Extracto
Antecedentes
HNF1A (factor nuclear de hepatocitos 1 alfa) es un factor de transcripción que se sabe para regular la diferenciación de páncreas y mantener la homeostasis de páncreas endocrino. Recientemente, los estudios de asociación de genoma completo han implicado
HNF1A
como un gen de susceptibilidad para el cáncer de páncreas. Sin embargo, el significado funcional y el mecanismo molecular de
HNF1A
en la carcinogénesis pancreática sigue siendo poco clara.
Métodos
El uso de RT-PCR, Western blot e inmunohistoquímica métodos, examinamos
HNF1A
la expresión génica en ocho líneas celulares de carcinoma de páncreas y en el tumor emparejado y muestras de tejido normal de pacientes con adenocarcinoma ductal pancreático resecado. Llamamos por la
HNF1A
la expresión génica en dos líneas celulares de cáncer utilizando tres secuencias de siRNA. Los impactos sobre la proliferación celular, la apoptosis y el ciclo celular, así como la fosforilación de Akt proteínas de transducción de señales fueron examinadas usando el ensayo de ATP, citometría de flujo y transferencia de Western.
Resultados
HNF1A
se expresó en tres de los ocho líneas celulares de adenocarcinoma de páncreas y el nivel de
HNF1A
ARNm y proteínas expresión fue significativamente menor en los tumores que en los tejidos normales adyacentes por ambos RT-PCR y análisis de Western blot. La inmunohistoquímica reveló que el nivel de
HNF1A
expresión fue significativamente menor en los tejidos tumorales que en los tejidos no tumorales. El bloqueo selectivo de los
HNF1A fotos: por siRNA confirió una tasa de 2 veces más alta de la proliferación celular, el 20% de aumento de células en fase G2 fase y S, y 30-40% de reducción apoptosis en líneas celulares de cáncer de páncreas. Además, demostró que
HNF1A
desmontables activado Akt y su objetivo abajo, el objetivo de la rapamicina en mamíferos (mTOR) en las células de cáncer de páncreas.
Conclusión
Estas observaciones proporcionan evidencia experimental el apoyo a una posible función supresora de tumores de HNF1A en el cáncer pancreático
Visto:. Luo Z, Li Y, Wang H, J Fleming, Li M, Kang Y, et al. (2015) de hepatocitos Factor Nuclear 1A (HNF1A) como un posible supresor tumoral en el cáncer de páncreas. PLoS ONE 10 (3): e0121082. doi: 10.1371 /journal.pone.0121082
Editor Académico: José G. Treviño, Universidad de Florida, Estados Unidos |
Recibido: 20 Agosto, 2014; Aceptado: January 28, 2015; Publicado: 20 Marzo 2015
Derechos de Autor © 2015 Luo et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del papel
Financiación:. GS Hogan Fondos de investigación y el Centro Ahmed Sheikh para pancreáticos Fondos de investigación del cáncer. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
analiza los datos (en todo el genoma asociación estudio) GWAS mensaje recientes han demostrado que
HNF1A gratis (
factor nuclear de hepatocitos 1 |) variantes genéticas se asocian con el riesgo de cáncer de páncreas [ ,,,0],1-3]. Sin embargo, el significado funcional y los mecanismos moleculares de la carcinogénesis pancreática HNF1A mediada sigue siendo poco clara.
HNF1A pertenece a la familia de proteínas homeobox y es un factor de transcripción esencial para muchos genes hepáticas implicadas en la desintoxicación, la homeostasis y metabolismo de glucosa, lípidos, ácido esteroides y amino [4]. Además, HNF1A es un componente importante de las redes de transcripción que regulan el desarrollo embrionario y la diferenciación páncreas [5], [6]. así como mantener el crecimiento y la función de las células de los islotes beta en adultos [7]. mutaciones en la línea germinal heterocigotos de
HNF1A
han sido encontrados responsables de tipo MODY 3 (diabetes de inicio en la madurez de los jóvenes) [8]. Las mutaciones o variantes comunes de
HNF1A
gen también se han asociado con el riesgo de la diabetes tipo II [9-11].
