Extracto
La resistencia a la quimioterapia sigue siendo un obstáculo importante en la terapia del cáncer. Este estudio tuvo como objetivo evaluar el mecanismo molecular y la eficacia de honokiol en la inducción de apoptosis y la mejora de la quimioterapia paclitaxel en modelos preclínicos a múltiples fármacos (MDR) de cáncer, incluyendo MDR humano linaje derivado (KB-8-5, KB-C1, KB-V1) y sus líneas celulares de cáncer de drogas por los padres sensibles KB-3-1.
In vitro
análisis demostraron que la proliferación honokiol eficazmente inhibida en KB-3-1 células y los derivados de MDR (IC
50 que van 3,35 ± 0,13 g /ml a 2,77 ± 0,22 g /ml), a pesar de su diferencias significativas en la respuesta a paclitaxel (CI
50 que van 1,66 ± 0,09 ng /ml a 6560,9 ± 439,52 ng /ml). Honokiol inducida mitocondrias dependiente de la apoptosis y la muerte mediada por los receptores en las células MDR KB, que se asoció con la inhibición de la señalización y regulación a la baja de STAT3 genes diana EGFR-STAT3. El tratamiento combinado con honokiol y paclitaxel aumenta sinérgicamente la citotoxicidad en células MDR KB, en comparación con el tratamiento con cualquier agente solo
in vitro
. Es importante destacar que el tratamiento combinado inhibió significativamente
in vivo
crecimiento de KB-8-5 tumores en un modelo subcutáneo. tejidos tumorales del grupo de combinación muestran una inhibición significativa de la expresión de Ki-67 y un aumento de células TUNEL positivas en comparación con el grupo control. Estos resultados sugieren que la orientación resistencia a múltiples fármacos usando honokiol en combinación con medicamentos de quimioterapia pueden proporcionar nuevas oportunidades terapéuticas
Visto:. Wang X, Beitler JJ, Wang H, Lee MJ, Huang W, Koenig L, et al. (2014) honokiol mejora la eficacia de paclitaxel en resistentes a múltiples medicamentos Modelo de cáncer humano a través de la inducción de la apoptosis. PLoS ONE 9 (2): e86369. doi: 10.1371 /journal.pone.0086369
Editor: Devanand Sarkar, Virginia Commonwealth University, Estados Unidos de América
Recibido: 2 Octubre, 2013; Aceptado: December 8, 2013; Publicado: 25 Febrero 2014
Derechos de Autor © 2014 Wang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue financiado por el Instituto Nacional del cáncer (NCI) a través de un premio de cabeza y cuello cáncer de esporas (P50CA128613), CA138292 P30, y AR47901. D.M.S., J.J.B., y Z.G.C. También me gustaría reconocer la Coalición de Cáncer de Georgia por el apoyo. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. A.R.M. Ruhul Amin Actualmente es miembro PLOS ONE Consejo Editorial. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales. Hyung Ju Shin C. Actualmente es empleado de una empresa comercial de Quest Diagnostics, Atlanta. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales.
Introducción
La quimioterapia sigue siendo una de las principales opciones de tratamiento para muchos tipos de cáncer, sin embargo, una significativa porcentaje de los pacientes desarrollan resistencia a los fármacos durante el curso de la quimioterapia, e inevitablemente el progreso sin cura [1], [2]. A pesar del notable progreso en el desarrollo de fármacos, paclitaxel con su espectro contra el cáncer de amplio se ha solidificado la interrupción de la dinámica de los microtúbulos como una de las estrategias contra el cáncer más eficaces en uso hoy en día. Sin embargo, la aparición de células cancerosas resistentes a los fármacos se ha limitado en gran medida su eficacia clínica. Por tanto, es imperativo desarrollar nuevas estrategias para reducir o superar la quimio-resistencia en el cáncer. Varios enfoques para mejorar chemoresponse en modelos de cáncer chemoresistant han sido explorados, incluyendo aquellos que combinan productos naturales o compuestos con paclitaxel u otros reactivos de quimioterapia estándar.
honokiol es un componente natural aislado de la corteza del árbol de la magnolia [2], [3], que se ha utilizado tradicionalmente para tratar trastornos relacionados con la ansiedad y los trastornos digestivos [2], [4]. Curiosamente, honokiol también mostraron actividades contra el cáncer potentes [5], [6], [7] y las quimioterapias convencionales mejora aún más en una variedad de modelos preclínicos de cáncer humano, incluyendo la leucemia linfocítica crónica [3], cáncer de próstata [8] y el mieloma múltiple [9]. Estas capacidades contra el cáncer relativamente amplia y favorable perfil de seguridad hacen honokiol una terapia adjunta atractiva para mejorar la quimioterapia convencional en el ámbito clínico.
La sobreexpresión de las proteínas anti-apoptóticos es un mecanismo subyacente que contribuye a la adquisición de resistencia terapéutica, recurrencia y metástasis. Un creciente cuerpo de evidencia sugiere que tres proteínas anti-apoptóticas, es decir, la survivina, MCL-1 y Bcl-2, pueden estar directamente relacionados con la resistencia a fármacos en el cáncer [10], [11]. La inhibición de estos factores de supervivencia cruciales se ha demostrado para activar la apoptosis y sensibilizar a las células cancerosas para el tratamiento de drogas [5] - [11]., Por lo tanto este enfoque puede ser prometedores en la superación de la quimiorresistencia y la mejora de la quimioterapia en el cáncer de
Mediante el uso de una serie de líneas humanas KB linaje derivado de células escamosas de cáncer que exhiben sensibilidades distintas a tratamiento con paclitaxel, hemos demostrado que honokiol podría inducir eficazmente la apoptosis en células de cáncer resistentes a múltiples fármacos (MDR). Estudios mecanicistas mostraron que honokiol inhibe la vía de señalización de EGFR-STAT3, y suprime la expresión de survivina y otros factores de supervivencia. Además, demostró la
in vivo
eficacia de honokiol en el tratamiento del cáncer MDR y la mejora de la eficacia de paclitaxel.
