Extracto
Antecedentes
honokiol, un pequeño producto natural de peso molecular, se ha demostrado que poseen propiedades anti-tumorales y anti-angiogénicas potentes. Sus mecanismos moleculares y la capacidad de cáncer anti-gástrico siguen siendo desconocidos. Se ha demostrado que la función anti-apoptótica de las proteínas regulada por glucosa (GRP) predice que su inducción en células neoplásicas puede conducir a la progresión del cáncer y la resistencia a fármacos. Hemos explorado los efectos de honokiol sobre la regulación de GRP y la apoptosis en células de cáncer gástrico humano y el crecimiento del tumor.
Metodología y Principales conclusiones
El tratamiento de diversas células de cáncer gástrico humano con honokiol llevó a la inducción de la escisión GRP94, pero no afectó GRP78. El silenciamiento de la GRP94 por pequeños ARN de interferencia (siRNA) podría inducir la apoptosis de las células. El tratamiento de células con honokiol o quimioterapéuticos agente etopósido mejora el aumento de la apoptosis y GRP94 degradación. La actividad de la calpaína y calpaína II (m-calpaína) proteína (pero no me calpaína) μ-calpaína () nivel también podrían incrementarse mediante honokiol. GRP94 baja regulación honokiol inducida y la apoptosis en células de cáncer gástrico podría ser revertida mediante siRNA dirigidos calpaína-II y los inhibidores de calpaína. Además, los resultados de la tinción de inmunofluorescencia e inmunoprecipitación revelaron una interacción específica de GRP94 con calpaína-II en las células después del tratamiento honokiol. Seguidamente, observamos que el tumor GRP94 sobre-expresión y el crecimiento del tumor en ratones Balb /c desnudos, los cuales fueron inoculados con células de cáncer gástrico humano MKN45, se redujo notablemente por el tratamiento honokiol.
Conclusiones y Importancia
Estos resultados proporcionan la primera evidencia de que la escisión mediada por GRP94 calpaína-II honokiol inducida provoca apoptosis celular de cáncer gástrico humano. Además, sugerimos que honokiol puede ser un agente terapéutico posible mejorar el resultado clínico de cáncer gástrico
Visto:. Sheu ML, Liu SH, KH Lan (2007) honokiol Induce la calpaína mediada por la glucosa-proteína 94 regulada por escisión y células de cáncer gástrico en apoptosis humano y reduce el crecimiento tumoral. PLoS ONE 2 (10): E1096. doi: 10.1371 /journal.pone.0001096
Editor Académico: Hany El-Shemy, Universidad de El Cairo, Egipto
Recibido: 26 de Junio, 2007; Aceptado: 10 Octubre 2007; Publicado: 31 Octubre 2007
Derechos de Autor © 2007 Sheu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por becas de investigación de Consejo Nacional de Ciencia de Taiwán (NSC95-2320-B040-005). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer gástrico es la segunda causa más común de muerte por cáncer en el mundo [1]. Casi dos tercios de los casos se producen en los países en desarrollo y el 42% solo en China [1], [2]. Las dianas moleculares y mecanismos subyacentes mal pronóstico no se conocen bien. El tratamiento del cáncer gástrico localmente avanzado sigue siendo un reto importante. A pesar de los recientes avances en el tratamiento, la evolución clínica de los pacientes con cáncer gástrico sigue siendo pobre. Aparte de la cirugía, el papel de la terapia adyuvante no ha sido demostrado [2], [3]. Por lo tanto la necesidad de identificar potenciales agentes terapéuticos novedosos y quimioprotector es obvia.
honokiol, un componente activo aislado y purificado de la
Magnolia officinalis
, se ha demostrado que poseen los efectos de la antioxidación [4], contra la peroxidación lipídica [5] y anti-inflamatoria
in vitro Opiniones y en
in vivo
[6], [7]. Honokiol también ha demostrado ser un inhibidor disponible sistémicamente y no tóxico de la angiogénesis [8]. Los estudios recientes informaron que honokiol induce la apoptosis dependiente de caspasa en células de leucemia linfocítica crónica de células B y supera la resistencia a fármacos convencional en el mieloma múltiple humano por inducción de la caspasa-dependiente y -independiente apoptosis [9], [10]. A pesar de una evaluación completa del potencial clínico de los compuestos aún no es posible, la farmacocinética de honokiol se ha investigado a fondo, revelando que honokiol está disponible a la terapia del cáncer clínico. Más productos naturales que contienen una variedad de compuestos terapéuticos útiles en la prevención del desarrollo de enfermedades malignas siguen descubriendo; Sin embargo, se sabe muy poco acerca de sus mecanismos subyacentes de la acción o de su diana molecular.