Como factor de transcripción, HNF1A también se ha demostrado que afecta a las células del epitelio intestinal el crecimiento y la diferenciación de los linajes de células [12], [13] y regular la expresión de microARN-194 [14]. Estudios previos en otros tipos de cáncer humanos han sugerido un papel supresor de tumor de
HNF1A
gen. Por ejemplo, las alteraciones somáticas bialélicos de
HNF1A
estaban presentes en el 60% de los adenomas hepatocelulares y en raros casos de carcinomas hepatocelulares en el hígado no cirrótico [15].
HNF1A
silenciamiento por siRNA en células de carcinoma hepatocelular inducida por la sobreexpresión de varios genes que codifican receptores de factores de crecimiento, los componentes de la maquinaria de traducción, el ciclo celular, y los reguladores de la angiogénesis [16]. Las mutaciones de
HNF1A
gen se detectaron también en el cáncer colorrectal con inestabilidad de microsatélites [17] y en el cáncer de endometrio [18]. variantes polimórficas de
HNF1A
gen se han asociado con la circulación nivel de proteína C reactiva (PCR), un biomarcador de la inflamación [19], [20]. Un estudio reciente GWAS de N-glicoma humano identifica HNF1A como un regulador maestro de fucosilación de proteínas de plasma [21]. Esta evidencia sugiere que HNF1A podría desempeñar un papel en el desarrollo del cáncer a través de la regulación de la inmunidad, la respuesta inflamatoria, y plegamiento de proteínas, así como el crecimiento y la diferenciación celular. Sin embargo, aún no existe información sobre la expresión o mutación de estado y el papel potencial de
HNF1A
en el cáncer de páncreas humano.
En este estudio, nuestro objetivo es demostrar la expresión de
HNF1A
gen en el cáncer de páncreas humano y el impacto de
HNF1A
desregulación de la proliferación celular, ciclo celular, la apoptosis y la transducción de señales en las células de cáncer de páncreas.
Materiales y Métodos
las líneas celulares y tejidos humanos
líneas celulares de adenocarcinoma pancreático humano ASPC-1, Panc-1, MiaPaCa-2, Hs766T, y BxPC 3 células fueron adquiridos de la American Type Culture Collection y se cultivaron como se describe en sus hojas de información del producto. Panc-28, Colo357 y su rápido crecimiento sublínea (FG), así como la línea de humano normal inmortalizada pancreático epitelial ductal (HPDE) de células fueron regalos de los Dres. Craig D. Logsdon (MD Anderson Cancer Center, Houston, TX) [22], [23]. Todas las líneas celulares han sido autenticados mediante pruebas de 14 marcadores polimórficos. Las células cancerosas se cultivaron en medio RPMI 1640 o medio de Eagle modificado por Dulbecco suplementado con suero bovino fetal 10%. HPDE celular se mantuvo en medio libre de suero de queratinocitos suplementado con factor de crecimiento epidérmico y extracto de pituitaria bovina.
La formalina fijo (FFPE) secciones incluidas en parafina y muestras congeladas de 48 pares de tejidos tumorales pancreáticas resecado quirúrgicamente y su adyacente tejidos no tumorales se obtuvieron de MD Anderson Banco de tejidos. FFPE se utilizó para inmunohistoquímica. Los tejidos congelados se usaron para el ARN y la extracción de proteínas. Todas las muestras de tejidos utilizados en este estudio fueron muestras quirúrgicas residuales de los pacientes sometidos a resección del tumor sin tratamiento preoperatorio en el MD Anderson Cancer Center con un consentimiento informado por escrito firmado por cada paciente. Todas las muestras de tejido fueron evaluadas por un patólogo (Dr. Wang) para asegurar la celularidad de los tejidos tumorales y la pureza de los tejidos adyacentes normales. El estudio y el formulario de consentimiento fueron aprobados por la Junta de Revisión Institucional MD Anderson.
