un desafío clave para este ensayo de selección para que funcione correctamente es diferenciar los complejos ADN-Top2α estabilizado con las drogas desde los complejos ADN-Top2α bipartitos. Tendremos un reactivo para interrumpir el último complejo pero mantener la anterior.
(A) El sustrato de ADN fluorescente se sintetizó con un sitio de escisión Top2 conocido (indicado por las flechas). Alexa Fluor 488 marcado por asterisco se marcó en el extremo 3 '. (B) Representación esquemática de la detección de drogas Top2α a base de anisotropía. El complejo topoisomerasa-DNA, covalente o no covalente, tiene una difusión más lenta de rotación y los resultados en una anisotropía mayor. Después de tratarse con un agente proteína-disociar, se eliminó el no covalente unido Top2α, y el ADN libre tiene una anisotropía inferior. Si un agente Top2α de metas estabilizado enzima ADN complejos covalentes, la anisotropía se mantendrá alto.
El tratamiento con NaClO
4 puede resultar en un aumento de la anisotropía depende de la presencia de un anti- tenipósido medicamento contra el cáncer (VM26)
Uso tenipósido (VM26) como un compuesto modelo para nuestro ensayo de selección, hemos probado si una serie de reactivos desnaturalizantes comúnmente empleados incluyendo alcalino y SDS puede permitir para la detección de la estabilidad mejorada de la Top2α complejos -ADN en presencia de un fármaco anti-cáncer. Dado que las formas alcalinos finos precipitados con Mg
++ en el tampón de reacción y SDS genera burbujas minúsculas, ambos reactivos crean artefactos inaceptables para los ensayos de fluorescencia basado en microtitulación. Sin embargo, descubrimos que un fuerte reactivo caotrópico NaClO
4 cumple con nuestros requisitos como reactivo de disociación en los ensayos de fluorescencia. Después de la adición de NaClO
4-250 mM a la mezcla de reacción de unión, la estabilidad de los complejos Top2α de ADN tal como se comprueba por la anisotropía de fluorescencia muestra un aumento dependiente de la dosis clara como concentraciones VM26 que varían de 0 a 300 mM (Fig 2A ). Sin añadir NaClO
4 la anisotropía sigue siendo el mismo, independientemente de la concentración VM26. Para confirmar aún más que el cambio de anisotropía inducida por VM26 es dependiente de la enzima, se realizó la medición de anisotropía sin topoisomerasa en las condiciones de reacción por lo demás idénticas. De los resultados mostrados en la figura 2B, se confirmó que aumento dependiente de drogas de la anisotropía después del tratamiento con NaClO
fue mediada por Top2α 4.
(A) Las reacciones de ADN Alexa Fluor 488 marcado con con Top2α humano eran llevado a cabo con concentraciones VM26 de 60, 120, 180, 240 y 300 mM. Se observó un aumento dependiente de la dosis en la anisotropía con concentraciones crecientes VM26 si las reacciones se terminaron con NaClO
4 (cuadrado sólido), pero no sin ella (triángulo vacío). (B) El aumento dependiente de la dosis de anisotropía con el aumento se observó VM26 cuando las reacciones contenían Top2α humana (cuadrado sólido), pero no sin ella (cuadrado vacío).