proteína regulada por glucosa (GRP) 94 es una glucoproteína más abundante en el retículo endoplasmático (ER) y sólo ser identificados en los vertebrados. El exceso de expresión antisentido y ribozima enfoques en sistemas de cultivo de tejidos demostrado directamente que GRP78 y GRP94 podrían proteger a las células contra la muerte [11] - [13]. La función de protección de los GRP también se ha observado en la resistencia a la radiación en el cáncer cervical [14]. La función anti-apoptótica de la GRP también predice que su inducción en células neoplásicas puede conducir a la progresión del cáncer y la resistencia a fármacos [15] - [18]. Se han sugerido condiciones patológicas tales como crecimiento de tumores y los tumores malignos que se correlaciona con GRP94 proteína citoprotector sobre-expresión [19]. En el modelo de tumores malignos metastásico, una eficacia significativa de la estrategia /inmunoterapia génica basada en GRP94 se demostró cuando se combinó con radioterapia [20]. El ER juega un papel directo en la activación de un subconjunto de la caspasa durante la activación de la apoptosis que se produce durante el estrés ER [21]. Por otro lado, las calpaínas son una familia de Ca
2 + dependientes de cisteína proteasas intracelulares. Ubicua expresan proteasas calpaína-I (μ-calpaína) y calpaína II (m-calpaína) están implicados en el desarrollo de la apoptosis. Un estudio reciente ha demostrado que las calpaínas ubicuas promueven la caspasa-12 y la activación de JNK durante ER estrés inducido por la apoptosis [22]. También se ha indicado que GRP94 con Ca
2 + unión a y propiedades anti-apoptóticos es un objetivo proteolítica de la calpaína durante etopósido inducida por apoptosis [23]. Además, en varios modelos experimentales de apoptosis, se ha demostrado que la unidad inhibidora de calpaína amino-terminal de calpastatina puede ser escindida por las caspasas, lo que sugiere la escisión es esencial para la regulación de la actividad de la calpaína durante la muerte celular [24] - [28] . Caspasa-7, que es reclutado a la ER en células estresadas, podrá igualmente escinden y activar la caspasa-12 [29] - [31]. Los efectos de honokiol en la señalización y la apoptosis relacionada con el GRP todavía siguen siendo desconocidos. En el presente estudio, hemos explorado los mecanismos moleculares de la apoptosis de las células honokiol en el cáncer gástrico humano y el crecimiento tumoral
in vitro
y
in vivo
. Inesperadamente, encontramos que GRP94 se somete a escisión proteolítica específica por calpaína durante la apoptosis inducida por honokiol. Estas observaciones pueden dar evidencias de que honokiol es un agente terapéutico posible mejorar el resultado clínico de cáncer gástrico.
Resultados
Cinética de GRP94 escisión proteolítica en líneas celulares de cáncer gástrico humanos tratados con honokiol
en primer lugar nos examinamos los efectos de honokiol sobre las expresiones de GRP94 y GRP78 en varias líneas celulares de cáncer gástrico humano. Honokiol disminuye notablemente los niveles de GRP94 en la dosis y de manera dependiente del tiempo, pero los niveles de GRP78 no se ven afectados (. Las figuras 1 y 2). Cinética de honokiol inducida escisión GRP94 en diversas células de cáncer gástrico humano se muestran en la Fig. 2. MKN45 o SCM-1 en las células eran más resistentes a las respuestas honokiol inducida que las células AGS o N87; los niveles de GRP94 se redujeron a alrededor de 50% para el doble de tiempo. Los niveles de proteínas de GRP78 se mantienen sin cambios en todas las cuatro líneas celulares de cáncer gástrico. Por otra parte, hay poco expresiones proteína GRP94 en el tejido normal de ratón epitelio gástrico y las células endoteliales humanas en comparación con células de cáncer gástrico (Fig. 1C).
