Extracto
El cáncer de próstata (CaP) es la principal causa de muerte entre los hombres. Actualmente se estima que las respuestas inflamatorias están relacionados con el 15-20% de todas las muertes por cáncer en el mundo. PCa está dominada por las complicaciones derivadas de la metástasis en el hueso donde las células tumorales interactúan con el microambiente de la médula alterar el equilibrio entre la formación de hueso y la degradación. Sin embargo, la naturaleza molecular de esta interacción no se conoce completamente. Hemoxigenasa-1 (HO-1) contrarresta el daño oxidativo y la inflamación. Estudios previos de nuestro laboratorio mostraron que HO-1 está implicada en el CaP, lo que demuestra que endógena HO-1 inhibe hueso derivados de la próstata células cancerosas proliferación, invasión y migración y disminuye el crecimiento del tumor y la angiogénesis
in vivo
. El objetivo de este trabajo fue analizar el impacto de HO-1 en las células de CaP moduladas sobre la proliferación de osteoblastos
in vitro Opiniones y en la remodelación ósea
in vivo
. El uso de un sistema de co-cultivo de células PC3 con osteoblastos ratones primarios (PMO), hemos demostrado que HO-1 inducción farmacológica (tratamiento hemina) abrogó la disminución de la proliferación de las PMO inducida por células de CaP y la disminución en la expresión de factores de osteoclastos-modulación en los osteoblastos . No se detectaron cambios en la expresión de genes implicados en la diferenciación de osteoblastos. Sin embargo, el co-cultivo de células de hemina pretratadas PC3 (PC3) Hem con oficinas de gestión provocó un estado oxidativo y activado FoxO señalización en los osteoblastos. El porcentaje de osteoblastos activos positivos de HO-1 aumentó en calvarias explantes co-cultivadas con células PC3 Hem. Se detectó nuclear de HO-1 de expresión en los tumores generados por la inyección de hueso in vivo de HO-1 células PC3 transfectadas estables (PC3HO-1) en el fémur de
SCID
ratones. Estos resultados sugieren que HO-1 tiene el potencial de modificar el microambiente de la médula impactar en la metástasis ósea CaP
Visto:. Ferrando M, Wan X, Meiss R, Yang J, De Siervi A, Navone N, et al . (2013) hemoxigenasa-1 (HO-1) Expresión en células de cáncer de próstata modula la respuesta oxidativo en células óseas. PLoS ONE 8 (11): e80315. doi: 10.1371 /journal.pone.0080315
Editor: Zoran Culig, Universidad Médica de Innsbruck, Austria |
Recibido: 29 Agosto, 2013; Aceptado: 6 Octubre 2013; Publicado: 4 de noviembre 2013
Derechos de Autor © 2013 Ferrando et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por becas de la Universidad de Buenos Aires, Argentina, UBACyT (20020100100179) y ANPCYT (PICT RAICES 2010-0431). M. F. celebró becas de CONICET y la UICC Tecnología Internacional del Cáncer de becas de transferencia. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
las metástasis óseas dominan el cuadro clínico del cáncer de próstata avanzado (PCA) y son responsables de la mayor parte de la mortalidad y la morbilidad de la enfermedad. Metástasis ósea pueden tener o bien un osteolítica (resorción ósea) o un osteoblástica (producción de hueso) fenotipo. PCa característicamente produce lesiones osteoblásticas en el hueso, aunque un componente osteolítica está siempre presente.
Se ha sugerido que la inflamación aumenta la tumorigénesis de próstata [1]. Las citocinas, quimiocinas y metaloproteinasas de la matriz son parte de una red proinflamatoria que contribuye a la progresión maligna [2]. De hecho, los factores proinflamatorias secretadas por CaP y las células óseas y la posterior liberado de los factores de la matriz orgánica del hueso, median una interacción paracrina /autocrina entre CaP células, los osteoblastos y los osteoclastos, que en última instancia a determinar el fenotipo de hueso y la progresión de CaP [3 , 4].