La inmunohistoquímica (IHC) y Western Blot
Después de deparaffinization, secciones de tejidos fueron sometidos a la recuperación de antígenos y bloquear la actividad peroxidasa endógena. El anticuerpo primario usado fue el anticuerpo de conejo HNF1A de Epitomics (Burlingame, CA) a una dilución de 1: 200. Después del tratamiento con el anticuerpo secundario biotinilado, se detectó el complejo anticuerpo utilizando una solución de complejo de avidina-biotina-peroxidasa y se visualizó usando 3,3'-diaminobencidina (Zymed Laboratories, Inc., San Francisco, CA). Un control negativo se incluyó en cada experimento omitiendo el anticuerpo primario. Las imágenes fueron evaluadas por un patólogo experimentado para patrones de tinción en diferentes tipos de células pancreáticas, diferentes componentes celulares, así como en tejidos tumorales y normales. Las secciones del mismo bloque de tejido también se tiñeron para AKT fosforilada y mTOR utilizando (Ser2448)-mTOR anticuerpos anti-fosfo anti-fosfato AKT (Ser473) y. La intensidad de la tinción se puntuó como 0 para el negativo, 1 para débil, 2 para el compuesto intermedio, y 3 para una fuerte tinción. El porcentaje de células con tinción positiva se anotó como 0 para ninguno, 1 por 1 hasta 50%, y 2 para & gt; 50%. El marcador final tinción fue el producto de las puntuaciones de intensidad y porcentaje. La diferencia en las puntuaciones de tinción de los tejidos no tumorales y tumorales se comparó mediante la prueba de t pareada.
La expresión de proteínas también se evaluó en muestras de proteínas extraídas de líneas celulares y muestras de tejidos congelados utilizando el Western Blot. La proteína se extrae de células enteras lisados de proteínas y la concentración determinada mediante el método de tinción Bradford. Los extractos de proteína se fraccionaron por electroforesis en gel de poliacrilamida y se transfirieron a una membrana de PVDF Mini utilizando un sistema de transferencia Trans-Blot Turbo (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Los anticuerpos primarios utilizados incluyen: HNF1A de BD Biosciences (San Jose, CA) a una dilución 1: 1000; AKT total fosfo-AKT (Ser473), y fosfo-AKT (Thr308) a una dilución 1: 2000; y mTOR total y fosfo-mTOR (Ser2448) a 1: 1000 dilución de Señalización Celular (Danvers, MA). Se utilizó diluciones 3000 como el control de carga: Beta-actina en 1. Después de la incubación con anticuerpos secundarios apropiados conjugados con peroxidasa de rábano picante, las membranas se expusieron a reactivo de detección ECL Western Blotting. Las membranas fueron despojados durante 30 minutos a 55 ° C en un tampón que contiene 2% de SDS, 62,5 mM Tris (pH 6,7), y 100 mM 2-mercaptoetanol para la tinción de múltiples proteínas. intensidad de la tinción se cuantificaron por análisis densitométrico.
expresión mRNA
ARN total fue extraído a partir de células cultivadas, así como de 27 pares de tumor pancreático y sus tejidos no tumorales adyacentes usando el reactivo Trizol de acuerdo con el protocolo del fabricante (Life Technologies, Grand Island, NY). El ADN complementario se sintetizó a partir de 1,0 g de ARN total usando el Kit de Síntesis de ADNc (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). RT-PCR cuantitativa (QRT-PCR) se realizó en muestras por triplicado utilizando cebadores prediseñados y conjuntos de sonda (Hs00167041-M1, Life Technologies, Grand Island, NY). Los resultados de RT-PCR se normalizaron primero con el ciclo umbral (Ct) de GAPDH, que se refiere como? Ct. El cambio veces en la expresión de genes en el grupo de tumor en comparación con los que en el grupo normal se expresó como 2
-ΔΔCt, en el que-ΔΔCt es igual a la Ct del grupo de tumor menos el Ct del grupo normal, que se normalizó a 1.