(A) análisis de transferencia Western para GRP94 y GRP78 en MKN45 células tratadas con honokiol durante 8 h en una manera dosis-respuesta. análisis (B) transferencia de Western para GRP94 y GRP78 en MKN45 células tratadas con honokiol (a, b; 20μM, 40 M) de una manera tiempo-respuesta. (C) Comparación de la expresión de la proteína GRP94 entre líneas celulares de cáncer gástrico humano (SCM-1, AGS, N87, y MKN45), tumor aislado de MKN45 ratones células inoculadas (T), de ratón normal epitelio gástrico de tejido (N), y humanos células endoteliales de la vena umbilical (HUVEC). Todos los resultados que se muestran son representativos de al menos cuatro experimentos independientes.
análisis de Western blot para la GRP94 y GRP78 en las células (N87 (A), AGS (B), MKN45 (C) y SCM-1 ( D)) trató con 40 mM honokiol para diversos cursos de tiempo como se indica. Los datos se presentan como media ± SEM (n = 5).
honokiol induce la escisión GRP94 asociada respuesta apoptótica
Como se muestra en la Fig. 3, honokiol aumentó la poli (ADP-ribosa) polimerasa (PARP) y la escisión de genes inducible daño en el ADN CHOP /GADD153 (una proteína se ha identificado para mediar ER apoptosis inducida por el estrés) niveles en células MKN45 de la dosis y dependiente del tiempo manera. Honokiol 20 y 40 M también ha disparado las expresiones de la caspasa-12 escindido y la caspasa-7 (p20), que la magnitud del aumento era proporcional a la distribución (Fig. 3B). Por otra parte, para comprender si la escisión GRP94 estuvo involucrado en la apoptosis de las células del cáncer gástrico humano, se detectó la apoptosis en las células transfectadas con siRNA-GRP94. El silenciamiento de la GRP94 por siRNA apoptosis celular inducida (Fig. 4A) y la disminución de expresión de la proteína GRP94 (Fig. 4B-a). También se compararon los efectos de honokiol sobre la apoptosis y la degradación GRP94 en células de cáncer gástrico humano con agentes quimioterapéuticos etopósido. Los resultados mostraron que el tratamiento de células con honokiol o etopósido mejora el aumento de la apoptosis (Fig. 4A) y la degradación GRP94 (Fig. 4B-b). Cuando las células se trataron simultáneamente con etopósido 40 M y 20 M honokiol, un mayor aumento de la degradación GRP94 de lo que hicieron fue mostrado (figura 4B-b.); estos resultados implican que la combinación de honokiol con otros medicamentos contra el cáncer puede ser una estrategia terapéutica potencial.
(A) análisis de transferencia Western para PARP y GADD153 en MKN45 células tratadas con honokiol de 8 h de una manera dosis-respuesta . (B) Las respuestas en tiempo del curso de PARP, GADD153, caspasa-7 y la caspasa-12 en las células tratadas con MKN45 honokiol (20 mM). Los resultados mostrados son representativos de al menos cuatro experimentos independientes.
(A) La apoptosis en las células transfectadas con MKN45 GRP94-siRNA se analizó mediante tinción con anexina V /PI como se describe en Materiales y Métodos, que se comparan con las células tratadas con honokiol (40 M) o etopósido (40 M). (B-A) los niveles de proteína GRP94 se detectaron por análisis de transferencia Western en el control y GRP94-siRNA-transfectadas células MKN45. (B-b) honokiol y etopósido inducen la escisión GRP94 en células MKN45. Las células se trataron con 20 honokiol mu M y 40 M etopósido (Etopo.) Como se indica por 4 h. Los resultados mostrados son representativos de al menos cuatro experimentos independientes.
La calpaína es necesario para honokiol mediada por apoptosis de las células
Se determinó a continuación si la actividad de la calpaína (tiol proteasas dependientes de calcio) sería inducida por honokiol en cuatro líneas celulares de cáncer gástrico. Como se muestra en la Fig. 5A, honokiol 20 M aumentó la actividad de la calpaína en una forma dependiente del tiempo, que comenzó a aumentar a los 15 minutos, y alcanzó su punto máximo a los 60 minutos, y luego se dejó caer a un nivel inferior a las 4 h. Las células se mantuvieron adherente en el transcurso del tiempo, sin pérdida de viabilidad (datos no mostrados). En la Fig. 5B, los resultados mostraron que el aumento de la actividad de la calpaína en respuesta a honokiol (20 y 40 M) durante 60 minutos en cuatro líneas celulares de cáncer gástrico. Además, los inhibidores de calpaína, N-acetil-leu-leu-norleucinal (ALLN), N-acetil-leu-leu-methioninal (ALLM), y Z-Leu-Leu-CHO, inhibe eficazmente el aumento de la actividad de la calpaína inducida por honokiol en N87 y células SCM-1 (Fig. 5C).