El estrés oxidativo es una consecuencia natural de los procesos inflamatorios y actúa como un modulador de la función de los tejidos mineralizados [5]. Afecta a la formación de hueso mediante la inhibición de la diferenciación de los osteoblastos y la promoción de la apoptosis [6]. Estos efectos están mediados en parte por especies reactivas del oxígeno (ROS) que se generan en el contexto de estrés oxidativo. Las células contrarrestar los efectos adversos de ROS mediante la activación de diversos mecanismos de defensa, incluyendo la inducción de las enzimas de barrido de radicales libres tales como superóxido de manganeso dismutasa (MnSOD), catalasa, y también genes de reparación del ADN. Esta respuesta requiere la activación de una familia de factores ubicuos conocidos como cuadro de transcripción forkhead O (FoxO) [7], que a través de la interacción con β-catenina reduce el estrés oxidativo y promueve la supervivencia osteoblastos [6].
hemo oxigenasa 1 (HO-1), la enzima limitante de la velocidad en la degradación del hemo, se demostró para conferir citoprotección contra el estrés oxidativo y la inflamación en varios modelos animales [8]. Los informes previos de nuestro laboratorio documentados por primera vez la expresión nuclear de HO-1 en los carcinomas de próstata primarios humanos [9]. También documentamos que HO-1 inhibe la proliferación celular, la migración y la invasión
in vitro
y deteriora CaP crecimiento del tumor
in vivo
[10]. Además, hemos establecido con anterioridad un papel clave para la HO-1 como modulador del interruptor angiogénico en la carcinogénesis de próstata [11]. Por otra parte, hemos demostrado evidencia de que la función anti-angiogénico de HO-1 fue mediada por la represión del factor nuclear kappa-luz-cadena-potenciador de células activadas B (NF-kB) vía [11] de señalización. Recientemente, se informó de una nueva función de HO-1 en el CaP. Hemos demostrado que la HO-1 modula hacia abajo-AR actividad transcripcional al interferir con la señalización de STAT3 y presentó pruebas de su papel más allá de la degradación del hemo [12].
Los estudios presentados aquí se llevaron a cabo utilizando una línea de células de CaP osteolítica del hueso derivados (PC3) que se ha demostrado que inhibe la proliferación de osteoblastos
in vitro
en un sistema de co-cultivo con osteoblastos primarios de ratón (PMOs) [13]. En este trabajo se informe de los datos que apoyan una nueva función de HO-1 en la interacción entre las células de CaP y hueso. Se encontró que HO-1 inducción en células PC3 restauró la proliferación de osteoblastos, que fue inhibida durante el co-cultivo con células PC3 parentales. Nuestros estudios sugieren que estos efectos están mediados por la activación de la señalización en FoxO osteoblastos. células PC3 que sobreexpresan HO-1 (PC3HO-1) que crecen en la médula de los ratones, los tumores producidos con la localización nuclear de HO-1 como se detecta por inmunohistoquímica. Estos datos indican que HO-1 juega un papel en la progresión de la PCa en el hueso. Una mejor comprensión de los mecanismos moleculares que subyacen a la interacción entre las células de CaP y microambiente óseo puede ayudar a identificar nuevas dianas para la intervención farmacológica en esta enfermedad.
Materiales y Métodos
Cultivos de Células y anticuerpos
el PC3 línea celular de cáncer de próstata se obtuvo de la American Type Culture Collection (Manassas, VA, EE.UU.) y se cultivaron de forma rutinaria en medio RPMI 1640 (Invitrogen, CA, EE.UU.) suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS). Se generaron células transfectadas estables PC3 (PC3HO-1 y PC3βgal) como se ha descrito anteriormente [10]. La línea celular de mioblastos de ratón C2C12 se obtuvo de la American Type Culture Collection (Manassas, VA, EE.UU.) y se cultivó en DMEM bajo en glucosa (Invitrogen, CA, EE.UU.) con 10% de FBS. Los cultivos primarios de osteoblastos ratones (PMOs) fueron establecidos por un procedimiento publicado anteriormente [13] y se obtuvieron de la bóveda craneal de ratones CD1 recién nacidos sacrificaron 4 días después del nacimiento. Las células aisladas se sembraron en α-MEM (Invitrogen, CA, EE.UU.) más el 10% de SFB durante 48 h. Las oficinas de gestión fueron posteriormente con tripsina y se volvieron a sembrar en placas de cultivo para realizar experimentos. Los anticuerpos anti-HO-1 era de Stressgen Biotecnologías, Corp. (San Diego, CA, EE.UU.), anti-β-catenina fue de BD Transducción Laboratorios ™ (CA, EE.UU.), anti-β-actina fue de Señalización Celular Tecnología (Beverly, MA, EE.UU.), anti-ciclina B1, anti-ciclina A, anti-ciclina D1, anti-p21, anti-β-tubulina, anti-ratón y anti-conejo anticuerpos secundarios eran de Santa Cruz Biotechnology Inc. ( CA, EE.UU.) y Alexa Fluor ® 594-conjugado anticuerpo secundario de Invitrogen (CA, EE.UU.).