siRNA bloqueo
pequeños ARN de interferencia (siRNA) transfecciones se realizaron utilizando el reactivo de transfección de acuerdo con el protocolo del fabricante (Life Technologies, Grand Island, NY). Tres ARNsi dúplex diferentes focalización
HNF1A
gen (NM_000545) se pusieron a prueba. Las secuencias de los siRNAs son como sigue: 5'-CAGUGAGACUGCAGAAGUAtt-3 '(
HNF1A
siRNA1), 5'-GGUCUUCACCUCAGACACUtt-3' (
HNF1A
siRNA2), 5'-CACCUGUCCCAACACCUCAtt- 3 '(
HNF1A
siRNA3). Un reactivo de transfección ARNsi de control o negativo solamente se utilizó en transfecciones simuladas. ASPC-1 y células BxPC-3 fueron transfectadas y las células se cosecharon 24 h a 96 h después de la transfección.
crecimiento celular y la proliferación
proliferación celular
se cuantificó usando un ensayo de ATP (Promega, Madison , WI). Brevemente, 10.000 células por pocillo en placas de 96 pocillos se transfectaron transitoriamente con
HNF1A
siRNA o ARNsi de control (10 nM). Se añadió un volumen igual de reactivo a la cultura 12, 24, 48 y 72 h después de la transfección para la detección de luminiscencia. Tres experimentos independientes se realizaron en cada punto de tiempo.
ciclo celular y apoptosis ensayo
72 h después de la transfección, se recogieron las células y se suspendieron en tampón estabilizante citrato que contiene 125 mg /ml de yoduro de propidio (PI) y RNasa A. distribución del ciclo celular se determinó por citometría de flujo.
la apoptosis se evaluó mediante la anexina V y yoduro de propidio isotiocianato de fluoresceína (FITC) (PI) método de doble tinción 72h después de la transfección. Las células apoptóticas se identificaron mediante análisis de citometría de flujo usando el analizador de células BD y FCS Software Express-Clínica edición (BD Bioscience, San José, CA). Tanto las células apoptóticas tempranas y tardías se contaron los cambios apoptóticos relativos. Todos los experimentos se realizaron por triplicado.
Todos los datos en replicar los experimentos fueron descritos como media ± desviación estándar. Emparejado prueba de la t o t de Student (2 colas) se aplicaron con
P
valor & lt; 0,05 como nivel de significación.
Resultados
Expresión de
HNF1A Hoteles en líneas celulares de carcinoma de páncreas
El uso de RT-PCR cuantitativa (QRT-PCR) y análisis de Western blot, demostramos que
HNF1A
se expresó en tres líneas celulares de carcinoma de páncreas bien caracterizados derivados ya sea de los tumores primarios de páncreas (adenocarcinoma BxPC-3) o en los sitios metastásicos (ASPC-1, Colo357) con la más alto nivel detectado en AsPC-1 (Fig. 1A).
HNF1A
expresión era apenas detectable en MiaPaCa-2 células y no detectable en las líneas celulares de carcinoma restantes y HPDE (Fig. 1). El análisis de transferencia Western confirmó la presencia de proteína HNF1A en células Colo357 BxPC-3, AsPC-1 y, el nivel más bajo en MiaPaCa-2 y la ausencia en las células HPDE Panc-1, FG, Hs766T, Panc-28 y (Fig. 1B ).
a, nivel de expresión de ARNm en líneas celulares de cáncer de páncreas humano en relación con el control de línea celular COLO357 medida por QRT-PCR. B, la expresión de proteínas en líneas celulares correspondientes por Western blot. C, doblar las diferencias en los niveles de mRNA de expresión de 27 tumores de páncreas en comparación con sus tejidos no tumorales adyacentes apareados. D y E, transferencias de Western y la medición cuantitativa de la expresión de la proteína HNF1A en ocho pares de muestras humanas pancreáticas tumores (T) y sus tejidos adyacentes no tumoral (N). Los niveles de expresión de HNF1A se normalizan a los de β-actina.