actividad calpaína se midió con el sustrato fluorescente Suc-calpaína LLVY-AMC en N87, AGS, MKN45 y las células SMC-1. (A) Tiempo de curso respuestas a honokiol (20 mM) de tratamiento. Los datos se expresan en términos de pliegue de condiciones de control. (B) honokiol (20 y 40 mM) incrementa la actividad de la calpaína a 60 minutos de tratamiento. (C) La calpaína inhibidores ALLN, ALLM, y Z-Leu-Leu-CHO; 25 y 50 mM) inhibió significativamente la actividad de la calpaína-honokiol aumentado. Los datos se presentan como media ± SEM (n = 4).
Además, la prueba ya sea disminución de la actividad de la calpaína podría comprometer la capacidad de las honokiol en la inducción de la apoptosis. Como se muestra en la Fig. 6A, honokiol (40 M) la apoptosis de células inducida en SCM-1 de células, lo que podría ser revertida por los inhibidores de calpaína (ALLN o ALLM). Por otra parte, honokiol mayor proteína calpaína-II, pero no voy calpaína-expresiones de proteínas en las células SMC-1 (Fig. 7A). Utilizando un enfoque de siRNA a desmontables actividad calpaína-II dio lugar a una reducción significativa de honokiol (20 M) inducida por apoptosis en células de cáncer gástrico humano después de 4 h de tratamiento (Fig. 6B). SiRNA-calpaína-I no afectó a la apoptosis inducida por honokiol (Fig. 6B). Se analizaron
células de cáncer gástrico humano para la apoptosis por anexina V tinción /PI tal como se describe en Materiales y Métodos. (A) células SCM-1 se trataron con honokiol (HK, 40 mM) durante 4 horas en presencia o ausencia de inhibidores de calpaína (ALLN y ALLM, 50 M). (B) células AGS transfectadas con siRNA-calpaína-I o siRNA-calpaína-II fueron tratados con honokiol (HK, 20 mM) durante 4 h. Los resultados mostrados son representativos de al menos cuatro experimentos independientes.
La localización y la interacción de la calpaína-II y GRP94 después del tratamiento honokiol
El siguiente paso fue determinar el papel de la calpaína-II en la degradación GRP94 honokiol inducida. En láser estudio microscópico confocal, la localización de la proteína calpaína-II se determinó por fluorescencia verde, mientras que la localización de GRP94 se determinó por fluorescencia de color rojo. Como se muestra en la Fig. 7B, tanto calpaína-II y GRP94 se detectaron en el citoplasma con co-localización en células de cáncer gástrico humano. La fluorescencia de la calpaína-II se incrementó gradualmente, pero la fluorescencia de GRP94 se disminuyó gradualmente en células de cáncer gástrico humano en tratamiento honokiol. A fin de confirmar los resultados de tinción inmunocitoquímica que la calpaína-II interactúa con GRP94, se realizaron las pruebas de co-inmunoprecipitación y Western Blot en células de cáncer gástrico. Como se muestra en la Fig. 7C, calpaína-II se asoció específicamente con GRP94 en diversas células de cáncer gástrico en presencia de honokiol (20 y 40 M) en comparación con el control de IgG. Por otra parte, hemos probado si las actividades proteolíticas de la caspasa, catepsina proteasoma o estaban involucrados en la escisión de GRP94. Nuestros resultados demostraron que el tratamiento de células con inhibidores de caspasas (Ac-DEVD-CHO, Z-VAD-FMK y Z-DEVD-FMK, 50 M) a alta dosis bloqueó parcialmente la escisión de GRP94 durante la apoptosis honokiol inducida (Fig. 8A ) en comparación con el inhibidor de la calpaína ALLM 25 M, lo que podría bloquear completamente la escisión GRP94. El pretratamiento de las células con el inhibidor de la catepsina B CA-074-Me 25 y 50 M y catepsina L inhibidor de inhibidor de la catepsina L II 25 y 50 M y proteasoma MG132 inhibidor de 0,1 a 10 M no fue capaz de bloquear la escisión GRP94 (Figs. 8B y 8C) . Además, la escisión específica de GRP94 por calpaína se pudo observar usando lisados de células preparados a partir de células de cáncer gástrico humano (datos no mostrados).
