Extracto
El cáncer gástrico (CG) es una de las principales causas de muerte por cáncer en el mundo. El papel de la histona desacetilasa 4 (HDAC4) en tipos de células y tejidos específicos ha sido identificado. Sin embargo, sus papeles biológicos en el desarrollo de cáncer gástrico permanecen en gran parte sin explorar. cuantitativa en tiempo real PCR (qRT-PCR) y transferencia de Western se utilizaron para analizar la expresión de HDAC4 en las muestras clínicas. siRNA y la sobreexpresión de HDAC4 y siRNA p21 se utilizaron para estudiar los efectos funcionales en una proliferación, una formación de colonias, una de adenosina 5'-trifosfato (ATP) de ensayo y especies reactivas de oxígeno (ROS) de generación, el ciclo celular, las tasas de apoptosis de las células, y la autofagia ensayos. HDAC4 fue hasta reguladas en tejidos de cáncer gástrico y varias líneas celulares de cáncer gástrico. La proliferación, la capacidad de formación de colonias y el nivel de ATP en las células se mejoraron SGC-7901 HDAC4 sobreexpresión, pero inhibidas en HDAC4 desmontables células SGC-7901. HDAC4 caída condujo a la detención de células G0 /G1 fase y causó la apoptosis y el aumento de ROS. Por otra parte, HDAC4 se encontró que inhibe la expresión de p21 en las células SGC-7901 de cáncer gástrico. desmontables p21 atenúa drásticamente la inhibición de la proliferación celular, la detención del ciclo celular, la promoción de la apoptosis y la autofagia celular sobre regulación en HDAC4-siRNA células SGC-7901. Hemos demostrado que HDAC4 promueve la progresión de células de cáncer gástrico mediada a través de la represión de p21. Nuestros resultados proporcionan una base experimental para la comprensión del mecanismo de pro-tumoral de HDAC4 como tratamiento para el cáncer gástrico
Visto:. Kang Z-H, Wang C-Y, Zhang W-L, Zhang J-T, Yuan C-H, Zhao P-W, et al. (2014) histona deacetilasa HDAC4 promueve el cáncer gástrico SGC-7901 Células progresión a través de la represión p21. PLoS ONE 9 (6): e98894. doi: 10.1371 /journal.pone.0098894
Editor: Wei-Guo Zhu, la Universidad de Pekín Centro de Ciencias de la Salud, China
Recibido: 12 de febrero de 2014; Aceptado: May 8, 2014; Publicado: 4 Junio 2014
Derechos de Autor © 2014 Kang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por una subvención del Departamento de Salud de la provincia de Jilin (núm 2012z119). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer gástrico (CG) es el cuarto cáncer más común y la segunda causa principal de muerte por cáncer en todo el mundo [1]. países de Asia y América del Sur tienen una mayor tasa de incidencia de GC de los Estados Unidos y Europa Occidental [2]. terapias más específicas se centran en el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) indicaciones relacionados en la GC avanzada. Los compuestos contra objetivos novedosos, tales como mTOR [3], (receptor del factor de crecimiento de hepatocitos) c-Met [4], y HDACs, también están bajo investigación.
desacetilasa histona 4 (HDAC4), que es una clase IIa HDAC, se sabe que existe en los complejos de correpresores de la transcripción distintos. HDAC4 es un componente crítico de la vía de respuesta al daño del ADN que actúa a través de 53BP1 [5]. HDAC4 reprime la expresión de la p21 inhibidor de la cinasa dependiente de ciclina (también conocido como p21WAF1 /Cip1) en células de cáncer humano a través de un mecanismo independiente de p53 dependiente de Sp1 [6]. HDAC4 promueve el crecimiento de células de cáncer de colon a través de la represión de p21 [7]. La inactivación de HDAC4 por pequeños ARN de interferencia o inhibidores de HDAC suprime la muerte celular neuronal [8].