La adición de NaClO
4 abroga Top2α unión a ADN, pero conserva los complejos ternarios con enzimas de ADN estabilizado con las drogas
con el fin de examinar si el aumento de la anisotropía después de la adición de NaClO
4 proviene de los complejos de ADN con destino a Top2α, hemos probado los efectos de la alteración del orden de adición de los componentes clave en estas reacciones. En ausencia de NaClO
4, la anisotropía de los complejos de ADN-enzima es 0,19 (Fig 3A-II), y la adición de NaClO
4 reduce la anisotropía de 0,06 (Fig 3A-III), un valor cercano a la de oligonucleótido libre (Fig 3A-I). Este resultado demuestra que NaClO
4 es capaz de disociarse de la enzima de ADN. Si bien la formación de enzima-DNA y tenipósido (VM26) resultados complejos ternarios en NaClO
anisotropía 4-resistente (Fig 3A-IV), la incubación sin Mg
++ (Fig 3A-V) o pre-incubación de la enzima con NaClO
4 antes de la adición de ADN, independientemente de la presencia de VM26, conduce a una anisotropía inferior (Fig 3A-VI y VII). Este resultado sugiere que NaClO
4 es capaz de inactivar la enzima y la capacidad de inhibir la enzima para formar complejos unidos de ADN. Desde Mg
++ se requiere para las actividades enzimáticas de las topoisomerasas, el requisito de Mg
++ sugiere que sencilla de unión no es suficiente para la formación de NaClO complejo
4-resistente. A excepción de los complejos ternarios estabilizadas-VM26, el tratamiento con NaClO
4 en todas las demás condiciones se reduce la anisotropía a un valor similar al sustrato de ADN libre, confirmando que NaClO
4 es capaz de interrumpir la enzima ADN complejos sin un agente Top2α de metas. Para demostrar la dependencia de la concentración de NaClO
4 para permitir la detección específica de los complejos enzima-ADN estabilizados-VM26, analizamos la anisotropía del complejo binario después de añadir diferentes cantidades de NaClO
4 (Fig 3B). Los niveles de disociación máximas se alcanzaron en una NaClO
4 concentración de 100 mM, con el IC
50 a 40 mM, y hay pequeñas variaciones hasta 750 mM. Así, hemos demostrado que NaClO
4 es un agente eficaz para interrumpir los complejos proteína /ADN con un amplio intervalo de concentraciones entre 100-750 mM, y puede ser adaptado para el uso en HTS para los agentes Top2α de metas.
(a) se observó el aumento VM26-dependiente en la anisotropía cuando se terminó la reacción con NaClO
4 (reacción IV vs reacción III), y no cuando se añadió NaClO
4 en presencia de Top2α antes la adición de ADN, independientemente de la adición de VM26 (reacciones VI y VII vs Reacción IV). Anisotropía observada en los controles fue sólo el ADN (Reacción I), ADN /Top2α sin VM26 (Reacción II), y la incubación sin Mg
++ (Reacción V). (B) Optimización de NaClO
4 concentración de ensayo de anisotropía. La reacción se realizó en 50 l de tampón de reacción Top2 con 300 mM VM26, 50 nM Alexa Fluor 488 DNA marcado y 250 nM humana Top2α. La mezcla de reacción se incubó a 37 ° C durante 30 minutos. Antes de medir la anisotropía, NaClO
4 se añadió a cada mezcla de reacción para dar una concentración final de hasta 750 mM. La extensión máxima de disociación se alcanzó a una concentración de 100 mM o por encima. (C) La anisotropía observada con etopósido (VP16), mamsa, mitoxantrona (MXT), y con tenipósido (VM26) como controles positivos, después del tratamiento con NaClO 200 mM
4. Las concentraciones de estos fármacos Top2α conocidos utilizados aquí eran 300 micras para VP16 y VM26, y 15 mM de mamsa y MXT.
Para probar que nuestros ensayos de anisotropía pueden ser eficaces en la identificación de otros conocidos Top2α de metas fármacos contra el cáncer, además de tenipósido (VM26), se midió la anisotropía después de NaClO
4 el tratamiento con etopósido (VP16), mamsa, y mitoxantrona (Fig. 3C). Similares a la medida con tenipósido, los tres conocidos fármacos contra el cáncer producidos lecturas de anisotropía encima de los controles.