Las células se trataron con honokiol (20-60 M) de varios cursos de tiempo como se indica . los niveles de proteína (A) La calpaína I y II se detectaron por análisis de transferencia Western en las células SMC-1 honokiol tratados. (B) Los anticuerpos primarios para la calpaína-II y GRP94 se aplicaron a las células (MKN45 y SCM-1), seguido de anticuerpos secundarios acoplados con FITC-conjugado o conjugado con TRITC, respectivamente. Co-localización de dos antígenos marcados se detectó como una sola imagen cuando se superpusieron las imágenes de los dos canales. (C) La interacción de la calpaína y GRP94 se detectaron en la N87, AGS, MKN45 y las células SMC-1. Las proteínas inmunoprecipitadas se recogieron y se sometieron a SDS-PAGE e inmunotransferencia con anticuerpos anti-GRP94 anti-calpaína-II o. Los resultados mostrados son representativos de al menos cuatro experimentos independientes.
Las células se dejaron sin tratar o tratados previamente con inhibidores de 1 h seguido de tratamiento 40 M honokiol durante otras 24 horas. (A) inhibidor de la caspasa (Z-VAD-FMK, 25 y 50 mM) o un inhibidor de la calpaína (ALLN, 25 mM); (B) inhibidor de la catepsina B (CA-074-Me, 25 y 50 mM) o la catepsina L de inhibidor (inhibidor de la catepsina L II, 25 y 50 mM); (C) inhibidor del proteasoma (MG132, 0,1 a 10 mM) o un inhibidor de la calpaína (ALLN, 25 M). Los resultados mostrados son representativos de al menos cuatro experimentos independientes.
A continuación se investigó si se requiere la activación de la calpaína para la apoptosis celular inducida por honokiol. En la Fig. 9, los aumentos de la expresión de la calpaína-II proteínas y la degradación GRP94 y la caspasa-7 y la activación de la caspasa-12 inducidas por honokiol (40 M) se impidió mediante inhibidores de calpaína farmacológicas y transfección transitoria de siRNA-calpaína-II en las células SMC-1.
tratamiento secante para la determinación de la degradación de GRP94 y calpaína-I y II expresión y activación de la caspasa-7 y la caspasa-12 en las células SCM-1 24 h después de honokiol (40 M) Western en presencia o ausencia de se detectó inhibidores de calpaína (ALLN y ALLM, 25 y 50 mM). En algunos experimentos, las células SMC-1 se transfectaron con la calpaína-II-siRNA o control-siRNA. Los resultados mostrados son representativos de al menos cuatro experimentos independientes.
honokiol atenúa GRP94 tumores sobre-expresión y el crecimiento tumoral en ratones desnudos
Los ratones desnudos fueron inoculados con 4 × 10
6 células de adenocarcinoma indiferenciadas MKN45 y tratadas con honokiol 0,5 y 1,5 mg /kg o vehículo cuando el tumor se hizo evidente. análisis de transferencia de Western y inmunohistológica mostró que GRP94 sobre-expresión y se acumula en la región del tumor, pero no en tejido normal gástrico (Figs. 10A-a y 10A-B). Honokiol disminuyó notablemente la acumulación de GRP94 en los tumores en comparación con el control del vehículo (Figs. 10A-a y 10A-B). La expresión de GRP78 no se vio afectada (datos no mostrados). Para determinar si honokiol podría suprimir el crecimiento tumoral
in vivo
, se establecieron tumores sólidos en ratones y el efecto antitumoral de inyectar repetidamente se estudió honokiol. Como se muestra en la Fig. 10B, la administración de honokiol 0,5 y 1,5 mg /kg mostró una actividad antitumoral significativa.
tumores en ratones desnudos se estableció para 14 días después de la inyección células MKN45 y seguido por el tratamiento con 0,5 y 1,5 mg /kg honokiol todos los días durante 10 días. expresiones (A-a) GRP94 en los tumores o tejidos gástricos normales se determinó por inmunohistoquímica. Las secciones se tiñeron con anticuerpo GRP94 como se describe en Materiales y Métodos. Las expresiones de las proteínas en el citoplasma GRP94 fueron teñidas en color marrón oscuro. se detectó (A-B) transferencia de Western para la determinación de proteínas GRP94 en los tumores con o sin tratamiento honokiol. (A-C) La detección de la expresión de la proteína GRP94 por Western Blot en MKN45 células con o sin tratamiento honokiol (40 M) o en los tejidos gástricos normales se muestra. Los resultados mostrados son representativos de al menos cuatro experimentos independientes. Se evaluó el volumen de (B) Tumor. Los datos se presentan como media ± SEM (n = 7).