La reducción de expresión de
HNF1A
en el adenocarcinoma pancreático humano
HNF1A
la expresión de ARNm se detectaron mediante qRT-PCR en 27 tejidos tumorales de adenocarcinoma pancreático resecado pareadas y sus tejidos no tumorales adyacentes. El nivel de
HNF1A
expresión fue significativamente menor en el tumor que los de tejidos no tumorales (
p = 0,005
, emparejado
t
prueba) (Fig. 1C). El nivel medio de
HNF1A
la expresión del ARNm en tejidos tumorales se redujo a 44,4% de la de los tejidos no tumorales, aunque tres de los 27 pares mostraron un mayor nivel de
HNF1A
expresión en los tumores.
a continuación, Western blot se realizaron en ocho pares de tejidos tumorales y no tumorales para examinar la expresión HNF1A a nivel de proteínas. Por Western blot (Fig. 1D), encontramos un menor nivel de proteína HNF1A en 7/8 (87,5%) de los tumores en comparación con sus tejidos no tumorales adyacentes (Fig. 1E). La intensidad media (± SD) de la banda después de HNF1A normalizada a la de la β-actina fue significativamente menor en el tumor (0,71 ± 0,11) que los de los tejidos no tumorales (0,80 ± 0,13) (
p
= 0,005, emparejado
t
prueba). Los experimentos de IHC revelaron diferencias claras en la expresión de proteínas entre HNF1A normal (Fig. 2A y 2B) y el páncreas cancerosos (Fig. 2C y 2D). HNF1A proteína estaba presente con una fuerte intensidad en el páncreas endocrino y exocrino normales. La células de los islotes y las células acinares mostraron una tinción más fuerte que los núcleos de las células ductales hicieron. Por el contrario, en el tejido tumoral, HNF1A se expresó en niveles moderados en células de los islotes y acinares pero a un nivel bajo o indetectable en células ductales. tejidos del estroma que rodean las lesiones neoplásicas no mostraron tinción significativa para HNF1A. La puntuación media de tinción (media ± DE) fue de 5,08 ± 2,17 frente a 2,27 ± 1,45 en 48 pares de no-tejidos tumorales y tumorales, respectivamente (
P & lt; 0,001
, emparejado
t
prueba) (Tabla 1).
Imágenes (a y B) muestran citoplasmática y la expresión nuclear de HNF1A en el tejido pancreático normal. Los conductos pancreáticos normales están marcados con una sola flecha. células de los islotes están marcados con flechas dobles. células de los islotes pancreáticos tienen un mayor nivel de expresión HNF1A de células acinares y ductales. Imágenes (C y D) muestran la expresión de HNF1A en el adenocarcinoma ductal pancreático (círculos) y las células ductal pancreático benignos y células de los islotes adyacentes al tumor (izquierda). Panel E-H muestran las micrografías representativas para p-AKT (E y F) y p-mTOR (G y H) expresión en tejidos pancreáticos normales (E y G) y el adenocarcinoma ductal pancreático (F y H). Aumentos: 100X para A, E y G; 400X para B y H, 40X para C, D y 200X para F.
Bloqueo
HNF1A fotos: por siRNA específico
Tres secuencias diferentes siRNAs dirigidos
HNF1A
exón 4 (siRNA1), el exón 1 (siRNA2) o exón 8-9 cruce (siRNA3) se transfectaron en células AsPC-1 y BxPC-3. Quantitative PCR análisis mostró que 48 horas después del tratamiento, los tres independiente siRNA mediada
HNF1A
caídas resultó en 92%, 80% y 64% extinción de
HNF1A
la expresión de ARNm en las células ASPC-1, y 98%, 74% y 65% extinción en BxPC-3 células, respectivamente (Fig. 3A y 3B). Como complemento de los datos de ARNm, análisis de transferencia Western mostró que la expresión de la proteína HNF1A en células tratadas con siRNAs específicos se redujo sustancialmente (Fig. 3C y 3D). Por otro lado, el nivel de transcripción de
HNF1A
no se vio afectada en los controles de vector. Basándose en estas observaciones, hemos utilizado siRNA1 y siRNA2 en los siguientes experimentos.
Las células fueron transfectadas de forma independiente con tres secuencias diferentes de siRNA dirigidos contra HNF1A (siRNA1, siRNA2, siRNA3), o con un control de siRNA (Control) . eficiencia de inhibición fueron evaluados por qPCR para los niveles relativos de ARNm HNF1A a las 24 h hasta las 96 h después de las transfecciones. Western Blot análisis de AsPC-1 y células BxPC-3 transfectadas con anti-HNF1A siRNAs. Los datos se muestran para los siguientes 96 h transfecciones. La expresión de β-actina se utilizó como control interno.
