Extracto
La hipoxia se sabe que juega crítica papeles en la supervivencia celular, la angiogénesis, la invasión tumoral y la metástasis. La hipoxia mediada se ha demostrado la sobreexpresión del factor inducible por hipoxia (HIF) para ser asociada con la resistencia terapéutica, y contribuye a un mal pronóstico de pacientes con cáncer. Emergentes evidencia sugieren que la hipoxia y HIF vías contribuye a la adquisición de epitelio-to-mesenquimal transición (EMT), el mantenimiento de las funciones celulares madre de cáncer (CSC), y también mantiene el ciclo vicioso de inflamación, todo que conducen a la resistencia terapéutica. Sin embargo, el mecanismo molecular preciso (s) por el cual la hipoxia /HIF impulsa estos eventos no se entienden completamente. Aquí, se muestra, por primera vez, que la hipoxia conduce a aumento de la expresión de VEGF, IL-6, y CSC firma genes Nanog, Oct4 y EZH2 coherente con el aumento de la migración de células /invasión y la angiogénesis, y la formación de pancreatospheres, concomitante con aumento de la expresión de miR-21 y miR-210 en células humanas de cáncer de páncreas (CP). El tratamiento de células PC con CDF, un compuesto sintético novela inhibió la producción de VEGF y de IL-6, y el regulado de la expresión de Nanog, Oct4, EZH2 mRNAs, así como miR-21 y miR-210 en condiciones de hipoxia. CDF también condujo a la disminución de la migración de células /invasión, la angiogénesis, y la formación de pancreatospheres en condiciones de hipoxia. Por otra parte, CDF disminución de la expresión de genes de miR-21, miR-210, IL-6, HIF-1α, VEGF, y las firmas de CSC
in vivo
en un modelo ortotópico de ratón de PC humano. En conjunto, estos resultados sugieren que la actividad antitumoral de CDF está parcialmente mediada a través de la desregulación de las vías del tumor hipóxicas, y por lo tanto CDF podría convertirse en una novela, y el agente antitumoral eficaz para la terapia PC
Cita.: Bao B, Ali S, Ahmad A, Azmi AS, Li Y, Banerjee S, et al. (2012) inducida por hipoxia agresividad de las células del cáncer pancreático se debe a una mayor expresión de VEGF, IL-6 y miR-21, que pueden atenuarse mediante tratamiento CDF. PLoS ONE 7 (12): e50165. doi: 10.1371 /journal.pone.0050165
Editor: Daotai Nie, Escuela de Medicina de la Universidad del Sur de Illinois, Estados Unidos de América
Recibido: 26 Agosto, 2012; Aceptado: 22 Octubre 2012; Publicado: 13 de diciembre 2012
Derechos de Autor © 2012 Bao et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado por el Instituto Nacional del cáncer de los Institutos nacionales de Salud subvenciones R01CA131151, R01CA132794 y R01CA154321 otorgan a FHS, y el Departamento de Defensa de exploración de la hipótesis del desarrollo PC101482 premio otorgado a Bin Bao. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. El co-autor Dr. Sarkar es un miembro del Consejo Editorial PLoS ONE. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales.
Introducción
cáncer de páncreas (CP) es una de las enfermedades malignas más mortales con los más pobres clínica resultado en el mundo. En 2012, se ha estimado que 43, 920 sujetos se les diagnosticará con PC, y representarán el 37, 390 muerte por cáncer en los Estados Unidos [1]. Debido a la ausencia de síntomas específicos, la falta de técnicas de detección temprana, y fenotipos muy agresivos, PC está por lo general se diagnostica en una etapa avanzada-incurables y metastásicos [2], [3]. Por lo tanto, la mediana de supervivencia global es de aproximadamente seis meses después de los tratamientos quirúrgicos y quimio-radiación para los estadios localmente avanzados y metastásicos de PC. En consecuencia, la tasa de supervivencia global a los cinco años es menor del cinco por ciento. Tal tasa de supervivencia más corta se debe principalmente a un diagnóstico tardío y la resistencia terapéutica, contribuyendo a la recurrencia del tumor y la metástasis.