Discusión
Informamos aquí por primera vez que la calpaína, un Ca no lisosomal
2 + activados por cisteína proteasa, especialmente la calpaína-II, desempeña un papel clave en la escisión de GRP94, pero GRP78 no se ve afectada, y en la regulación de la apoptosis inducida por honokiol en células de cáncer gástrico humano. En particular, hemos proporcionado evidencias funcionales que la escisión de GRP94 en tratamiento actúa honokiol como un beneficio terapéutico, inhibir el crecimiento tumoral en el modelo de ratón de carcinoma gástrico humano. Para nuestro conocimiento, este es el primer informe para demostrar que puede manipular honokiol calpaína-inducible proteína chaperona degradación GRP94 siendo el objetivo durante la apoptosis.
Los estudios realizados en varios laboratorios señaló a la sala de emergencias como un compartimiento de destino por parte de agentes terapéuticos implicados en la ejecución de la apoptosis. Citosólica de Ca
2 + ha sido implicado como un segundo mensajero de proapoptosis implicado tanto en la activación de la apoptosis y las caspasas o calpaínas regulan [32] - [34]. Un estudio reciente ha demostrado que la calpaína es un importante mediador de resveratrol (un polifenol natural de la planta) apoptosis inducida en cáncer de mama [35]. Ellos encontraron que el resveratrol puede causar un aumento de Ca intracelular
2 +, y activa la apoptosis calpaína mediada, lo que lleva a la degradación de la membrana plasmática Ca
2 + -ATPasa isoforma 1 y fodrin en la caspasa-3 MCF-deficiente 7 células. Honokiol También se ha informado de inducir Ca
2 + movilización en neuronas corticales de rata y células SH-SY5Y de neuroblastoma humano, presumiblemente a través de la activación de la fosfolipasa C y IP receptores
3 [36]. En el presente estudio, se encontró que honokiol es capaz de aumentar la actividad de la calpaína y la expresión de la proteína calpaína-II, pero no calpaína-I durante la apoptosis celular de cáncer gástrico honokiol inducida. Por otra parte, inhibidores de calpaína y el silenciamiento de la calpaína-II por siRNA invierten de manera significativa la apoptosis inducida por honokiol. Estos resultados implican que el Ca
2 + -Accionados activación de la calpaína-II puede desempeñar un posible papel en la apoptosis inducida por honokiol.
GRP94 /gp96 es el miembro residente ER de la familia HSP90. GRP94 juega un papel importante en el mantenimiento de la homeostasis celular. Este concepto convencional de GRP94 como chaperona plegamiento de proteínas es actualizada por los descubrimientos que GRPS promover la proliferación de tumores, metástasis, resistencia a los medicamentos, y la inmunoterapia, que tienen importantes implicaciones clínicas en el pronóstico y tratamiento del cáncer [3]. GRP94 se ha demostrado que se asocia con la tumorigenicidad en líneas celulares de cáncer, modelos de tumores de roedores y biopsias de cáncer humano [37] - [39]. Esto es consistente con los hallazgos de que la inducción de GRP provoca una función protectora de acuerdo con las respuestas de supervivencia a la inanición de nutrientes, acidosis y condiciones de hipoxia, que son comunes en los tumores sólidos vascularizados mal [11], [40]. También se ha aparecido que la mayoría de los GRP en células tumorales se dedica a complejos multi-chaperonas, mientras que no se encuentra en las células normales [41]. La vacunación de ratones con las proteínas de estrés derivados del tumor, GRP94, puede provocar respuestas inmunes anti-tumorales, produciendo una marcada supresión del crecimiento del tumor y la metástasis. La actividad de los inhibidores de Hsp90 se ha validado en modelos preclínicos de cáncer de mama, tanto en los estudios como agente único y en combinación con la quimioterapia convencional [41]. Por otra parte, se ha sugerido que GRP94 es un sustrato fisiológico para la calpaína [23]. La calpaína se ha demostrado para ser activado en la membrana del RE, donde interactúa con GRP94, que resulta en su escisión proteolítica específica como las células experimentan apoptosis desencadenada por etopósido [23]. En el estudio actual, se encontró que la escisión GRP94 honokiol inducida y la apoptosis en células de cáncer gástrico humano pueden ser completamente revertido por inhibidores de calpaína y el silenciamiento de la calpaína-II de siRNA. inhibidores de caspasas en alta dosis revirtieron parcialmente la escisión GRP94 honokiol inducida. El pretratamiento de las células con la catepsina B y L y los inhibidores de inhibidor del proteasoma era incapaz de bloquear la escisión GRP94 honokiol inducida. Se demostró además que el silenciamiento de GRP94 de siRNA puede inducir la apoptosis de las células del cáncer gástrico. Además, los resultados de tinción inmunocitoquímica e inmunoprecipitación revelaron una interacción específica de GRP94 con calpaína-II en células de cáncer gástrico después del tratamiento honokiol. La escisión específica de GRP94 por calpaína también se pudo observar el uso de lisados de células preparados a partir de células de cáncer gástrico humano. Estos resultados, por lo tanto, sugieren que la escisión mediada por GRP94 calpaína-II juega un papel importante en la apoptosis de células de cáncer gástrico honokiol activado por
.