hemina pretratamiento de células de CaP y el sistema de co-cultivo
Un
In vitro
bicompartment sistema de cultivo se utilizó como un modelo de metástasis óseas de CaP como se describió previamente ligeramente modificada [13]. En resumen, se sembraron en el día 0 células PC3 (10.500 células /cm
2) en insertos de cultivo celular (0,4 mm de poro; Falcon /Becton Dickinson Labware, Franklin Lakes, Nueva Jersey, EE.UU.) y en el día 1 que eran tratado con hemina (80 mM, Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EE.UU.), un potente inductor de HO-1 (PC3 Hem). Los controles recibieron medio fresco. Las oficinas de gestión también se sembraron en el día 1 en placas de cultivo de tejidos (7.300 células /cm
2). El día 2, los insertos que contienen las células PC3 (pre-tratados o no con hemina) se lavaron extensamente con PBS. A continuación, los insertos se colocaron en placas de cultivo de tejidos que contienen los PMOs manera que los dos tipos de células diferentes comparten el medio de cultivo, pero no estaban en contacto físico. Co-cultivo de células PC3 con PMOs se realizó con α-MEM más un 2% de FBS durante 24 h. En el día 3, las células se recogieron y se analizaron diferentes parámetros. Como control, cada tipo de células (células PC3 pre-tratados o no con hemina y PMO) se cultivó solo. Co-cultivos de células C2C12 y PC3 se realizaron en las mismas condiciones como las PMO y células PC3. Los cultivos se realizaron por triplicado y cada experimento se ensayó tres veces.
ensayo mitogénico
proliferación y la síntesis de ADN se evaluó mediante la adición de [
3H] -timidina (Amersham Biosciencies) durante la final 3 h de co-cultivo y la incorporación se midió como se describe en otro lugar [14].
el aislamiento de ARN y RT-qPCR (transcripción inversa PCR cuantitativa)
el ARN total se aisló con el RNeasy Mini Kit (Qiagen). Los ADNc se sintetizaron con RevertAid RT (Fermentas) y se amplificó mediante amplificación por PCR en tiempo real con Taq ADN polimerasa (Fermentas). Los cebadores se diseñaron utilizando Beacon Diseñador 5 y probados con la UCSC Genome Browser URL de inicio. La PCR se realizó en un motor de Opticon ADN (MJ Research). secuencias de los cebadores humanos se dan como sigue: ACTB 5'-AAGATCATTGCTCCTCCTGAGC-3 'y 5'-CATACTCCTGCTTGCTGATCCA-3'; HO-1 5'-GAGTGTAAGGACCCATCGGA-3 'y 5'-GCCAGCAACAAAGTGCAAG-3'; PTHrP 5'-GTCTCAGCCGCCGCCTCAA-3 'y 5'-GGAAGAATCGTCGCCGTAAA-3'; UPA 5'-GAGATCACTGGCTTTGGAAAA-3 'y 5'-CCAGCTCACAATTCCAGTCA-3'; TGF-β1 5'-TACCTGAACCCGTGTTGCTC-3 'y 5'-GCGAAAGCCCTCAATTTCCC-3'. secuencias de cebador de ratón se dan como sigue: ACTB 5'-CCGCACGACAACCGCACCAT-3 'y 5'-CGGTTGGCCTTAGGGTTCAGGGGGG-3'; Runx-2 5'-CCGCACGACAACCGCACCAT-3 'y 5'-AGGCATTTCGGAGCTCGGCG-3'; ALP 5'-AACCCAGACACAAGCATTCC-3 'y 5'-GAGACATTTTCCCGTTCACC-3'; COL1A1 5'-CATGTTCAGCTTTGTGGACCT-3 'y 5'-GCAGCTGACTTCAGGGATGT-3'; COL1A2 5'-GCAGGTTCACCTACTCTGTCCT-3 'y 5'-CTTGCCCCATTCATTTGTCT-3'; OCN 5'-GCAGCTTGGTGCACACCTAG-3 'y 5'-GGAGCTGCTGTGACATCCATAC-3'; RANKL 5'-TGATTCATGTAGGAGAATTAAACAGG-3 'y 5'-GATGTGCTGTGATCCAACGA-3'; OPG 5'-GAAGGGCGCTACCTTGAGAT-3 'y 5'-GCAAACTGTATTTCGCTCTGG-3'; CSF-1 5'-CAACAGCTTTGCTAAGTGCTCTA-3 'y 5'-CACTGCTAGGGGTGGCTTTA-3'; OPN 5'-CTTTCACTCCAATCGTCCCTA-3 'y 5'-GCTCTCTTTGGAATGCTCAAGT-3'; CCL2 5'-TGCTACTCATTAACCAGCAAGAT-3 'y 5'-TGCTTGAGGTGGTTGTGGAA-3'; IL-6 5'-CTGCAAGAGACTTCCATCCAGTT-3 'y 5'-GAAGTAGGGAAGGCCGTGG-3'; MnSOD 5'-CCACACATTAACGCGCAGATC-3 'y 5'-TAACATCTCCCTT GGCCAGAGC-3'; catalasa 5'-3'-TTGCTGAAGTTGAACAGATGG y 5'-3'-ATCACGCTGGTAGTTGGC.