La hipoxia es uno de los fenómenos biológicos fundamentales que están fuertemente asociadas con el desarrollo y la agresividad de una amplia variedad de tumores sólidos, incluyendo PC. factores inducibles por hipoxia (HIF) son un factor de transcripción central que media la hipoxia genes de respuesta y han sido ampliamente aceptadas para jugar un papel crítico en la invasión tumoral, la metástasis, y la resistencia al tratamiento, debido a su aumento de la proliferación celular, la supervivencia, la angiogénesis y la migración celular y la invasión [4], [5]. Por lo tanto, la hipoxia tumoral con la expresión alterada de HIF y su resultado efecto biológico en más pobre resultado clínico de los pacientes diagnosticados con tumores sólidos, lo que resulta en una mayor mortalidad, lo que sugiere que la comprensión de la relación molecular de la hipoxia con otras características moleculares y celulares de la agresividad del tumor, sería muy valiosa para el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas para el tratamiento del desarrollo de tumor sólido y la progresión. Ha sido ampliamente aceptado que las células madre del cáncer (CSC) y la transición epitelio-mesenquimal transición (EMT) células fenotípicas están altamente relacionados con la resistencia terapéutica y contribuye al crecimiento agresivo del tumor, invasión y metástasis, y son comúnmente considerados como una de las principales causas de la recurrencia del tumor y la recaída [6]. Los datos de aumento del número de estudios indican que la hipoxia y HIF señalización principal vía para el enriquecimiento de células madre cancerosas y células EMT tal como fue revisado recientemente [7], lo que contribuye al fenotipos agresivos del tumor, lo que también podría ser debido a la desregulación de microRNAs (miRNAs).
Los miRNAs son bien reconocidos a jugar un papel fundamental en una amplia variedad de procesos biológicos, como la diferenciación celular, la proliferación, la muerte, la supervivencia, el metabolismo y la homeostasis de la energía [8], [9]. La acumulación de pruebas sugiere que miRNAs podrían tener un papel crítico en el desarrollo y progresión de disaeses malignas. Las alternancias de miARN expresión según los informes, han sido asociados con el resultado clínico de los pacientes tumorales, la resistencia al tratamiento, la recurrencia del tumor y /o recaída. Un gran número de miRNAs se han notificado a ser sensible a la hipoxia y la vía de señalización de HIF en una amplia variedad de células y tejidos, incluyendo células del cáncer [10] - [13]. Se ha encontrado que la hipoxia disminuyó la expresión de miR-101, una molécula anti-oncogénico potencial, y aumento de la expresión de miR-21 y miR-210, las moléculas pro-oncogénica en varios tipos de cáncer incluyendo PC [14], [15]. Así, la regulación por hipoxia mediada de miRNAs pueden desempeñar papeles importantes en fenotipos agresivos tumorales mediadas a través de la modulación de vías de señalización celular que incluyen la vía de señalización dentro de un microambiente tumoral HIF. Por lo tanto, la orientación de estos miRNAs hipoxia mediada podría proporcionar un nuevo y estrategia terapéutica eficaz para la prevención y /o tratamiento de tumores sólidos, incluyendo PC.
En este estudio, hemos examinado el efecto de la hipoxia sobre la migración celular, invasión y la angiogénesis, y la expresión de VEGF, IL-6, CSC firma genes, miR-21 y miR-210 en células PC en condiciones de hipoxia. También se investigó el papel de miR-21 en la regulación de VEGF, IL-6, la formación de pancreatospheres, y CSC firma genes en células PC. Por otra parte, hemos examinado el efecto de un derivado sintético de la novela de la curcumina (CDF) en la supervivencia celular, la migración, la invasión, la angiogénesis, la formación de pancreatospheres, y la expresión de HIF-1α, VEGF, IL-6, CSC firma genes, y miRNAs en células PC en condiciones de hipoxia. Por último, se analizó el efecto de la CDF en el miR-21, miR-210, HIF-1a, VEGF, y CSC marcadores de compás
in vivo
.
Materiales y Métodos
Reactivos y anticuerpos
Una novela CDF análogo derivado de la curcumina se sintetizó como se describe en nuestra publicación anterior [16]. Los anticuerpos contra CD44, EpCAM, y HIF-1α se obtuvieron de Cell Signaling Technology (Beverly, MA). Los anticuerpos contra Ki-67 y VEGF se adquirieron de Santa Cruz (Santa Cruz, CA). Anticuerpo contra EZH2 se obtuvo de BD Biosciences (San Jose, California). Se obtuvieron Alexa Fluor-488 de cabra anti-IgG de ratón para CD44 y tinción de EpCAM de Invitrogen. La transcripción inversa miRNA (RT) cebadores de PCR, sondas, y anti-miR-21 inhibidor se obtuvieron de Applied Biosystems (Carlsbad, CA). El cristal violeta y la solución de Matrigel se obtuvieron de Sigma Chemicals (St. Louis, MO).