El papel de HDAC4 en células específicas (HeLa (cáncer cervical), U373 (glioma), OVCAR (ovario), T98G ( glioma), HCT116 (colorrectal), NHA (astrocitos) y SKBR3 (mama)) y tejidos (corteza cerebral, testículo, próstata, y la capa epidérmica de la piel) es cada vez más claro [9]. Sin embargo, el mecanismo exacto de HDAC4 en el cáncer gástrico no se ha determinado. Por lo tanto, el propósito de este estudio fue primero para evaluar los niveles de expresión de HDAC4 en tejidos de cáncer y líneas celulares gástrico humano. En segundo lugar, el efecto de HDAC4 en las líneas celulares de cáncer gástrico se examinó utilizando la sobreexpresión y caída. Por último, se investigó si HDAC4 tenía una relación con p21 en células de cáncer gástrico. Juntos, nuestro objetivo era encontrar si HDAC4 tiene un papel biológico en el desarrollo de GC y para dilucidar el mecanismo subyacente.
Materiales y Métodos
Las muestras de tejido
Veintinueve emparejados tejidos de carcinoma gástrico primario y tejidos gástricos normales distantes se recogieron de pacientes (edad: 58,46 ± 9,17 años) durante la cirugía terapéutica de rutina en el Departamento de cirugía gastrointestinal, el primer hospital de la Universidad de Jilin. Todas las muestras se obtuvieron con consentimiento informado de acuerdo con la Declaración de Helsinki y aprobado por el Comité de Ética Humana de la Primer Hospital de la Universidad de Jilin y la Universidad de Jilin, República Popular de China. escrito el consentimiento informado se obtuvo de todos los participantes.
Líneas celulares y cultivo
Las líneas celulares de cáncer gástrico humano SGC-7901, AGS, y BGC-823 y la línea celular de epitelio gástrico normales eran GES obtenido a partir de American Type Culture Collection (Manassas, VA) y se cultivaron en medio RPMI 1640 con suero bovino fetal al 10% en una atmósfera humidificada de 5% de CO
2 en.
línea celular transfectada estable 37 ° C y transfección transitoria
El fragmento HDAC4 de longitud completa se amplificó por PCR de transcripción inversa a partir de células GES usando los cebadores específicos como se describe anteriormente [10] y se insertó en los sitios BamH I y Hind III de pcDNA3.1 (+ ) (Clontech, Hampshire, Reino Unido). El pcDNA3.1 (+) - plásmido HDAC4 se verificó mediante análisis de secuencia para confirmar la ausencia de mutaciones. células SGC-7901 se sembraron en placas de 6 pocillos y se transfectaron con el pcDNA3.1 (+) - HDAC4 y pcDNA3.1 (+) - vectores, respectivamente, utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) de acuerdo con las instrucciones proporcionadas por el fabricante durante 24 h sin selección de antibióticos. A continuación, las células se cultivaron en medio que contenía 400 mg /ml de G418 (Sigma, St. Louis, MO) hasta que todas las células en el cultivo de control no transfectadas fueron asesinados.
Se sembraron células SGC-7901 en placas de 6 pocillos y luego transfectadas con siRNA no director o siRNA dirigido contra HDAC4 humano o p21 (Santa Cruz) usando Lipofectamine 2000 de acuerdo con las instrucciones proporcionadas por el fabricante. experimentos de estiramiento se realizaron en células de 48 o 72 h después de la transfección.
aislamiento de ARN y cuantitativa en tiempo real PCR (qRT-PCR)
ARN total fue aislado de tejidos o células por el reactivo TRIzol ( Invitrogen), y transcripciones inversas se realizaron utilizando el kit Takara RNA PCR (Takara, Dalian, china) siguiendo las instrucciones del fabricante. PCR cuantitativa se realizó utilizando un SYBR Green Premezcla Ex Taq (Takara, Japón) en un sistema de PCR en tiempo real (Eppendorf, Alemania). La expresión proporción relativa de cada tejido tumoral y no tumoral emparejados se calculó por la 2
método -ΔΔCT.
Recuento de células Kit-8 (CCK-8) de ensayo
Las proliferaciones de las células SGC-7901 se evaluaron usando un ensayo de CCK-8 (Beyotime, Jiangsu, china) de acuerdo con el protocolo recomendado por el fabricante. Brevemente, las células se cultivaron en una placa de 96 pocillos a una concentración de 2000 células por pocillo. A 0, 1, 2 y 3 días después de la transfección, el ensayo de proliferación celular se realizó mediante la adición de 10 l de solución de CCK8 a cada pocillo, seguido de incubación a 37 ° C durante 2 h. La absorbancia se midió por un lector ELISA a una longitud de onda de 450 nm.