Las calpaínas y las caspasas son dos familias de proteasas de cisteína que están implicados en la regulación celular patológica muerte [22], [31]. Estas proteasas comparten varios sustratos relacionados con la muerte, incluyendo las caspasas sí mismos, proteínas del citoesqueleto, Bax y la subasta [42]. La calpaína mediada por el producto de proteolisis de una manera limitada, pero no requiere un residuo aminoácido específico como el de las caspasas. Aunque se han propuesto tanto la calpaína y la caspasa jugar papeles importantes en la regulación de la muerte celular patológica, las interacciones de estas dos familias de proteasas en condiciones patológicas no son claras. En el presente estudio, desmontables y los inhibidores farmacológicos enfoques han contribuido significativamente a nuestro conocimiento de la biología de la calpaína, particularmente con respecto a su función específica en la apoptosis celular, que es posible que las caspasas 7 y 12 son aguas abajo de la calpaína en la mediación de cáncer gástrico honokiol inducida apoptosis de las células.
medicamentos de productos naturales se han propuesto para desempeñar un papel dominante en la atención farmacéutica [43]. Los productos naturales son una de las fuentes importantes de potencial quimioterapéutico contra el cáncer y agentes quimiopreventivos [43]. Honokiol ha sido ampliamente utilizado en la medicina tradicional china y japonesa durante varios miles de años, sobre todo, para el tratamiento de los efectos anti-trombocitopénica, anti-bacterianas, anti-inflamatorios, y ansiolíticos. Los informes anteriores han demostrado que honokiol también es la posesión de propiedades antineoplásicos y anti-angiogénicas potentes [6], [19], [38]. Sin embargo, el mecanismo molecular preciso de la actividad anti-tumor exhibida por honokiol no se entiende bien. Por lo tanto, los resultados de este estudio proporcionan evidencias de la actividad anti-tumor de honokiol en el cáncer gástrico, y más importante, la base molecular para su efecto. Se encontró que honokiol induce la activación de la calpaína, la escisión GRP94, y la apoptosis en células de cáncer gástrico humano. Por otra parte, después de la administración de honokiol en nude implantados con células tumorales gástricas MKN45 mostró una actividad antitumoral significativa. Este estudio preclínico puede servir como un marco y representa un enfoque específico prometedora novela. Además, los compuestos naturales se han demostrado para combinar con agentes citotóxicos convencionales puede ser beneficioso clínico con medicamentos contra el cáncer. Esta ventaja, más la evidencia emergente de sus mecanismos antitumorales hacen honokiol aplicación clínica en curso por ser un agente antitumoral efectiva y segura.
Materiales y Métodos
Las células, condiciones de cultivo y reactivos
líneas celulares humanas, incluyendo las líneas de raza blanca gástricos de células cancerosas (AGS, una línea celular de adenocarcinoma moderadamente pobremente diferenciado, y N87, una línea celular de carcinoma bien diferenciado) y líneas celulares de cáncer gástrico asiático (MKN45 y SCM-1, el células de adenocarcinoma indiferenciado) se obtuvieron de banco de células de cáncer en el centro de veteranos de Taipei hospital general (Taiwán). Las células se mantuvieron en medio RPMI 1640 que contiene inactivado por calor 10% de FCS (Life Technologies) y estreptomicina /penicilina (Life Technologies) en un humidificado 5% de CO
2 atmósfera. Honokiol se obtuvo de Wako Chemical Company (Japón), y su pureza se determinó que era un mínimo de 99% mediante cromatografía líquida de alta resolución.