Impacto de
HNF1A
caída en el crecimiento celular y la apoptosis
Uso siRNA1 y siRNA2 como una herramienta eficaz para silenciar el
HNF1A
gen, encontramos que
HNF1A
caída confirió un células 2 veces mayor proliferación de AsPC-1 (Fig. 4A) y BxPC-3 (Fig. 4B). En particular, el crecimiento celular no se vio afectada por la transfección de control de vectores. Consistentemente, se observó que
HNF1A
plomo caída a una reducida población G0 /G1 20% y un 20% de aumento de la población S /fase G2 en las dos líneas celulares analizadas (Fig. 4C y 4D). Además, en comparación con el control de vector, transfección con
HNF1A
siRNAs disminuyó significativamente el porcentaje de células apoptóticas. Las células de Anexina-positivas (media ± SD) se redujo de 44,57 ± 11,57 a 13,37 ± 1,51 en las células ASPC-1, y de 54,37 ± 7,58 a 12,6 ± 2,19 en BxPC-3 células (Fig. 5).
líneas celulares de cáncer de páncreas se transfectaron con uno de los dos siRNAs HNF1A o un control de siRNA. La tasa de proliferación de las células siRNA transfectadas se evaluó mediante el ensayo CellTiter-Glo en AsPC-1 (A) y BxPC-3 (B) las células 12 h a 72h después de la transfección. la distribución del ciclo celular se determinó mediante análisis de clasificación de células activadas por fluorescencia de AsPC-1 (C) y células BxPC-3 (D). Las células se tiñeron con PI, y se analizaron para el contenido de ADN mediante citometría de flujo 72h siguientes transfecciones. Las poblaciones de células en G1, S y G2 fases se caracterizan por diferentes intensidades de PI-A de fluorescencia y se indican. Los datos se muestran en relación con el control. * P & lt;. 0.05 en comparación con cada control correspondiente
72 h después de la transfección con anti-
HNF1A
siRNAs, las células AsPC-1 y BxPC-3 fueron teñidas con anexina conjugado FITC -V /PI. Porcentaje de células de Anexina-V /PI-manchado se determinó por citometría de flujo. gráfico de puntos se divide en un cuadrante: (1) células necróticas, (2) las células apoptóticas tarde, las células (3) que viven, y (4) células apoptóticas temprana. Gráfico de barras que muestra el porcentaje de células apoptóticas. Los valores se expresan como media ± desviación estándar de tres experimentos diferentes. * P & lt;. 0,05 en comparación con el control
Pérdida de
HNF1A
activa la vía de señalización Akt /mTOR
La vía de señalización Akt /mTOR es crucial para muchos aspectos del crecimiento celular, la supervivencia y la apoptosis [24]. La activación constitutiva de AKT /mTOR se ha implicado en la patogénesis y progresión del cáncer de páncreas [25]. Para dilucidar los mecanismos moleculares modulados por
HNF1A
inactivación en células de cáncer de páncreas, se investigó el impacto de
HNF1A
caída de AKT /mTOR vía de señalización. El uso de Western Blot, se encontró que la señalización oncogénica de fósforo-AKT y mTOR su phosphor- aguas abajo estaban reguladas hasta después de la transfección con
HNF1A
siRNAs en ambas células AsPC-1 y BxPC-3 (Fig. 6). De acuerdo con ello, los niveles de fosforilación de AKT en Ser473 y Thr308 significativamente se aumentaron en comparación con su control correspondiente. Al mismo tiempo, los niveles de fosforilación de mTOR Ser2448 fueron notablemente mejorados. No se observó ningún efecto sobre la expresión de AKT total y mTOR. IHC análisis emparejado en el tumor y los tejidos normales de páncreas también encontraron niveles significativamente más altos de AKT fosforilada y mTOR en los tumores que en los tejidos normales (Fig. 2, Tabla 1).