Colonia ensayo de formación de
resumen, las células SGC-7901 HDAC4 sobreexpresan y -knockdown se sembraron por triplicado (1.000 células por 60 mm placa de cultivo) y se incubó a 37 ° C durante dos semanas para formar clones. Las células se lavaron con PBS, se fijaron con 4% de paraformaldehído durante 15 min, y se tiñeron con violeta cristal (0,5% de cristal violeta, 1% de paraformaldehído y 20% de metanol en PBS) durante 30 min. Las colonias sobre cada placa se contaron, y la supervivencia celular se expresó como un porcentaje del número de colonias supervivientes en las placas de control.
ciclo celular análisis
Las células se recogieron y se resuspendieron suavemente en suspensiones de células individuales en células activadas por fluorescencia (FACS) de tampón (PBS que contiene 2% de FBS). Las células se lavaron con PBS dos veces y se fijaron en etanol frío durante la noche 70%. Las células fueron lavadas dos veces con PBS frío, se resuspendieron en solución de RNasa A y se incubó durante 30 min a 4 ° C. La suspensión se añadió a 0,05 mg /ml de yoduro de propidio (Beyotime) seguido de incubación a 4 ° C durante 30 min y el análisis usando FACSCalibur (BD Biosciences, San Jose, CA).
apoptosis de la célula de ensayo
yoduro de propidio (PI, 1 mg /ml) y Anexina V-FITC (1 mg /ml) se utilizaron para la determinación de la apoptosis celular. Brevemente, las células se tripsinizaron y se incubaron con PI y Anexina V-FITC durante 15 min a 37 ° C. Las muestras se detectaron usando un flujo FACS Calibur citómetro. Todos los experimentos se realizaron por triplicado.
niveles de adenosina intracelular 5'-trifosfato (ATP) ensayo de
Los niveles intracelulares de ATP se analizaron utilizando bioluminiscencia [11]. Brevemente, las células se lisaron y se centrifuga a aproximadamente 15.000 g durante 10 min a 4 ° C. Los sobrenadantes se mezclaron después con una solución de trabajo de mezcla de ensayo de ATP (Sigma), y la cantidad de luz emitida se midió inmediatamente con un luminómetro (Thermo Scientific Luminoskan Ascenso, Walthan, MA). Los datos de luminiscencia se normalizaron por las cantidades de proteínas de la muestra (medido usando un ensayo de BCA).
especies reactivas de oxígeno (ROS) de medición
Generación de ROS intracelular se examinó utilizando 6-carboxi-2 ' , 7'-diacetato diclorofluoresceno (H
2DCFDA). Brevemente, 5 × 10
4 células se sembraron en placas de 60 mm y dejó que se unieran durante la noche. Las células se tiñeron con 5 mM H
2DCFDA durante 30 min a 37 ° C y luego se recogieron, y la fluorescencia se analizó con un espectrómetro de fluorescencia (Flex StationII 384, Molecular Devices) a 485 nm (excitación) y 538 nm ( emisión). niveles de oxidantes celulares se expresaron como relación de fluorescencia DCF por las cantidades de proteína de la muestra (método BCA). En algunos experimentos, las células fueron pretratadas con 10 mM de
N-acetilcisteína
(NAC) antes del análisis de la generación de ROS.
Western blot
Las células fueron lisadas en IP tampón de lisis (Beyotime), se desnaturalizó durante 10 min a 95 ° C, cortado con una jeringa de insulina, y se resolvió en geles de SDS /PAGE. Después de la inmunotransferencia, las membranas se bloquearon y se incubaron con anticuerpos primarios en PBS /0,1% Tween-20 con leche en polvo desnatada al 5%. Los anticuerpos dirigidos contra HDAC4, p21, LC3, Beclin 1, Atg 7, caspasa 3, 9, Bcl-2, Bax y anti-β-actina fueron todos adquiridos de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz). detección quimioluminiscente se ensayó usando un kit de detección ECL (Pierce, Rockford, IL, EE.UU.). Los resultados fueron analizados mediante un software Cantidad de obtener la relación de densidad óptica de proteína diana de ß-actina.
inmunofluorescencia
Las células se sembraron en cubreobjetos, se fijaron con paraformaldehído al 4% (Sigma Aldrich) durante 10 minutos y se permeabilizaron con 0,1% Triton X-100 /PBS. Las células se bloquearon con 1% de BSA durante 1 h, seguido de incubación durante toda la noche a 4 ° C con el anticuerpo anti-LC3, y luego las células se incubaron con anticuerpo secundario conjugado con FITC (Beyotime) durante 1 h. Los núcleos se tiñeron con 4,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI; Sigma). La imagen de fluorescencia se visualizó usando un microscopio confocal de barrido láser (Carl Zeiss, Oberkochen, Alemania).