Western blot
Para el Western Blot, 50 g de proteína se separó en geles de poliacrilamida al 12% de Tris-glicina y transferidos a membranas de nitrocelulosa (BioRad POWERPAC Básico). Las proteínas específicas se detectaron por quimioluminiscencia (Amersham) como se describe anteriormente [10].
Los plásmidos, transfecciones y ensayo indicador de luciferasa
Un TOP-flash construcción de gen informador que contiene cuatro sitios de unión consenso TCF, se utilizó un sitio de unión Fos mínimo y un indicador de luciferasa [15]. A FOP-flash construir con un sitio de unión TCF mutada se utilizó como control negativo. Un plásmido indicador que contiene 6 copias de daf-16 proteína de la familia elemento (FoxO-luc) de unión en el vector de luciferasa de luciérnaga pGL3-básico con una caja TATA mínima [16] fue proporcionado amablemente por B. Burgering, del Centro Médico Universitario de Utrecht, Países Bajos . construcciones de reportero de luciferasa se introducen en las células C2C12 por transfección transitoria usando 8 g de PEI y 4 g de plásmido. Después de 6 h, el medio se retiró y la C2C12 fueron co-cultivadas con células PC3 pre-tratada o no con hemina o crecido solo por 24 h. células C2C12 fueron luego cosechadas y lisadas con 40 l de Steady Glo Luciferase System (Promega, Madison, WI, EE.UU.). La actividad de luciferasa se midió en un luminómetro (sistema de detección de Multi Glomax; Promega). Como control positivo de la activación de los sitios de unión TCF, PMOs se trataron con LiCl 10 mM durante 24 h y de la activación FoxO-luc, las células se expusieron a H
2O
2 100μM para 24 h. Cada transfección se realizó por triplicado y cada experimento se repitió al menos tres veces. Los datos se normalizaron a la proteína total determinado por el ensayo de Bradford.
Evaluación de especies reactivas del oxígeno por citometría de flujo
Después de que el co-cultivo, los PMOs se lavaron con PBS y se incubaron con 10 M 2 ', 7 pies diacetato diclorofluoresceno (CM2-DCFHDA; Invitrogen-Molecular Probes
TM) durante 1 hora a 37 ° C. Las células se tripsined y se resuspendieron con PBS. Los niveles de H
2DCFDA se midieron mediante citometría de flujo en el canal FITC.
Ciclo celular
Después de que el co-cultivo, las PMO fueron fijadas y teñidas con yoduro de propidio (PI), y analizada por células activadas por fluorescencia (FACS) tal como se describe anteriormente [17].
inmunofluorescencia
PMO fueron co-cultivadas como se ha descrito anteriormente, pero se sembraron en cubreobjetos. Se realizaron los análisis de inmunofluorescencia como se ha descrito anteriormente [12]. microscopía de campo amplio se llevó a cabo usando un microscopio Olympus IX71 con un objetivo de inmersión en agua (UPLSAPO 60XW 1,2 AN, Olympus). Las imágenes fueron tomadas con la cámara Hamammatsu Orca-ER usando el software IQ Andor y fueron procesados para su presentación con ImageJ (http://rsb.info.nih.gov, Institutos Nacionales de la Salud).
Análisis inmunohistoquímico
técnica de inmunohistoquímica se realizó como se describió anteriormente [9,10]. Para el análisis cuantitativo, se contó el número total de los osteoblastos en al menos 6 campos y se calculó el porcentaje de los osteoblastos con inmunorreactividad positiva para el gen estudiado.
cultivo de órganos
Calvaria de 4 días de edad crías de ratón CD1 eran especiales, cortado por la mitad y se colocaron en medio BGJ (Sigma Aldrich) que contiene 0,1% de albúmina de suero bovino en un inserto de cultivo celular que suspende el órgano de hueso entre la atmósfera y el medio óptimo para CO
2 de cambio. La mitad de cada bóveda craneal fue co-cultivadas con células PC3 pre-tratados con hemina y la otra mitad con las células no tratadas PC3. Otros calvarias se colocaron en medio BGJ que contiene 0,1% de albúmina de suero bovino y se utilizaron como controles. Otras mitades tratados con insulina 20 mg /ml se utilizaron como controles positivos de la formación de hueso. La cultura correspondiente PC3 y el medio se cambió cada 2 días y el experimento se terminó al final de los 7 días. En ese momento, las mitades calvaria se fijaron, parafina-embebido descalcificada,, seccionado, se tiñeron con hematoxilina y eosina o inmunohistoquímica stainned y se analizaron como se ha descrito anteriormente [13].