Cultivo de células
cáncer de páncreas humano (PC) líneas de células ASPC-1 y MiaPaCa-2 células se mantuvieron a el cultivo estándar o condiciones de normoxia (21% de O2 y 5% CO2, 37 ° C), como se describe anteriormente [17]. Hipóxicas (1% O
2) y 5% de CO
2 condiciones fueron generados por el control de los caudales de entrada de nitrógeno y dióxido de carbono, respectivamente. Todas las líneas celulares se mantuvieron en medio DMEM FBS-10% a una condición de cultivo celular estándar. Todas las líneas celulares han sido autenticados por el Centro de Tecnología Genómica Aplicada de la Universidad Estatal de Wayne, el 13 de marzo de 2009 y se congelaron estas células autenticados para su uso posterior. El método utilizado para las pruebas era corto de perfiles de repetición en tándem utilizando el sistema PowerPlex 16 de Promega. Gemcitabina
supervivencia de la célula de ensayo
ensayo de MTT se realizó para investigar el efecto de la CDF en la supervivencia celular en células PC humanos (células AsPC-1 y MiaPaCa-2) en condiciones de hipoxia. 3.000 células se sembraron cada pocillo de las placas de 96 pocillos y se incubaron a condiciones de cultivo estándar (21% O
2 y 5% de CO
2) durante la noche. Las células se trataron entonces con diferentes concentraciones de CDF (0-0,5 M) y se incubaron durante 8 h bajo condiciones hipóxicas (1% O
2), seguido de 16 h de las condiciones de normoxia (21% O
2) cada día. Después de 3 días de tratamiento, las células se recogieron para el ensayo MTT estándar, como se describe en nuestras publicaciones anteriores [18], [19].
ensayo clonogénico
ensayo clonogénico se realizó para examinar el efecto de la CDF en el crecimiento y la proliferación de las células PC de células en condiciones de hipoxia, como se describe anteriormente [18]. 5 × 10
4 células se sembraron en una placa de 6 pocillos. Después de 3 días de la exposición a 0,5 M de CDF (8 h de condiciones de hipoxia y 16 h de condiciones de normoxia cada día), se tripsinizaron las células, y 1.000 células viables individuales se sembraron en 100 mm de placas de Petri. Las células se incubaron durante 10 a 12 días a 37 ° C en un 5% de CO
2/5% de O
2/90% N
2 incubadora. Las colonias se tiñeron con cristal violeta al 2%, se lavaron con agua, y se contaron.
Invasión de ensayo
El
in vitro
ensayo de invasión de las células PC se realizó bajo condiciones de hipoxia por utilizando Costar Transwell de 24 pocillos de placas con membrana de policarbonato (Corning Incorporated, Corning, NY), como se describe anteriormente [19]. Brevemente, 4 × 10
4 de células PC humanos (AsPC-1 y MiaPaCa-2) expuesta a 3 días de incubación en condiciones de normoxia o hipoxia condiciones, respectivamente, se sembraron en cada pocillo de las placas Transwell pre-recubiertos con Matrigel en -FBS libre de los medios de cultivo. Los pocillos de fondo del sistema se llenaron con 10% FBS medio completo. Después de 20 h de incubación, ya sea en ausencia o presencia de CDF (0,5 M), las células de cáncer invadidas se tiñeron con 4 mg /ml de calceína-AM (Invitrogen) en una solución de PBS a 37 ° C durante 1 h, siguiendo el fabricante de manual. Las fotografías fueron tomadas usando un microscopio de fluorescencia (Nikon Eclipse TE2000-U) conectado a una computadora.
cicatrización de heridas ensayo
Para examinar el efecto de la FCD sobre la migración celular de las células PC en condiciones de hipoxia , se realizó el ensayo herida de curación, tal como se describe anteriormente [17]. En pocas palabras, cuando las células AsPC-1 alcanzaron el 90-95% de confluencia, la herida fue generado por el rascado de la superficie de las placas con un 10 a 200 l de punta de la pipeta. Las células fueron incubadas en ausencia y presencia de CDF (0,5 M) y se incubaron bajo condiciones hipóxicas por 4 h, seguido de 16 h de las condiciones de normoxia, y después se fotografiaron usando un microscopio Nikon Eclipse TS100.
de formación del tubo de ensayo
Para examinar el efecto de la FCD sobre la angiogénesis
in vitro
utilizando células endoteliales vasculares en condiciones de hipoxia, se realizó el ensayo de formación de tubos, como se describe anteriormente [20]. Brevemente, 3 × 10
4 conejo células endoteliales vasculares se sembraron en cada pocillo de la placa de 96 pocillos de pre-recubierto Matrigel en 100 l de medio FBS-DMEM 10%, y se expusieron a condiciones de normoxia o hipoxia durante 4 h de incubación a 37 ° C, seguido de 16 horas de las condiciones de normoxia. La fotografía fue tomada a las 4 hy 20 h, respectivamente.