El análisis estadístico
Todos los datos son representativos de al menos tres experimentos independientes. Los datos se presentan como la media ± S.E.M. La significación estadística se calculó por análisis de una vía de la varianza (ANOVA) o por la prueba t de Student entre los dos grupos usando GraphPad Prism 5 software estadístico.
P
valores. & Lt; 0,05 se consideró significativo
Resultados
expresión HDAC4 fueron reguladas en el cáncer gástrico tejidos y líneas celulares
En primer lugar, expresión HDAC4 analizado en veintinueve emparejado cáncer gástrico y los tejidos no tumorales adyacentes mediante análisis de QRT-PCR y Western blot. Se encontró que HDAC4 fue significativamente hasta reguladas en el tejido carcinoma gástrico (Figuras 1A, B y C,
P ** Hotel & lt; 0,01,
P *** Hotel & lt; 0,001). Además, también se analizaron varias líneas celulares de cáncer gástrico. Se observó una mayor expresión de HDAC4 en tres líneas celulares de cáncer gástrico (AGS, BGC-823 y SGC-7901), en comparación con una línea normal gástrica célula epitelial (GES) (Figuras 1D y E,
* P & lt
; 0,05,
P ** Hotel & lt; 0,01). Por lo tanto, nuestros resultados demostraron que la expresión HDAC4 fueron hasta reguladas en ambos tejidos con cáncer gástrico y líneas celulares.
Los niveles de ARNm y proteínas de HDAC4 fueron analizados por cuantitativa en tiempo real PCR (QRT-PCR) y Western Blot en tejidos normales (NOR) o tejidos de cáncer gástrico (GC) (a) y (B) (n = 29). El análisis densitométrico de HDAC4 en la Fig. 1B (C). Los niveles de mRNA y proteína de HDAC4 se analizaron en las células normales del epitelio gástrico (células GES) y varias líneas celulares de cáncer gástrico, incluyendo AGS, BGC-823 y las células SGC-7901 (D) y (E) (n = 4). Los datos se expresan como media ± S.E.M.
* P & lt; 0,05
,
** P & lt; 0,01
,
*** P & lt;.
0,001
La expresión fue HDAC4 éxito hacia abajo o hasta reguladas en las células SGC-7901
vector de expresión
un pcDNA3.1 (+) se utilizó para sobreexpresar HDAC4 en las células SGC-7901 con el fin de examinar su eficacia como un regulador del crecimiento. Después de la transfección estable, la expresión de los niveles de ARNm de HDAC4 fue más abundante en el pcDNA3.1 (+) - células HDAC4 que en las células no transfectadas o células SGC-7901 de control negativo (NC) (Figura 2A,
** * P
. & lt; 0,001), que era consistente con el resultado del análisis de transferencia Western (Figura 2B)
expresión HDAC4 se determinó en células SGC-7901 transfectadas con el vector vacío (NC) o HDAC4 (a ) y B). expresión HDAC4 se determinó en células SGC-7901 transfectadas con oligos siRNA dirigidos HDAC4 (si-HDAC4) o revueltos siRNA (si-NC) de QRT-PCR y Western blot (C) y (D) (n = 4). Los datos se expresan como media ± S.E.M.
*** P & lt;.
0,001
Para evaluar la eficacia del silenciamiento de genes humanos HDAC4-siRNA, se midió el grado de expresión de la proteína HDAC4 después HDAC4-siRNA transfección y una 48-h período de incubación en la línea celular de cáncer gástrico SGC-7901 humano. En tiempo real PCR análisis mostró que la infección HDAC4 siRNA dado lugar a un 36,3% de caída en los niveles de ARNm HDAC4 (Figura 2C,
P *** Hotel & lt; 0,001). El análisis de transferencia Western mostró que la proteína HDAC4 se redujo significativamente (Figura 2D), en consonancia con su reducción de ARNm. Tomados en conjunto, estos datos sugieren que HDAC4 siRNA podría suprimir significativamente la expresión endógena HDAC4.