Análisis Western Blot y inmunoprecipitaciones
lisados de células enteras se prepararon como se describe anteriormente [44]. Las proteínas se separaron por electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida pre-fundido 8-20%, y después se transfirieron electroforéticamente desde el gel a membranas de difluoruro de polivinilideno. Después del bloqueo, las transferencias se incubaron con, anti-GRP94, anti-GRP78, anti-caspasa 12, anti-caspasa 7, anti-PARP, anti-GADD153 (Santa Cruz Biotechnology), anti-calpaína-I (μ-calpaína), anti-calpaína-II (m-calpaína) (Santa Cruz Biotechnology), y anti-β actina (Sigma) anticuerpos en PBS dentro de 0,1% de Tween 20 durante 1 h, seguido por tres lavados de 10 min en PBS dentro de 0,1% de Tween 20. La las membranas se incubaron con anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano picante para 60 min. En la inmunoprecipitación, las proteínas (500 g) se incubaron con anticuerpos específicos y se inmovilizaron sobre perlas de proteína A-Sepharose. Las perlas se lavaron con tampón immunoprecipitative de Bacco, hervidas, y microcentrifugaron. Entrada 10% de lisado de células de IP y 50 g de proteínas se analizaron por transferencia Western. La detección se realizó con el reactivo de transferencia de Western ECL (Amersham), y la quimioluminiscencia fue expuesto por las películas Kodak X-Omat.
calpaína Ensayos de actividad
Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-AMC es un sustrato de la proteasa calpaína. La cuantificación de 7-amino-4-metil-cumarina de fluorescencia (AMC) permite el seguimiento de la hidrólisis enzimática del conjugado péptido-AMC y se puede utilizar para medir la actividad de la enzima. Las células se prepararon y trataron en placas de 24 pocillos Corning /Costar. Antes de la adición de las células inhibidores se cargaron con 40 M Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-AMC (Biomol) y se trató con honokiol para medir el tiempo indicado a 37 ° C en una atmósfera humidificada 5% de CO
2 incubadora. La proteólisis de la sonda fluorescente se controlará mediante un sistema de lectura de placas fluorescentes (HTS-7000 Plus Series BioAssay, Perkin Elmer) con ajustes de filtro de 360 ± 20 nm para la excitación y 460 ± 20 nm para la emisión.
siRNA y los ensayos de transfección
el siRNA dúplex específicos para la inhibición de la calpaína-I (μ-calpaína) y calpaína-II (m-calpaína) las expresiones en las células humanas se obtuvieron de Santa Cruz Biotechnology: calpaína-I, nº de catálogo . sc-29885, un grupo de 3-diana específica 20-25 nt siRNAs; calpaína-II, nº de catálogo. sc-41459, un objetivo específico de 20-25 nt siRNA. Los ARNsi de control (nº de catálogo. Sc-37007) es un no-focalización 20-25 nt siRNA diseñado como un control negativo. Además, el ARNsi dúplex específicos para la inhibición de la expresión de GRP94 se sintetizó comercialmente por MWG Biotech (Alemania). El sentido (arriba) y antisentido (abajo) las secuencias de los dúplex siRNA GRP94 fueron como sigue: 5'-GAAGAAGCAUCUGAUUACCTT-3 '; 3'-TTCUUCUUCGUAGACUAAUGG-5 '. Como control no específico, un dúplex NC siRNA con secuencias aleatorias se diseñó como sigue: 5'-AGUUCAACGAGUAUCAGCATT-3 '; 3'-TTUCAAGUUGCUCAUAGUCGU-5 '. Los siRNAs se utilizaron a una concentración de 100 a 200 nM para la transfección transitoria de células con lipofectina (Invitrogen) por pocillo en una placa de 6 pocillos con medio fresco. Después de 24 h de la transfección inicial y 24-36 h de tratamiento, se recogieron las células o lisados celulares y se analizó la apoptosis o la expresión de la proteína, respectivamente.
inmunofluorescencia y microscopía confocal de barrido láser
Las células se se lavaron dos veces con PBS, se fijaron en paraformaldehído al 4% durante 30 min y después se bloquearon por incubación en 1% de albúmina de suero bovino en PBS. Los anticuerpos primarios, como se indica se aplicaron a los portaobjetos a una dilución de 1:500 y se incubaron a 4 ° C durante la noche. Las muestras se trataron con anticuerpos secundarios conjugados con FITC o TRITC-conjugados (Sigma).