Las citoquinas VEGF e IL-6
ensayo de ensayo
ELISA se realizó para evaluar el efecto de la CDF en las producciones de citoquinas inducida por la hipoxia de VEGF y la IL-6 por células PC humanos. Los medios de cultivo de las células bajo condiciones hipóxicas o normóxicas condiciones, respectivamente, para se cosecharon 16 h para la medición de VEGF e IL-6 mediante el uso de kits de ensayo de ELISA (R & amp; D Systems)., Siguiendo el manual del fabricante
esfera ensayo de formación de
el ensayo de formación de esfera se realizó para evaluar el efecto de la CDF de la capacidad de auto-renovación de las células PC CSC en condiciones de hipoxia, como se describe anteriormente [19]. En pocas palabras, 1.000 células /pocillo de suspensiones de células individuales se sembraron en pocillos adherentes ultra bajas de las placas de 6 pocillos (Corning, Lowell, MA) en medio de la formación de la esfera (01:01 DMEM /F-12 suplementado con B-27 y N-2; Invitrogen), y se expone a condiciones de hipoxia cada dos días. Después de 7 días, las esferas con el diámetro mayor de 50 μmeters denominado como "pancreatospheres" se recogieron por centrifugación (300 xg durante 5 min), y se contaron.
inmunotinción ensayo y microscopía confocal
10.000 de suspensiones de células individuales de células PC por pocillo se sembraron y se incubaron durante 24 h utilizando pozos ultra bajas adherentes de placa de 6 pocillos (Corning, Lowell, MA) en medio de formación de esferas seguido de cultivo en condiciones de hipoxia cada dos días, como descrito arriba. Después de 7 días de tratamiento CDF, los pancreatospheres se recogieron por centrifugación (300 xg durante 5 min), se lavan con 1 x PBS, y se fijaron con paraformaldehído al 3,7% durante 10 min a temperatura ambiente. anticuerpos monoclonales CD44 y EpCAM se utilizaron para la inmunotinción ensayo, siguiendo el protocolo del fabricante, tal como se describe anteriormente [17], [21]. Los CD44 o EpCAM marcado pancreatospheres fueron fotografiados utilizando un microscopio confocal (Leica TCS SP5) con 200 × ampliación de las instalaciones MIRL Core, Escuela Universitaria de Medicina de la Wayne State.
La transfección de anti-miR-21 siRNA
2 × 10
5 células /pocillo (parentales células MiaPaCa-2) o 10.000 células (células MiaPaCa-2 esfera) por pocillo fueron sembradas en placas de seis pocillos y se transfectaron con anti-miR-21 siRNA o ARNsi de control negativo (Ambion, Austin, TX) a una concentración final de 20 nM usando el reactivo de transfección DharmaFECT (Dharmacon), siguiendo el protocolo del fabricante, tal como se describe anteriormente [17].
inversa en tiempo real transcriptase- reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR) de mRNAs y miRNAs
para determinar los niveles de ARNm relativos, se utilizaron dos microgramos de ARN total de extraídos de cada muestra para la reacción de RT en 20 l de volumen de reacción usando un sistema de transcripción inversa (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante. kit SYBR Green PCR (Applied Biosystems, Carlsbad, CA) se utilizó para la reacción de PCR en tiempo real, utilizando StepOnePlus sistema de PCR en tiempo real AB (Applied Biosystems), siguiendo el protocolo del fabricante. Las secuencias de cebadores de PCR se describieron anteriormente [19]. Los datos se analizaron utilizando C
método t y se normalizaron a la expresión de GAPDH en cada muestra. Para determinar la expresión de miRNAs en las células, se utilizó el kit TaqMan MicroARN ensayo (Applied Biosystems) siguiendo el protocolo del fabricante. Cinco ng de ARN total se transcribió de forma inversa como se describió anteriormente [19]. En tiempo real las reacciones de PCR fueron llevadas a cabo en un volumen total de mezcla de reacción de 10 l usando una solución de TaqMan PCR como se describió anteriormente [17]. Los datos fueron analizados utilizando C
método de T y se normalizaron por la expresión RNU48 en cada muestra.