HDAC4 promovió la proliferación celular y la formación de colonias
A continuación, se examinó el efecto de HDAC4 sobre el crecimiento celular. La proliferación celular se examinó utilizando Cell Counting Kit-8 (CCK-8) en los puntos temporales de 24, 48 y 72 h. Las curvas de crecimiento mostraron que cuando HDAC4 era la sobreexpresión en células SGC-7901, el crecimiento de las células se incrementó en 1,5 veces en comparación con el grupo control en el día 3 (Figura 3A,
* P
& lt; 0,05,
∧∧P Hotel & lt; 0,01). Además, el ensayo de formación de colonias muestra un aumento dramático de 2 veces en el número de colonias cuando las células SGC-7901 fueron transfectadas con el pcDNA3.1 (+) - HDAC4 relación con el grupo NC (Figuras 3B y C,
** P
. & lt; 0,01)
La curva de crecimiento (
* P & lt; 0,05
y
∧∧P & lt; 0,01
en comparación con el grupo NC) (A), formación clon (B) y (C) y el nivel de ATP relativa y la generación de ROS (G) en las células SGC-7901 transfectadas con pcDNA3.1 vacío (+) - vector (NC) o HDAC4. La curva de crecimiento (
∧P & lt;
0,05 en comparación con el grupo si-NC) (D), la formación clon (E) y (F) en las células SGC-7901 transfectadas con siRNA oligos dirigidos HDAC4 (si-HDAC4) o con oligo siRNA revueltos (si-NC). El efecto antioxidante de la
N-acetilcisteína
(NAC) en el nivel de ATP relativa y la generación de ROS en células SGC-7901 transfectadas con si-si-NC o HDAC4 (H). Los datos se expresan como media ± S.E.M.
* P & lt; 0,05
,
** P & lt; 0,01
,
∧P & lt; 0,05
,
∧∧P. & Lt; 0,01
también examinamos los efectos de HDAC4 baja regulación en las células SGC-7901. El ensayo y la formación de colonias de ensayo CCK-8 mostró que el HDAC4 baja regulación suprimió la capacidad de proliferación (Figura 3D,
∧P
& lt; 0,05) y el número de formación de colonias de SGC-7901 células (Figuras 3E y F,
P ** Hotel & lt; 0,01). En resumen, estos datos sugieren que HDAC4 podría ser un promotor del crecimiento en las células SGC-7901.
HDAC4 aumentó los niveles de ATP y la disminución de la generación de ROS
Un aumento en los niveles de ATP en las células que sobreexpresan HDAC4 era observada en comparación con las células NC SGC-7901 (Figura 3G,
* P
& lt; 0,05). Por otra parte, el nivel de ATP se redujo en las células HDAC4 desmontables (Figura 3H,
P * Hotel & lt; 0,05).
Debido a que la generación de ROS intracelular puede estar relacionado con la disfunción mitocondrial, que examinó si HDAC4 podría estimular la generación de ROS en las células SGC-7901. Los resultados demuestran que se observó una reducción significativa de la generación de ROS en pcDNA3.1 (+) - células HDAC4 SGC-7901 en comparación con las células NC SGC-7901 (Figura 3G,
∧P
& lt; 0,05). Mientras tanto, el silenciamiento de HDAC4 activa fuertemente la generación de ROS en células SGC-7901 (Figura 3H,
** P
& lt; 0,01). El bloqueo de la producción de ROS con el antioxidante NAC inhibió significativamente la generación de ROS (Figura 3H,
∧P Hotel & lt; 0,05). Este bloqueo de la generación de ROS por el pretratamiento de las células con NAC también impidió notablemente la pérdida de ATP en-HDAC4 siRNA células SGC-7901 (Figura 3H,
∧P
& lt; 0,05).