NaClO
4 puede promover la generación de ADN mellado en los complejos ternarios Top2α estabilizado con las drogas
Los efectos de NaClO
4 en la interrupción de complejos de ADN con destino a Top2α se investigaron con un sustrato de oligonucleótido monitoreado mediante ensayos de anisotropía de fluorescencia. Para examinar más a fondo las posibles funciones mecanicistas de NaClO
4 en reacciones Top2α, decidimos utilizar ADN plásmido que el sustrato que permite la aplicación de electroforesis en gel de agarosa para examinar los cambios estructurales de ADN. Con un fuerte SDS desnaturalizante de terminar las reacciones con ADN de plásmido, la presencia de un fármaco anti-cáncer, tales como el tenipósido (VM26) puede atrapar los complejos escindibles y aumentar los productos de ADN linealizado y mellado. Hemos llevado a cabo experimentos para investigar los productos de ADN generados a partir de una mezcla de reacción que contiene Top2α-ADN-VM26 complejos ternarios que fueron despedidos, ya sea con SDS o NaClO
4. Para eliminar las proteínas que se asocian con el ADN después del tratamiento con estos reactivos de disociación, las mezclas de reacción detenidas fueron tratados con proteinasa K antes de su análisis con electroforesis en gel de agarosa. Los productos de reacción después de haber sido terminado con SDS mostraron el patrón esperado de la aparición de ADN linealizado predominantemente, y algunas especies de muescas también (Fig 4A). En un interesante contraste, los productos de reacción generados a partir de NaClO
4 de tratamiento produjeron productos de ADN más mellados y forma menos linealizado. Con NaClO
4 para detener las reacciones, la producción de formas mellados y linealizadas aumento en paralelo al aumento de las concentraciones VM26 en estas reacciones (Fig 4B), lo que demuestra que ambos productos fueron probablemente generadas a través de la acción de VM26 en atrapar los complejos escindibles. Informe anterior ya mostró que VM26 promueve la formación de mellas individuales de ADN de cadena, además de roturas de doble hebra, dependiendo de la concertedness de la escisión de dos protómeros en Top2 dímero [21]. Tanto los datos biológicos bioquímicos y estructurales demostraron que cada protómero se puede unir una molécula de fármaco individual, la presencia de lo que puede afectar la escisión /religación mediado por la enzima dimérica [22], [23]. El resultado que NaClO
4 tiende a generar productos de escisión menos linealizadas, y la forma más muescas, es posiblemente debido a que es un desnaturalizante menos potente que el SDS y menos eficiente para inducir la formación de complejos de escisión. Así se puede esperar observar productos más linealizado con la presencia de más enzima y complejos consecuentemente más escindibles. Hemos podido demostrar que mediante el aumento de la enzima para la estequiometría de ADN, los productos de ADN linealizados aumentaron de forma concomitante con la forma mellada en las que las reacciones se terminaron con NaClO
4 (Fig 4C). En las mismas condiciones de reacción pero terminado con SDS, los productos fueron linealizados más degradada para producir fragmentos de ADN más pequeños que la molécula de longitud unidad. escisión de ADN y nicking inducida por NaClO
4 no se limitan a los sustratos de ADN circular. Podríamos demostrar fácilmente la escisión de ADN con sustrato lineal a relaciones enzima /ADN más altas (figura 4D). La degradación de ADN para generar moléculas de longitud sub-completos de NaClO
4 tratamiento es debido a la estrecha separación entre dos muescas en hebras yuxtapuestas y también algunas división de doble hebra en tales condiciones. Sin embargo, en las mismas condiciones de la adición de SDS puede inducir más extensas degradaciones de ADN, demostrando que SDS es un desnaturalizante fuerte y más eficiente en el desencadenamiento de la reacción de desdoblamiento Top2α. Curiosamente, cuando SDS y NaClO
4 se añadieron secuencialmente, SDS puede promover la generación de productos de ADN más pequeños, incluso cuando se añadió después de NaClO
4. Este resultado sugiere de nuevo que NaClO
4 no se interrumpa por completo complejos ternarios enzima /ADN /drogas, que todavía mantiene su sensibilidad hacia la SDS en la promoción más complejos de escisión.