Los experimentos con animales
El protocolo del experimento con animales fue aprobado por el Comité de Investigación Animal, Wayne State Universidad, Detroit, MI. severa (SCID) los ratones inmuno deficientes Mujer CB17 combinado a la edad de 4 semanas de edad se obtuvieron de Taconic Farms (Germantown, NY) y se alimentaron Lab Diet 5021 (Purina Mills, Inc., Richmond, IN). 10 × 10
6 MiaPaCa-2 células fueron implantadas de forma ortotópica en el páncreas de los ratones como se describe en nuestra publicación anterior [17], y por lo tanto no se presenta los datos de actividad antitumoral aquí. Una vez que los ratones desarrollaron tumores palpables, los animales se dividieron al azar en dos grupos: (1) control sin tratar; (2) CDF (5 mg /ratón /día), intragástrica una vez al día durante 12 días. Se realizaron mediciones de los tumores y los cambios en el peso. El tejido del tumor de todos los grupos de los animales se retiraron, se congela rápidamente en nitrógeno líquido y se almacenó a -80 ° C para su uso posterior para el ARN y la histología estudio tal como se presenta en este manuscrito.
Establecer MiaPaC-2 tumor células esfera
con el fin de examinar el efecto de CDF o anti-miR-21 en el VEGF, IL-6, firmas de CSC en subpoblación CSC-como las células tumorales, hemos desarrollado MiaPaCa-2 células del tumor en la esfera del ratón modelo de xenoinjerto, como se describe anteriormente [22]. En pocas palabras, a unos 5000 pancreatospheres de MiaPaCa-2 células fueron implantados en el modelo de xenoinjerto de ratón (4 semanas de edad) para enriquecer la población de células madre de cáncer (CSC). El tumor se retiró y las células se cultivaron en el medio la formación de esfera, como se describe anteriormente, para desarrollar las pancreatospheres secundarias, que se conoce como "células MiaPaCa-2 esfera tumor". -2 MiaPaCa células esfera tumor también se caracterizaron en nuestras publicaciones anteriores [17], [22].
La inmunohistoquímica
fijados en formalina y secciones de tejidos tumorales incluidas en parafina se evaluaron por inmunohistoquímica en el facilidad de la base del Departamento de Patología, Instituto del cáncer Karmanos, Detroit, MI, tal como se describe anteriormente [17]. Brevemente, las secciones de tejido de espesor 5-15 micras se cortaron y montaron en portaobjetos recubiertos de gelatina histológicos. Deparaffinizations de los portaobjetos se llevan a cabo mediante el uso de solución de xileno, seguido de lavado con diferentes concentraciones de alcohol y agua desionizada. La tinción inmunohistoquímica se realizó con Ki-67 (1:400), HIF-1α (1:100), VEGF (1:100), EpCAM (1:50), y EZH2 (1:50) con anticuerpos primarios y las diluciones adecuadas utilizando suero normal de acogida para los controles negativos seguido de tinción con anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano picante adecuados, siguiendo las instrucciones de los fabricantes. Los portaobjetos se desarrollaron en una solución de diaminobencidina y de contraste con una solución débil de hematoxilina utilizando kit ABC reactivo (Vector Labs), seguido de tinción nuclear mediante el uso de kit de tinción de AEC (Vector Labs). Los portaobjetos teñidos se deshidrataron y se montaron en solución Permount y examinadas por un patólogo con licencia. Las fotografías fueron tomadas con una Nikon E800 ESLIPSE con 20 × magnificación. La tinción inmunohistoquímica recibió una puntuación general en base a la intensidad de la tinción (sin tinción como cero; débil como 1+; moderada como 2+; fuerte como 3+) añadido junto con los porcentaje de células positivas (sin tinción como cero; 25% como 1+;. 25-50% como 2+ y mayor que 50% como 3 +)
El análisis estadístico
La media y la desviación estándar (SD) de los datos en este estudio se prepararon utilizando software GRAPAD Prism (versión 4.03). Las comparaciones de los resultados del tratamiento fueron probados por diferencia significativa por el
t
prueba o emparejado análisis de ANOVA. La significación estadística se supuso en un
p valor Red de menos de 0,05.