El abajo expresión HDAC4 -regulated células en la fase G0 /G1 detenido
la baja regulación de HDAC4 exhibió un claro aumento de la proporción de células en la fase G0 /G1 (78,74% frente a 49,92% en el CN-siRNA grupo). Hubo también una disminución correspondiente en el número de células en la fase S (12,94% en comparación con 34,61% en el grupo NC-siRNA) (Figura 4A). Los resultados de la distribución del ciclo celular quantitate, se mostró que las células SGC-7901 inducidos significativamente HDAC4 desmontables G0 /G1 detención e inhibición fago S (Figura 4B,
P * Hotel & lt; 0,05,
** P
& lt; 0,01). Por lo tanto, estos resultados sugieren que el nivel HDAC4 podría regular la progresión del ciclo celular.
citometría de flujo se representa la progresión del ciclo celular de las células SGC-7901 después de la caída de HDAC4 (A) y los perfiles del ciclo celular se analizaron para cuantificar células la distribución del ciclo (B). Las células SGC-7901 transfectadas con control mezclado (si-NC) o oligos HDAC4 siRNA (si-HDAC4) apoptosis se evaluó por citometría de flujo utilizando anexina V-FITC /PI (C). La expresión de proteínas pro y anti-apoptóticas y las caspasas 3 y 9 se ensayaron mediante transferencia de western (D). Las células se inmunotiñeron con anticuerpos anti-LC3 (FITC, verde) y los núcleos se tiñeron con DAPI (azul) y se analizaron por microscopía confocal (E). El análisis de transferencia Western de ATG7, Beclin 1 y los niveles de expresión de proteínas en células de LC3 SGC-7901 transfectadas con control mezclado (si-NC) o oligos HDAC4 siRNA (si-HDAC4) tratados con o no con 3-MA (F). Los datos se expresan como media ± S.E.M.
* P & lt; 0,05
,
** P & lt;.
0,01
El abajo reguladas HDAC4 expresión inducida por la apoptosis y la autofagia
Para estudiar si la inhibición del crecimiento celular inducida por HDAC4 regulada hacia abajo estaba relacionado con apoptosis de las células, el efecto de HDAC4 regulada abajo-en apoptosis de las células se evaluó por citometría de flujo utilizando anexina V-FITC /PI tinción doble. Se observó que la apoptosis aumentó notablemente en HDAC4-siRNA células SGC-7901 en comparación con el grupo NC-siRNA (Figura 4C). Además, confirmó la inducción de la apoptosis a través de la activación de caspasa-3 y 9 por Western blot. El análisis reveló que HDAC4 las reguladas aumentó la escisión de las caspasas 3 y 9 en comparación con el grupo NC-siRNA. La expresión de la proteína anti-apoptótica Bcl-2 y la proteína pro-apoptótica Bax también fueron cuantificados. La relación de Bax /Bcl-2 fue significativamente mayor en HDAC4 siRNA células SGC-7901, en comparación con el grupo NC-siRNA (Figura 5D).
La expresión de p21 se analizaron mediante transferencia Western en células SGC-7901 transfectadas con pcDNA3.1 vacío (+) - vector (NC) o HDAC4 revuelto y el control de siRNA (si-NC) o oligos HDAC4 siRNA (si-HDAC4), respectivamente (A). El nivel de ARNm de p21 se analizó mediante qRT-PCR en las células SGC-7901 transfectadas con si-NC, si-HDAC4 solo o combinación con siRNA p21 (si-p21) (B). La curva de crecimiento de las células se midió por CCK-8 de ensayo (
* P & lt; 0,05
comparación con el grupo si-NC,
∧∧P & lt;
0,01 comparado con el grupo si-HDAC4) (C) . Los niveles relativos de ATP y la generación de ROS (D). El análisis del ciclo celular (E, F). La apoptosis se ensayó por transferencia de western (G) y citometría de flujo utilizando anexina V-FITC /PI (H) respectivamente. La autofagia se evaluó por inmunofluorescencia (I) y Western blot (J), respectivamente, en células SGC-7901 transfectadas con si-NC, si-HDAC4 solo o combinación con si-p21. Los datos se expresan como media ± S.E.M.
* P & lt; 0,05
.