En vivo
de próstata intrabone modelo de cáncer de
Todos los experimentos con animales se realizaron de conformidad con las normas aceptadas de cuidado de los animales y fueron aprobados por el Institucional cuidado de animales y el empleo
Comité de la Universidad de Texas MD Anderson Cancer Center. Se inyectaron células PC3HO-1 o PC3βgal en los fémures de los ratones SCID macho (Charles River Laboratories, Wilmington, MA, EE.UU.) como se describe anteriormente [13]. 3 × 10
5 células de CaP por ratón se inyectaron con una aguja de calibre 28 en los extremos distales de los fémures derechos de 6 a 8 semanas de edad, los ratones SCID macho intacto (n = 7 por grupo) de acuerdo con procedimientos descrito en otra parte. La formación de hueso se evaluó por análisis de rayos X. Al final del experimento, los ratones fueron sacrificados por dislocación cervical después de la anestesia con isoflurano, (emitido por el método de la gota apertura * *) después de lo cual se retiraron las patas traseras y los tejidos musculares disecados a partir de los huesos de tanto el inyectado y control extremidades traseras de los ratones portadores de xenoinjertos de los femorales. Los huesos disecados se procesaron a continuación para histológico.
El análisis estadístico
Todos los resultados se expresan como media ± desviación estándar de 3 experimentos independientes separados a menos que se indique lo contrario. Se utilizó la prueba t de Student para determinar la significación estadística con un umbral de
P Hotel & lt; 0,05 (*),
P Hotel & lt; 0,01 (**) y
P & lt
; 0,001 (***)
Resultados
HO-1 en las células PC3 perjudica efectos inhibidores del crecimiento de células tumorales en la proliferación de osteoblastos
In vivo
, células PC3 predominantemente producen efectos de resorción ósea que conducen a lesiones óseas osteolíticas [18].
in vitro
, que fue bien documentado que cuando PMO fueron co-cultivadas con células PC3 el número de oficinas de gestión disminuyó significativamente [13]. Con el fin de analizar el efecto de HO-1 en la interacción entre células de CaP y osteoblastos, HO-1 en las células PC3 se indujo por pre-tratamiento con hemina (PC3 Hem) (80 M, 24 h). PC3 Hem y control de las células fueron co-cultivadas con oficinas de gestión durante 24 h. Se confirmó el efecto inhibidor de las células PC3 en la proliferación de osteoblastos tal como se evaluó por
3H-timidina incorporación y número de células (57% y 28%,
P
& lt; 0,05; respectivamente) (Figura 1 A & amp; B ). Notablemente, el co-cultivo de las PMO con PC3 Hem restauró la proliferación de osteoblastos a los niveles encontrados en las PMO crecientes sola (Figura 1 A & amp; B), haciendo hincapié además en el papel pro-homeostático de HO-1. La inducción de HO-1 en las células PC3 se confirmó en ARNm y los niveles de proteína (Figura 1).
Los experimentos se realizaron en PMOs cultivados solos (PMO), co-cultivadas con PC3 (PMO PC3) o con PC3 tratadas previamente con hemina (PMO PC3 Hem). A: La proliferación celular se midió por la incorporación de 3H-timidina
en PMOs después del cultivo 24 h. Los resultados se expresan como un porcentaje de la monocultivo PMOs fijado en 100%. B: número de células PMO. C: análisis de transferencia de Western se llevó a cabo mediante el uso de B1 anti-ciclina, A, y D1 y anti-p21
anticuerpos WAF1 /CIP1. Los números debajo de las bandas indica la cuantificación normalizada a ß-tubulina y PMOs solo. se muestra un representante de al menos tres experimentos independientes (Diferencia significativa, *
P Hotel & lt; 0,05; No hubo diferencias significativas, NS) guía empresas
Los análisis de las proteínas implicadas en el ciclo celular. la regulación por inmunotransferencia de las PMO después del co-cultivo con Hem PC3 mostró un aumento en los niveles de ciclina a, ciclina B y ciclina D1, con una disminución concomitante de p21
WAF1 expresión /CIP1 en comparación con las PMO cultivadas en co-cultivo con las células control PC3 (Figura 1C). Por otra parte, el flujo análisis de citometría de OAP después del co-cultivo con Hem PC3 demostró significativo aumento en la acumulación de G2 /M en comparación con las PMO co-cultivo con células de control PC3 (
P Hotel & lt; 0,05) (datos no mostrados) . Todos estos datos sugieren que HO-1 expresión en células de CaP induce progresión del ciclo celular en PMOs, la restauración de la tasa de crecimiento de PMOs solo. Vale la pena señalar que el número de células PC3 no se modificó en las condiciones diferentes de co-cultivo ensayadas (datos no presentados).