Resultados
CDF aumento de la supervivencia celular y clonogenicidad de células PC en condiciones hipóxicas
con el fin de investigar el efecto de CDF en la supervivencia celular en células PC humanos en condiciones de hipoxia, el ensayo de MTT se realizó utilizando células PC humanos (células AsPC-1 y MiaPaCa-2). Los resultados indican que CDF supervivencia celular notablemente inhibido de las células AsPC-1 y MiaPaCa-2 de una manera dependiente de la dosis (Figura 1A). ensayo clonogénico se realizó para examinar el efecto de la CDF (0,5 mol /L) en el crecimiento y la proliferación de las células PC de células en condiciones hipóxicas. Los resultados mostraron que el tratamiento CDF disminuyó clonogenicidad de AsPC-1 y MiaPaCa-2 células en condiciones hipóxicas (Figura 1B). Estos hallazgos sugieren que la CDF inhibe la supervivencia celular y el crecimiento clonogénico de células PC en condiciones de hipoxia.
Los paneles A, B, C y D representan el crecimiento celular, clonogenicidad, VEGF, y IL-6, respectivamente. Los medios condicionados se recogieron de las células cultivadas en condiciones de normoxia y de hipoxia, como se describe en la sección de métodos. Las mediciones de VEGF e IL-6 se llevaron a cabo por ELISA. Las barras en los gráficos indican la desviación estándar (DE) de al menos n = 3. * indica p. & Lt; 0,05
Efecto de la CDF en las producciones de VEGF e IL-6 citocinas en las células PC bajo condiciones de hipoxia
también se examinó el efecto de la CDF de VEGF inducida por hipoxia e IL-6 producciones de células PC utilizando un ensayo ELISA. Los resultados muestran que las células AsPC-1 y MiaPaCa-2 incubadas en condiciones hipóxicas aumentaron las producciones de VEGF e IL-6, en comparación con las células incubadas en condiciones de normoxia (Figura 1C). tratamiento CDF disminuyó notablemente la producción de VEGF inducida por hipoxia y la IL-6 en células PC (Figura 1C), lo que sugiere un papel inhibitorio de CDF en las producciones de VEGF e IL-6 en células de cáncer de páncreas humano inducida por hipoxia.
efecto de la FCD sobre la angiogénesis
in vitro
en las células endoteliales vasculares en condiciones hipóxicas
con el fin de examinar el efecto de la FCD sobre la angiogénesis
in vitro
en condiciones de hipoxia , se realizó ensayo de formación de tubo usando las células endoteliales vasculares. Los resultados muestran que las condiciones de hipoxia aumentó significativamente la formación de tubos de células endoteliales vasculares a las 4 h y 20 h de incubaciones, respectivamente, en comparación con condiciones de normoxia (p = 0,0016 y p = 0,016, respectivamente; n = 3). tratamiento CDF inhibió significativamente la formación de tubos inducida por hipoxia de las células endoteliales vasculares (p = 0,004; n = 3) (Figura 2A). Para evaluar si o no mediadas por moléculas CDF o CDF en sí contribuye a la inhibición de la formación del tubo, se recogieron los no-CDF-tratada (control) y CDF-tratada medios condicionados de células cancerosas y llevó a cabo el ensayo de formación de tubos en condiciones de normoxia. Como se muestra en la Figura 2B, las células endoteliales vasculares incubadas con condición de control de los medios de comunicación ha aumentado la formación de tubos en 4 h y 20 h, en comparación con las células incubadas con CDF-pre-tratada medio acondicionado (p = 0,029 y p = 0,011; n = 3). La adición de CDF a los medios de control acondicionado inhibió significativamente la formación de tubos, en comparación con las células incubadas tanto a los medios de control de acondicionado y CDF-pre-tratada medio acondicionado (p = 0,0001; n = 3) (Figura 2B). Estos datos sugieren que la propia CDF contribuye a la inhibición de la formación de tubos de células endoteliales vasculares
Los paneles A & amp;. B, C & amp; D, y E representan la angiogénesis, la migración celular y la invasión, respectivamente. Como se describe en la sección Métodos, angiogénesis
in vitro
se evaluó por el ensayo de formación de tubo usando las células endoteliales; la migración celular se evaluó mediante el ensayo de la cicatrización de heridas; invasión se evaluó mediante un ensayo de invasión de cámara.