(A) Las reacciones de Top2α humana y el plásmido pUC19 ADN se termina, ya sea con NaClO
4 o SDS. La adición de NaClO
4-100 mM conduce a la formación de productos de ADN más mellados mientras que la adición de los resultados de SDS en una preferencia de los lineales. Las reacciones se llevaron a cabo con 8,5 nM pUC19, 3,75 nM Top2α, y 100 mM VM26, terminado con la adición de NaClO
4 o SDS, los productos de reacción fueron tratados con proteinasa K, y se analizaron por electroforesis en gel de agarosa al 1,2% que contiene 0,15 mg /ml de bromuro de etidio. (B) ensayos de escisión de ADN se realizaron en condiciones similares, excepto con concentraciones crecientes de VM26 seguido de la adición de NaClO
4. Un aumento en los productos de escisión de ADN mellado se observó con cantidades más altas de VM26. ensayos de escisión de ADN (C) El plásmido se llevaron a cabo utilizando la enzima diferente a las relaciones de ADN como se indica. productos de ADN lineal (de longitud completa o de longitud sub-total) procedentes del tratamiento de SDS, y tanto el ADN mellado y lineal a partir de NaClO aumento
4 el tratamiento con mayor enzima a las relaciones de ADN. (D) Las reacciones en presencia de diversas concentraciones de VM26 contenían pUC19 lineales como sustrato con una relación enzima /ADN de 20, seguido de la adición de NaClO
4 o SDS, o ambos en secuencia, para detener las reacciones. Los marcadores de tamaño, y pUC19 lineales fueron cargados en los dos carriles de más a la izquierda. Posiciones de ADN fueron marcados como NC (mellado circular), L (lineal), NSC (superenrollado negativo) y RC (relajado).
complejos ternarios
4 tratados con NaClO analizada por ultracentrifugación en gradientes de glicerol
Se aplicaron ultracentrifugación en gradientes de glicerol para investigar la estabilidad de los complejos de ADN-Top2α después del tratamiento de NaClO
4, y el efecto de un fármaco anti-cáncer. centrifugación en gradiente de glicerol se utiliza a menudo para macromoléculas separados en función de su tamaño y forma. Incubamos Top2α con ADN de plásmido ya sea en presencia o ausencia de VM26, y lo aplicó a la gradiente de glicerol directamente o después del tratamiento con NaClO
4. Las fracciones se recogieron después de la centrifugación y las ubicaciones de Top2α se determinaron por transferencias de Western con anticuerpo contra Top2α. En ausencia de VM26, Top2α sedimenta más hacia la parte inferior sin NaClO
4 de tratamiento (Fig 5, carriles 1 vs 3). La presencia de NaClO
4 turnos Top2α a una fracción más ligera, en una posición correspondiente a la enzima libre (Fig 5, carriles 3 vs 5), lo que confirma la capacidad de NaClO
4 para interrumpir complejo enzima-ADN en el ausencia de un fármaco anti-cáncer. En presencia de VM26, el tratamiento con NaClO
4 no cambiaba groseramente la sedimentación de Top2α, lo que sugiere que NaClO
4 todavía mantiene la mayoría de los complejos ternarios (Fig 5, carriles 2 vs 4). Los experimentos tanto de anisotropía de fluorescencia y el apoyo de glicerol gradiente de sedimentación la noción de que NaClO
4 de tratamiento proporciona un medio para diferenciar la estabilidad de los complejos Top2α de ADN dependiendo de la presencia de un fármaco anti-cáncer, lo que nos ofrecen un enfoque para el cribado automatizado ensayo y por lo que es posible para el uso en la plataforma de HTS
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la solución de gradiente de glicerol es en capas en un tubo de polialómero a partir de 60% a 30% de glicerol. La reacción para Top2α /DNA formación de complejos se llevó a cabo en 80 l de una solución que contiene 100 mM VM26, 34 nM pUC19 y 3,75 nM humana Top2α. La mezcla de reacción se cargó en la parte superior de un gradiente de glicerol 30-60%, y el tubo fue rematado con aceite mineral.