HO-1 en las células PC3 no altera los efectos de las células tumorales en osteoblastos diferenciación
niveles
transcripción de varios genes específicos osteoblastos fueron evaluados por RT-qPCR. La expresión de los osteoblastos factor de transcripción específico Runx-2, de un marcador de diferenciación temprana (fosfatasa alcalina, ALP), de los marcadores finales de diferenciación implicados en la deposición de matriz de colágeno (colágeno tipo I y colágeno de tipo II) y la deposición de matriz no colagenosa (osteocalcina , se analizó OCN). Se encontró que Runx-2 expresión se incrementó en oficinas de gestión co-cultivadas con Hem PC3 (130%,
P Hotel & lt; 0,05) (Figura 2 A), pero no se detectaron diferencias en los niveles de fosfatasa alcalina, colágeno tipo I y II en las PMO crecimiento solo o en co-cultivo con Hem PC3 o control de las células PC3 (Figura 2 BD). los niveles de OCN se redujo significativamente en PMOs co-cultivadas con controles Hem PC3 o PC3 (81% y 68%,
P
& lt; 0,01; respectivamente) (Figura 2 E). De acuerdo con informes anteriores [13,19,20], PMOs co-cultivadas con células PC3 mostraron una disminución en la formación de la matriz calcificada como se evaluó por tinción de von Kossa en comparación con PMOs crecimiento solo (Figura 2). Sin alteración se detectó en la matriz calcificada cuando PMO fueron co-cultivadas con Hem PC3 (Figura 2). Estos resultados demuestran que los factores secretados PC3, descrito como responsable de la inhibición de la diferenciación de los osteoblastos [13], no se modifican cuando se induce la expresión de HO-1 en las células tumorales.
Los experimentos se realizaron en las PMO cultivados solos (PMO), co-cultivadas con PC3 (PC3 PMO) o con PC3 pre-tratados con hemina (PMO PC3 Hem). El ARN total se extrajo y se Runx-2 (A), ALP (B), colágeno de tipo I (C), colágeno de tipo II (D) y OCN (E) los niveles de mRNA fueron analizados por RT-qPCR. Los datos se normalizaron a la ß-actina y se expresaron como veces de inducción respecto al PMO. Uno de los representantes de al menos tres experimentos independientes se muestra (Diferencia significativa, *
P Hotel & lt; 0,05; **
P Hotel & lt; 0,01).
HO -1 expresión en células PC3 disminuyó los niveles de factores de osteoclastos de modulación en los osteoblastos
receptor activador del factor nuclear kappa-B ligando (RANKL) y osteoprotegerina (OPG) son producidos por las células del estroma osteoblásticas /. RANKL se ha demostrado que activa los osteoclastos maduros y mediar la osteoclastogénesis. actos de OPG como un receptor señuelo para RANKL [21]. El co-cultivo de PMOs y células PC3 Hem produce un aumento de RANKL y una disminución en los niveles de transcripción de OPG en los osteoblastos; Se observó el mismo resultado después de co-cultivo de PMOs con las células control PC3 (Figura 3 A & amp; B).
Los experimentos se realizaron en PMOs cultivados solos (PMO), co-cultivadas con PC3 (PMO PC3) o con PC3 tratadas previamente con hemina (PMO PC3 Hem). El ARN total se extrajo y RANKL (A), OPG (B), CSF-1 (C), OPN (D), CCL2 (E) y la IL-6 (F) los niveles de mRNA fueron analizados por RT-qPCR. Los datos se normalizaron a la ß-actina y se expresaron como veces de inducción respecto al PMO. se muestra un representante de al menos tres experimentos independientes (Diferencia significativa, *
P Hotel & lt; 0,05; **
P Hotel & lt; 0,01; ***
P & lt
;. 0.001)
Los osteoblastos también producen citoquinas y otros factores de crecimiento que promueven el desarrollo y la activación de osteoclastos, tales como factor estimulante de colonias-1 (CSF-1), la osteopontina (OPN), quimiocina (motivo CC ) ligando 2 (CCL2) y la interleucina-6 (IL-6). Se encontró que las PMO co-cultivadas con PC3 Hem expresaron niveles significativos menor de transcripción de CSF-1, OPN y CCL2 en comparación con las PMO cultivados solos (52%,
P Hotel & lt; 0,01; 53%,
P Hotel & lt; 0,001 y el 52%,
P Hotel & lt; 0,05; respectivamente). No se detectaron diferencias en los niveles de IL-6 (Figura 3 C-F).