Efecto de la FCD sobre la migración celular y la invasión in vitro en células PC en condiciones de hipoxia
La herida ensayo de curación se llevó a cabo para examinar el efecto de CDF sobre la migración celular de las células PC en condiciones de hipoxia. Como se muestra en la Figura 2C, las células AsPC-1 hipoxia expuesto habían aumentado la capacidad de curación de heridas, en comparación con las células cultivadas en normoxia (p = 0,0001; n = 3) (Figura 2C). tratamiento CDF inhibe la capacidad de curación de heridas en las células cancerosas en condiciones de hipoxia (p & lt; 0,05; n = 3) (Figura 2C y D). Para examinar el efecto de la FCD sobre la invasión de las células PC bajo condiciones de hipoxia, se realizó
in vitro
ensayo de invasión en. Como se muestra en la Figura 2E, tanto AsPC-1 y las células MiaPaCa-2 expuestos a condiciones de hipoxia habían aumentado la capacidad de invasión, en comparación con las células expuestas a condiciones de normoxia. tratamiento CDF inhibe la capacidad de invasión inducida por hipoxia de las células PC. Estos datos sugieren que CDF puede inhibir la migración celular inducida por hipoxia y la invasión de las células PC humanos.
Efecto de la CDF en la expresión de genes de marcadores de CSC en células PC en condiciones de hipoxia
El tiempo real ensayo de RT-PCR se realizó para examinar el efecto de la CDF en cáncer de células madre (CSC) firma genes en AsPC-1 y MiaPaCa-2 células en condiciones hipóxicas. Como se muestra en la Figura 3, la hipoxia induce los niveles de ARNm relativos de Nanog, Oct4, y EZH2 en AsPC-1 y MiaPaCa-2 células, mientras que CDF disminuyeron los niveles de Nanog, Oct4, y EZH2 mRNAs en células PC en condiciones de hipoxia.
en tiempo real RT-PCR se utilizó como se describe en la sección Métodos. Las barras en los gráficos indican desviación estándar de n = 3. * indica p & lt;. 0,05
Efecto de la CDF en la expresión de microARN (miARN) de miR-21 y miR-210 en células PC bajo condiciones hipóxicas condiciones
con el fin de examinar el efecto de la FCD sobre la expresión de los genes miARN en células PC bajo condiciones de hipoxia, que mide los niveles relativos de miR-21 y miR-210 en condiciones de hipoxia por tiempo real de RT-PCR. Como se muestra en la Figura 3, la hipoxia induce los niveles relativos de los genes miARN de miR-21 y miR-210 en AsPC-1 y MiaPaCa-2 células, mientras que CDF disminuyeron los niveles de miR-21 y miR-210 en células PC en condiciones de hipoxia, lo que sugiere que CDF es un potente agente en la atenuación de la expresión inducida por hipoxia de miR-21 y miR-210 en células PC humanos.
Efecto de la CDF o anti-miR-21 de la capacidad de auto-renovación CSC en PC humana células en condiciones hipóxicas
con el fin de evaluar el efecto de la CDF o anti-miR-21 sobre la capacidad de auto-renovación de las células PC CSC humanos bajo condiciones de hipoxia, se realizó el ensayo de formación de esferas utilizando AsPC-1 y MiaPaCa-2 células. Los resultados muestran que el anti-miR-21 se redujo la formación de pancreatospheres en MiaPaCa-2 células (Figura 4A). Estos datos sugieren que el miR-21 puede jugar un papel importante en la regulación de la capacidad de auto-renovación de las células PC-CSC similares. Del mismo modo, el tratamiento CDF disminuyó la formación de pancreatospheres en AsPC-1 y las células MiaPaCa-2 en condiciones de hipoxia (Figura 4A).