AsPC-1 y BxPC-3 células fueron transfectadas con el control de siRNA y dos
HNF1A
diferentes siRNAs como se indica. 96 horas después de la transfección, lisados celulares se sometieron a inmunotransferencia con el anticuerpo anti-HNF1A, Ser473 anticuerpo anti-fosfo-AKT, anti-fosfo-AKT anticuerpo Thr308, y el anticuerpo anti-fosfo-mTOR Ser2448. Las membranas fueron despojados y re-probaron con anticuerpo anticuerpo anti-AKT, un anticuerpo anti-mTOR y anti-β-actina. Las diferencias en los niveles de proteína de plegado de expresión de células transfectadas con
HNF1A
siRNA y el control de siRNA se presentan como media ± desviación estándar de tres experimentos independientes.
Discusión
este estudio, hemos proporcionado alguna evidencia experimental de que
HNF1A
gen puede actuar como un supresor tumoral en el cáncer de páncreas. En primer lugar, la reducción de expresión de
HNF1A
se detectó en el adenocarcinoma pancreático humano, tanto en los niveles de proteína y ARNm. En segundo lugar,
HNF1A
caída en las células de cáncer de páncreas conducir a una mayor proliferación celular y la apoptosis reducida. En tercer lugar, la inhibición de
HNF1A
aumentó la activación de la vía de señalización AKT-mTOR. Estos datos son consistentes con las observaciones ya se ha informado en estudios de cáncer de hígado [15], [16]. apoyando un papel supresor de tumores de
HNF1A
en el desarrollo de los cánceres humanos.
expresión HNF1A
gen fue descubierto inicialmente en el hígado, que se muestra posteriormente que se expresa en el epitelio de varios órganos, como el páncreas, el riñón y el intestino [13].
HNF1A
ratones deficientes (
HNF1A
- /-
) nacen normalmente, pero sufren de hepática, pancreática y defectos funcionales renales [26-28] . En los seres humanos, los pacientes portadores de mutaciones mono-alélica en
HNF1A
sufren de tipo MODY 3 con disfunciones renales [8]. Las mutaciones somáticas de
HNF1A
gen han sido reportados en el hepatoma, cáncer de colon y cáncer de endometrio [16-18]. Estudios recientes han sugerido que los GWAS
HNF1A
gen se asocia con el riesgo de cáncer de páncreas [1-3], lo que provocó la investigación actual sobre el significado funcional de este gen en el cáncer de páncreas.
este estudio, el análisis de IHC de los tejidos pancreáticos humanos han demostrado que la proteína HNF1A se expresa a un nivel mayor en las células de los islotes y las células acinares en comparación con la de las células del epitelio ductal, que es consistente con la importancia funcional de este gen en el mantenimiento de la homeostasis de endocrino páncreas. Por otro lado, el ARNm y el nivel de expresión de la proteína de HNF1A (tanto por IHC y análisis de transferencia Western) fue significativamente menor en los tumores pancreáticos que en los tejidos no tumorales circundantes, que es consistente con un posible papel supresor de tumor de este gen en cáncer de páncreas.
La función supresora de tumores de HNF1A está también apoyada por los resultados de los experimentos de genes desmontables. Hemos observado que la inhibición de
HNF1A
por siRNAs en células de carcinoma de páncreas produjo un aumento significativamente a la proliferación celular. Resultados similares han sido previamente informado por Molero X et al que HNF1A
- /- ratones muestran aumento de la proliferación de células acinares en condiciones basales y después de la inducción pancreatitis [29]. Para comprender mejor el mecanismo de
HNF1A
-inactivation crecimiento celular inducida, hemos demostrado, además, que la baja regulación de
HNF1A
dio lugar a una disminución de la fase G0 /G1, un aumento de la fase S, y un leve aumento de la fracción de fase G2 /M. Un estudio previo realizado en líneas celulares de hepatoma ha encontrado niveles elevados de ciclina D1 en respuesta a
HNF1A
inactivación [16]. Se necesitan más estudios para demostrar qué regulador del ciclo celular modula la
HNF1A
la proliferación mediada por siRNA en líneas celulares de cáncer de páncreas.