** P & lt; 0,01
,
*** P & lt;.
0,001
Para investigar si la autofagia inducida HDAC4 las reguladas en las células SGC-7901, que examinado primero la localización intracelular de LC3 en HDAC4-siRNA células SGC-7901 por el análisis de inmunofluorescencia utilizando anticuerpos fluorescentes para LC3. La distribución específica de punctuate LC3 endógeno se observaron como puntos puntiformes de fluorescencia verde en HDAC4-siRNA células SGC-7901 en comparación con la de grupo NC-siRNA (Figura 4E), lo que indica que la autofagia se indujo como medio de supervivencia. La distribución subcelular de LC3 se inhibieron significativamente por la autofagia-inhibidor específico de 3-MA en HDAC4-siRNA células SGC-7901 (Figura 4E). A continuación, las proteínas relacionadas con la autofagia ATG7, beclin 1 y la relación de LC3-II a LC3-I se analizaron por Western blot. Hemos observado que los niveles de expresión de ATG7, Beclin 1 y LC3-II fueron todos significativamente superiores en HDAC4-siRNA células SGC-7901 en comparación con el grupo NC-siRNA (Figura 4F). El ATG7, Beclin 1 y la relación de LC3-II a LC3-I disminuyó notablemente en las células SGC-7901 HDAC4-siRNA que fueron tratados con 3-MA en comparación con el grupo NC-siRNA (Figura 4F).
la expresión HDAC4 las reguladas inhibe el crecimiento celular a través de p21 sobre regulación
Debido a que el tratamiento de células humanas de cáncer con inhibidores de HDAC conduce sistemáticamente a la regulación de la expresión de p21, un inhibidor de la quinasa dependiente de ciclina que es una objetivo bien establecido de los inhibidores de HDAC [6], [7], [12], hemos tratado de determinar si la sobreexpresión o desmontables de HDAC4 podrían afectar la regulación de p21 y especular el mecanismo de promoción del crecimiento HDAC4 mediada por células de cáncer gástrico.
Como se muestra en la Figura 5A, la sobre regulación de HDAC4 llevó dramáticamente a la disminución de la expresión proteína p21. Por el contrario, HDAC4 baja regulación llevó a la aumento de la expresión de p21 (Figura 5A). A continuación, examinó si la caída de p21 podría afectar el crecimiento celular y la apoptosis en células SGC-7901 en el que se suprime HDAC4. Las células SGC-7901 fueron co-transfectadas con siRNA HDAC4 y p21 siRNA. El nivel de mRNA p21 se redujo significativamente en HDAC4-siRNA células SGC-7901 después de la caída de p21 (Figura 5B,
P ** Hotel & lt; 0,01,
P *** Hotel & lt; 0,001). p21 desmontables inhibición drásticamente atenuada la proliferación celular en las células SGC-7901-HDAC4 siRNA (Figura 5C,
P * Hotel & lt; 0,05, ∧∧
P Hotel & lt; 0,01). El nivel de ATP se incrementó, pero la generación de ROS intracelular disminuyó en el grupo de siRNA-p21-HDAC4 en comparación con el grupo de siRNA HDAC4 (Figura 5D,
* P
& lt; 0,05,
** P & lt
; 0,01). p21 regulación a la baja significativamente atenuada G0 /G1 detención y la inhibición del fago S en HDAC4-siRNA SGC-7901 células (Figuras 5E y F,
P * Hotel & lt; 0,05). La inmunotransferencia mostró que la cantidad de Bcl-2 fue significativamente más alto, pero Bax fue menor en células siRNA-p21-HDAC4 (Figura 5G). La apoptosis de las células disminuyó notablemente en siRNA-p21-HDAC4 células SGC-7901 en comparación con el grupo de siRNA HDAC4 (Figura 5H). También se observó que desmontables p21 podría rescatar el aumento de la autofagia puntuada puntos fluorescentes (Figura 5I) y Atg 7, beclin 1 y LC3II proteínas expresión en células SGC-7901 inducidos por siRNA HDAC4 (Figura 5J). En conjunto, estos datos indican que la baja regulación de p21 podría imitar el efecto de la sobreexpresión HDAC4 y podría ser un mediador importante en la promoción del crecimiento celular SGC-7901 HDAC4 mediada.
Discusión
Numerosos HDAC inhibidores, que se ha demostrado para inhibir la proliferación e inducir la diferenciación o apoptosis en las células tumorales, se están investigando en ensayos clínicos, ya sea como agentes contra el cáncer o en combinación con otro tratamiento [13]. Alta expresión de HDAC1 /2 se encuentra en los tejidos de carcinoma gástrico [14]. En nuestro estudio, hemos demostrado que la expresión HDAC4 fueron hasta reguladas en los tejidos de cáncer gástrico y líneas celulares
in vitro
. HDAC4 baja regulación en las células SGC-7901 suprimió la proliferación celular y los números de la formación de colonias, el ciclo celular detenido y la apoptosis celular inducida dependiente de la activación de las caspasas 3 y 9, que es coherente con los efectos anti-proliferativos y proapoptóticos de los inhibidores de HDAC en líneas celulares de cáncer humano [15] y con la observación de que ya se ha informado HDAC4 baja regulación reduce la supervivencia clonogénico e induce la apoptosis en células HeLa [5]. El efecto de proproliferative HDAC4 en células de cáncer gástrico es consistente con lo encontrado anteriormente en las HDAC de clase I, HDAC1, -2 y -3 [16]. Por lo tanto, dirigidas a la inhibición de la actividad HDAC4 puede ser un enfoque terapéutico potencial para tratar el cáncer gástrico.