Los paneles A, B y C representan la formación de pancreatospheres, la expresión de CD44 y EpCAM, y la producción de VEGF y de IL-6, respectivamente. El ensayo de formación de esfera se realizó para examinar la capacidad de auto-renovación de células madre cancerosas en células PC, como se describe en la sección Métodos. de imágenes de microscopía confocal (200 aumentos) se llevó a cabo para medir CSC marcadores de superficie celular CD44 y EpCAM en las células esfera tumor MiaPaCa-2, como se describe en la sección Métodos. Las barras en los gráficos indican desviación estándar de n = 3. * indica p. & Lt; 0,05
Efecto de la CDF o anti-miR-21 en la expresión de proteínas marcadoras de la superficie celular CD44 y CSC EpCAM en PC las células derivadas de células esfera en condiciones hipóxicas
Para examinar si o no CDF o anti-miR-21 inhibe la expresión de marcadores de superficie celular CD44 y CSC EpCAM en células CSC-como derivados de células PC, se realizó confocal de imágenes de microscopía para la evaluación de la expresión de CD44 y EpCAM en las células MiaPaCa-2 iniciadas células esfera derivados del tumor. Los resultados muestran que el anti-miR-21 disminuyó la expresión de CD44 y EpCAM en MiaPaCa-2 células esfera tumor en condiciones de hipoxia, en consonancia con los resultados del tratamiento de CDF (Figura 4B). Estos datos sugieren que la CDF regula hacia abajo la formación de células esfera MiaPaCa-2 tumorales consistentes con la baja regulación de la expresión de CD44 y EpCAM, que es en parte mediada por disminución de la expresión de miR-21.
Efecto de la FCD o anti-miR-21 en el VEGF e IL-6, la producción en los MiaPaCa-2 células tumorales esfera en condiciones de hipoxia
Tal como se muestra en la Figura 4C, 2-esfera MiaPaCa células tumorales producidos relativamente mayor cantidad de VEGF en condiciones hipóxicas condiciones, en comparación con sus padres MiaPaCa-2 células (2.174 pg /ml /10
4 MiaPaCa-2 células esfera del tumor frente a 3248 mL /10
6 células pg /MiaPaCa-2; la Figura 1C y 4C), lo que sugiere que las esferas MiaPaCa-2 tumorales pueden promover la angiogénesis por hasta la regulación de la producción de VEGF. También se encontró que el tratamiento CDF disminución de la producción de VEGF inducida por hipoxia en MiaPaCa-2 células tumorales esfera. Del mismo modo, las células MiaPaCa-2 esfera producen relativamente mayor cantidad de la hipoxia inducida por IL-6, en comparación con sus células parentales (18 pg /ml /10
4 MiaPaCa-2 células esfera vs 164 pg /ml /10
6 parentales células MiaPaCa-2; la Figura 1D y 4C). CDF tratamiento o deficiencia de miR-21 por anti-miR-21 transfección disminuyeron la producción de la hipoxia inducida por la IL-6 en las células esfera CSC-como (Figura 4C).
Efecto de la CDF o miR-21 deficiencia en la expresión de genes de HIF-1α, VEGF, IL-6, CD44, EpCAM, y EMT marcadores de fenotipo en las células esfera MiaPaCa-2 tumorales en condiciones de hipoxia
Como se muestra en la Figura 5A, la disminución de tratamiento CDF la los niveles de ARNm relativos de HIF-1α, VEGF, IL-6, CD44, y EpCAM en MiaPaCa-2 células esfera tumor en condiciones de hipoxia. Del mismo modo, la baja regulación de miR-21 por anti-miR-21 transfección disminución de la expresión de estos genes en MiaPaCa-2 células tumorales esfera en condiciones de hipoxia. También se examinó si o no CDF o deficiencia de miR-21 regula la expresión de genes marcadores de EMT en MiaPaCa-2 células tumorales esfera en condiciones de hipoxia. Se encontró que la inactivación de miR-21 expresión dio lugar a una disminución significativa en los niveles de ARNm relativos de EMT marcadores mesenquimales ZEB1 y vimentina, y aumentó el nivel de mRNA relativa de epitelio marcador de E-cadherina en las células de la esfera del tumor bajo condiciones de hipoxia (Figura 5A ). Del mismo modo, CDF disminuyó los niveles de mRNA de ZEB1, vimentina, y el giro en la esfera células tumorales bajo condiciones de hipoxia (Figura 5A).
Los paneles A y B representan los mRNAs y miRNAs, respectivamente. Las células fueron transfectadas con esfera anit-miR-21 utilizando el reactivo de transfección, siguiendo el manual del fabricante. en tiempo real RT-PCR se utilizó como se describe en la sección Métodos. Las barras en los gráficos indican desviación estándar de n = 3. * indica p & lt;. 0,05
Efecto de la CDF en la expresión de los genes miARN en MiaPaCa-2 células tumorales esfera en condiciones hipóxicas
evidencia experimental reciente ha demostrado que la hipoxia podría regular la expresión de un número de miRNAs, incluyendo anti-oncogénico (let-7 y miR-101), y pro-oncogénicos miRNAs (miR-21 y miR-210) [10], [ ,,,0],12], [13], [15], [23], [24].