A continuación mostramos una tasa de apoptosis reducida en
HNF1A
células de carcinoma de páncreas -inactivated. Este efecto parece en contradicción con las observaciones realizadas en las células beta pancreáticas humanas. Varios estudios anteriores han demostrado que la sobre expresión de un mutante dominante negativo de
HNF1A
(DN-HNF1A) dio como resultado la disminución phosphoinositide-3 quinasa actividad (PI-3K) /Akt, en la atenuación de este modo el crecimiento y la proliferación celular y células beta de sensibilización a la apoptosis [28], [30 a 32]. Esta discrepancia podría resultar de diferencia en la celda y el proceso patológico, y mostrar el efecto de complejo
HNF1A
en diferentes tipos de células y de procesos patológicos.
explicará adicionalmente las vías de señalización corriente abajo que ejerce HNF1A su función supresora de tumores en el cáncer de páncreas y se encontró que
HNF1A
caída activado Akt /mTOR vía de señalización. El eje de señalización de PI3K /Akt /mTOR desempeña un papel crítico en la regulación de la proliferación celular, la apoptosis, la angiogénesis y la metástasis, que es fundamental para el desarrollo y mantenimiento de las células cancerosas. PI3K aberrante de señalización /Akt es común en cáncer de páncreas [33], [34]. Nuestros datos muestran que
HNF1A
-inactivation aumentó significativamente los niveles de Akt Ser473 y Thr308 fosforilación y la fosforilación de mTOR 2248. Se sabe que la fosforilación de Akt en Thr 308 puede regular la síntesis de proteínas y la proliferación celular mientras que la fosforilación de Akt en Ser 473 se asocia con la resistencia a la apoptosis mediante el control de la localización subcelular de las proteínas pro-apoptóticas [35]. Se sabe que la mTOR, una serina-treonina quinasa, está regulada por la fosforilación en Ser2448 en respuesta a la señalización oncogénica de PI3K /Akt. mTOR regula el crecimiento celular, la proliferación celular, la motilidad celular, la supervivencia celular, la síntesis de proteínas, y la transcripción. Por lo tanto es posible que el impacto de
HNF1A
-inactivation sobre el crecimiento celular y la apoptosis son, al menos en parte, a través del mecanismo de activación de la vía de señalización de AKT /mTOR.
pancreatitis crónica es un conocido factor de riesgo para el cáncer de páncreas. Los genes que regulan la regeneración de páncreas también pueden estar involucrados en el desarrollo de la pancreatitis crónica, y la carcinogénesis pancreática. Un estudio reciente llevado a cabo en un modelo animal de la pancreatitis ha demostrado una expresión baja regulado lesión sensible de
HNF1A
en las células acinares [29], que se relacionó con un aumento de la proliferación de las células acinares y la reducción de las enzimas digestivas. Al parecer HNF1A controla transcripcional programas específicos de tejido, ya que mejora el crecimiento de células en los islotes pancreáticos, pero suprime la proliferación celular en hepatocitos [36]. La inhibición de la proliferación celular en las células acinares y células epiteliales ductales podría ser uno de los principales mecanismos que enlazan HNF1A en la carcinogénesis pancreática. Otro estudio reciente ha demostrado también que la sobreexpresión de
HNF1A
de genes en líneas celulares de cáncer de páncreas inhibe el crecimiento celular, inducida G
0 /G
1 detención y la apoptosis [37]. Estos efectos se correlacionaron con HNF1A inducida por la baja regulación de los genes del ciclo celular y la disminución de la expresión de los genes anti-apoptóticos [37].
En conclusión, hemos demostrado que
HNF1A
expresión se reduce significativamente en los tumores de adenocarcinoma de páncreas humano. El bloqueo selectivo de los
HNF1A fotos: por siRNA promovió significativamente la proliferación de células de cáncer de páncreas y inhibe la apoptosis in vitro. Hemos puesto de manifiesto, además, que
HNF1A
caída activa vía en líneas celulares de cáncer de páncreas señalización Akt /mTOR. Estos resultados apoyan un posible papel supresor de tumores de
HNF1A
en el cáncer de páncreas.