células de CaP también expresan genes indirectamente implicados en la modulación de los osteoclastos. Por lo tanto, se decidió investigar la expresión en células PC3 de paratiroides péptido relacionado con la hormona (PTHrP), de tipo uroquinasa activador del plasminógeno (uPA) y factor de crecimiento transformante beta 1 (TGF-β1) por RT-qPCR y la actividad de metaloproteasa de matriz 9 (MMP9) por zimografía. No se observaron diferencias en los niveles de transcripciones de los genes seleccionados o en la actividad de MMP9 (Figura 4), lo que indica que estos genes implicados en la modulación de los osteoclastos no se alteran en las células PC3 en las condiciones experimentales ya sea pre-tratada o no con hemina cultivo solos o en co-cultivo.
células PC3 se trataron previamente con hemina (80 M, 24 h, columnas negras) o no (control, columnas blancas) y co-cultivadas o no con PMOs. El ARN total se extrajo y PTHrP (A), de uPA (B) y el TGF-β1 (C) los niveles de ARNm se analizaron por RT-qPCR. Los datos se normalizaron a beta-actina y se expresaron como veces de inducción respecto a PC3. zimografía de gelatina se realiza para evaluar la actividad de MMP9 en medios acondicionados de PC3 crecido solo (PC3), pre-tratado con hemina (PC3 Hem) y de PMOs cultivados solos (PMO) y co-cultivadas con PC3 pre-tratada o no con hemina ( PMO PMO PC3 Hem y PC3, respectivamente). bandas claras se cuantificaron utilizando software ImageJ 1.37.v (NIH) y se normalizaron a la proteína total. Uno de los representantes de al menos tres experimentos independientes se muestra (NS: No hubo diferencias significativas; RV: valores relativos).
El inicio de la condición de los osteoblastos oxidativo mediante co-cultivo con células PC3 hemina pretratados
informes previos indican que el estrés oxidativo conduce a la disminución de los osteoblastos número y la tasa de formación ósea [22]. Con el fin de investigar si las células de CaP inducen estrés oxidativo en los osteoblastos, se utilizó el sistema de co-cultivo para analizar la expresión de genes de respuesta antioxidantes (MnSOD, catalasa y HO-1). El co-cultivo de las PMO con controles Hem o PC3 PC3 aumentó los niveles de transcripción de MnSOD (134% y 206%,
P Hotel & lt; 0,05; respectivamente) y catalasa (95% y 35%,
P Hotel & lt; 0,05; respectivamente) en las PMO (Figura 5 a & amp; B). Curiosamente, HO-1 en la expresión de proteínas en los osteoblastos co-cultivadas con controles Hem PC3 o PC3 se indujo fuertemente en comparación con las PMO crecientes sola (Figura 5 C). Para determinar los niveles de estrés oxidativo, la generación de ROS se midió por citometría de flujo de supervisión H
oxidación 2DCFDA. aumento de los niveles de ROS significativos fueron encontrados en las PMO co-cultivadas con Hem PC3 en comparación con las PMO que crecen solos (15%,
P Hotel & lt; 0,01) (Figura 5 D). En conjunto, estos hallazgos sugieren que la inducida por HO-1 expresión en células PC3 comunicados de factores solubles que conducen a estrés oxidativo en PMOs. Esto a su vez induce una respuesta antioxidante probablemente favoreciendo la proliferación de osteoblastos [6].
Los experimentos fueron realizados en oficinas de gestión cultivados solos (PMO), co-cultivadas con PC3 (PMO PC3) o con PC3 tratadas previamente con hemina ( PMO PC3 Hem). El ARN total se extrajo y MnSOD (A) y catalasa (B) los niveles de ARNm se analizaron por RT-qPCR. Los datos se normalizaron a la ß-actina y se expresaron como veces de inducción respecto al PMO. los niveles de proteína HO-1 (C) se determinaron por análisis de transferencia Western. Los números debajo de las bandas indica la cuantificación normalizada a ß-actina y PMOs solo. los niveles de ROS (D) se determinaron en PMOs incubadas con CM2-DCFHDA y medidos por citometría de flujo en el canal FITC (Diferencia significativa, *
P
& lt; 0,05; **
P
& lt; 0,01).