autofagia es esencialmente un sistema de degradación de las proteínas de los propios lisosomas de la célula. Una variedad de señales de estrés, tales como el hambre de nutrientes o el tratamiento con diferentes agentes contra el cáncer, estimular el proceso de autofagia [17]. La autofagia se caracteriza generalmente por la presencia de autofagosomas y un aumento de la escisión de LC3 [18]. El papel de la autofagia en el proceso de la muerte celular es controvertida, pero se ha confirmado que la diafonía entre la apoptosis y la autofagia es esencial en la muerte celular programada [19]. En nuestro estudio, la inducción de la autofagia en las células siRNA HDAC4-SGC-7901 se evidenció por el patrón de inmunotinción puntúan de LC3 y la acumulación de proteínas sello bioquímicos de la autofagia (ATG7, Beclin 1 y LC3) por Western blot. la inhibición de la autofagia por el inhibidor de 3-MA atenúa la inducción de la autofagia en las células siRNA HDAC4-SGC-7901. Por lo tanto, se especuló autofagia puede proteger ocurrió SGC-7901 células cancerosas apoptosis inducida por la caída HDAC4.
proteína p21, también conocida como quinasa dependiente de ciclina (ERC) inhibidor 1, regula la progresión de la fase G1 del ciclo celular . p21 es a menudo mal reguladas en los cánceres humanos, y que puede actuar como un supresor de tumores o como un oncogén [20]. Aquellos con cánceres de p21-p53 positivo y negativo tienen significativamente mayores curvas de supervivencia en carcinoma gástrico [21], mientras que la pérdida de expresión de p21, junto con aumento de la detección de p53 está asociada con mal pronóstico y disminución de la supervivencia global en el cáncer gástrico [22]. De acuerdo con el resultado de que la proteína p21 se había reducido regulado en los tejidos de cáncer gástrico [23], se observó que HDAC4 promueve la proliferación de células de cáncer gástrico y el crecimiento, mediada por la represión de p21 en células de cáncer gástrico, y se acompaña de un aumento de la los niveles de ATP y la represión de la generación de ROS. Por lo tanto, hemos explorado si p21 era un mediador importante para estimular el crecimiento celular SGC-7901 HDAC4 mediada. En este estudio, HDAC4 caída inducida significativamente el aumento de la expresión de la proteína p21, mientras que la sobreexpresión HDAC4 disminuyó significativamente la expresión de la proteína p21 en las células SGC-7901. Estos datos implican que la p21 podría ser un blanco de abajo HDAC4. Análisis funcional mostraron baja regulación de p21 podría imitar el efecto de la sobreexpresión de HDAC4 SGC-7901 de promoción del crecimiento celular. Tomados en conjunto, estos resultados sugieren que HDAC4 baja regulación podría promover SGC-7901 apoptosis de las células por la expresión de p21-regulación. p21 podría ser un supresor tumoral en el desarrollo y progresión del cáncer gástrico, la expresión de lo que puede ayudar en el control de una variedad de comportamientos malignos de cáncer gástrico. Sin embargo, la relevancia potencial de la regulación de la expresión de p21 HDAC4 también tiene que ser visto en el contexto de que hay múltiples factores clave y las vías que potencialmente modulan la expresión de p21 en el cáncer gástrico.
En conjunto, nuestros resultados tienen revelado un papel importante para HDAC4 en el control de línea celular de cáncer gástrico humano SGC-7901 desarrollo a través de la regulación de la p21, lo que sugiere que la alteración de la expresión y /o actividad HDAC4 puede ser un evento importante durante el cáncer gástrico. En conclusión, estos hallazgos identifican HDAC4 como un importante regulador de la proliferación del cáncer gástrico mediante la represión de p21
in vitro
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