HO-1 en las células PC3 se activa la señalización en las células C2C12 FoxO
Con el fin de identificar las vías activadas por el estrés oxidativo en los osteoblastos de señalización, se analizaron β-catenina /eje Foxo. Aunque vía Wnt /β-catenina canónica juega un papel fundamental en la regulación de la diferenciación de osteoblastos y la formación de hueso, es bien sabido que soluble β-catenina interactúa con FoxO factores de transcripción en respuesta al estrés oxidativo [6]. Para estudiar esta vía de señalización se utilizó una construcción de reporte con seis elementos de respuesta FoxO. Debido a la dificultad para transfectar las PMO, se utilizó una línea de células mesenquimales no comprometida, C2C12, capaces de diferenciarse en el linaje de osteoblastos [23]. El co-cultivo de células C2C12 con PC3 Hem estimuló fuertemente la actividad del gen indicador (Figura 6 A). Como control positivo se expusieron C2C12 culturas a H
2O
2 (100 M) (Figura 6 A). Los resultados descritos aquí sugieren que los factores solubles producidos por Hem PC3 inducen la señalización en los osteoblastos FoxO.
Panel superior. Los experimentos se realizaron en C2C12 crecido solo (C2C12), co-cultivadas con PC3 (C2C12 PC3) o con PC3 tratadas previamente con hemina (C2C12 PC3 Hem). A: Las células se transfectaron con una construcción de gen informador FoxO (FoxO-luc). H
2O
2 se utilizó como control positivo. B: Las células fueron transfectadas con un constructo indicador TCF gen (TOP-flash) o su control negativo (FOP-flash). LiCl era un control positivo. Seis horas después de la transfección, las células C2C12 fueron co-cultivadas y 24 horas después se lisaron los co-cultivo de las células C2C12 y ensayo de actividad de la luciferasa se realizó. Los datos se normalizaron a los valores de proteína. Se muestra un representante de al menos tres experimentos independientes (diferencia significativa, *
P
& lt; 0,05). El panel inferior. C: distribución celular ß-catenina se visualizó mediante tinción de inmunofluorescencia (rojo) de las PMO cultivados solos (PMO), co-cultivadas con PC3 (PMO PC3) o con PC3 pre-tratados con hemina (PMO PC3 Hem). El núcleo fue etiquetado con la tinción de Hoechst (verde). La fusión representa las imágenes superpuestas. Se muestra una imagen representativa para cada grupo. Barra de escala: 30 micras.
En la vía canónica de Wnt, los resultados de activación de β-catenina en la estabilización de la translocación de proteínas en el núcleo, donde interactúa con TCF (factor de células T, caja HMG) y activa la transcripción de genes diana [24]. Se ha sugerido que Foxo desviar β-catenina de la vía canónica de Wnt [6]. Para evaluar si Wnt vía canónica en PMOs se altera después del co-cultivo con células de CaP, examinamos β-catenina localización subcelular y la activación TCF en las PMO que crecen solos o en co-cultivo con células PC3 Hem y control PC3. Las imágenes mostraron en la Figura 6 C demuestran que β-catenina se encuentra tanto en el núcleo y en el citoplasma en todas las condiciones analizadas. Para evaluar la activación de la vía β-catenina /TCF se utilizó un gen informador. Nos co-cultivadas células PC3 pre-tratada o no con hemina con células C2C12 que habían sido transfectadas con una construcción de gen informador de TCF (TOP-flash) [15]. las células C2C12 tratadas con LiCl (20 mM) se utilizaron como un control positivo y la actividad del indicador FOP-flash como un control negativo. No se detectaron diferencias en la actividad reportera TCF cuando se cultivaron células C2C12 solos o co-cultivadas con células PC3 Hem o de control PC3 (Figura 6 B).
Bone explante co-cultivo con células PC3 induce la expresión de HO-1
Para extender estos resultados, se utilizó un ensayo de cultivo de órganos de hueso. Hem PC3 o control de las células PC3 se co-cultivaron con explantes de calvaria de ratón. El análisis histológico no mostró diferencias en la formación de hueso cuando calvarias se cultivaron solo (control) o en co-cultivo (Figura 7 A-C). Utilizando la técnica de inmunohistoquímica que junto exploramos la expresión de HO-1.