Materiales y Métodos
Cell Cultura y
El KB- 3-1 y sus derivado de líneas celulares resistentes a múltiples fármacos fueron generosamente proporcionadas por el Dr. Michael M. Gottesman (NCI, NIH, Bethesda, MD) y se han caracterizado previamente [12]. células KB-3-1 se mantuvieron en medio DMEM suplementado con suero bovino fetal 10%. células KB-8-5 y KB-C1 se mantuvieron en medio DMEM suplementado con 10% de suero fetal bovino y 0,01 y 1 mg /ml de colchicina, respectivamente. células KB-V1 se mantuvieron en medio DMEM suplementado con suero bovino fetal al 10% y 1 mg /ml de vinblastina. Para eliminar el impacto de la colchicina o vinblastina en consecuencia experimento, las células resistentes se cultivaron en medio libre de drogas durante una semana antes de cualquier experimento.
Crecimiento Celular Ensayo
Las células se sembraron a una densidad de 5 × 10
3 células por pocillo en placas de 96 pocillos por cuadruplicado. Veinticuatro horas más tarde, se añadieron fármacos en diferentes intervalos de concentración como agentes individuales o en combinaciones de dos medicamentos y después se incubaron durante 72 h. El rango para honokiol era de 0,625 a 20 g /ml para las cuatro líneas celulares. Para paclitaxel, el intervalo de concentración fue de 0,19 a 97,5 ng /ml, 3,02 ng /ml a 3,12 g /ml, 12,1 ng /ml a 25,0 mg /ml, y 97,5 ng /ml a 100 mg /ml de KB-3-1 , KB-8-5, KB-C1, y KB-V1 células, respectivamente. inhibición del crecimiento celular se midió mediante la determinación de la densidad de células con el ensayo de sulforrodamina B. El porcentaje de inhibición se determinó por comparación de la densidad celular en las células tratadas con el fármaco con la de las células control no tratadas. Todos los experimentos se repitieron al menos tres veces.
Análisis de Apoptosis
La apoptosis se analizó en las cuatro líneas celulares. Las células se trataron con honokiol, paclitaxel, o su combinación como se indica en las leyendas de las figuras, se trataron con tripsina, y se lavaron en frío 1 × PBS. Las células se resuspendieron en tampón de unión 1 × Anexina (BD PharMingen), y después se tiñeron con Anexina V-ficoeritrina (anexina V-PE; BD PharMingen) y 7-AAD (BD PharMingen) durante 15 min a temperatura ambiente. Las muestras teñidas se midieron utilizando una célula activada por fluorescencia (FACS) calibre de sobremesa citómetro de flujo (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ). FlowJo software (Árbol Star, Ashland, Oregón) se utilizó para el análisis de la apoptosis. Los experimentos se repitieron 3 veces de forma independiente.
Immunoblotting
Treinta microgramos de proteínas a partir de extractos de células enteras o fracciones citoplasmáticas y mitocondriales se cuantificaron, se separó en geles de SDS-PAGE y transferidos a membranas de nitrocelulosa. Después de ser bloqueados con leche en polvo desnatada al 5% en tampón TBS-T, las membranas se incubaron con anticuerpos específicos durante la noche a 4 ° C. se utilizó el ratón anti-β-actina de anticuerpos (Trevigen, Gaithersburg, MD) como control de carga de muestra. bandas de proteínas Immunostained se detectaron con un kit de quimioluminiscencia (Amersham, Buckinghamshire, Reino Unido). Los experimentos se repitieron 3 veces.
En vivo
eficacia antitumoral Ensayo
El experimento con animales fue aprobado por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad de Emory. KB-8-5 células (5 × 10
5) por vía subcutánea se inyectaron 4-5 en ratones desnudos femeninos semanas de edad (atímicos
nu /nu
, Taconic NY). Cuando los tumores habían desarrollado hasta aproximadamente 100 mm
3, los ratones se dividieron en cuatro grupos (n = 7 u 8) en una manera de minimizar el peso y el tamaño del tumor diferencias entre los grupos: grupo control tratado con 20% de Intralipid ( Baxter Healthcare), grupo honokiol (1,0 mg /ratón o 50 mg /kg), el grupo de paclitaxel (20 mg /kg), y honokiol (1,0 mg /ratón o 50 mg /kg) más paclitaxel (20 mg /kg) grupo de combinación . Honokiol se disolvió en 100% de etanol y se mezcla con 20% de Intralipid en una relación de 1:14 (v /v). Honokiol se administró a los ratones 3 veces por semana a 1,0 mg /ratón (o 50 mg /kg) mediante inyección intraperitoneal. Paclitaxel se administró a los ratones una vez por semana a 20 mg /kg a través de la inyección en vena de cola. La terapia se continuó durante 4 semanas. El peso corporal y el tamaño del tumor se midieron tres veces por semana. El volumen del tumor se calculó utilizando la fórmula:
V
=
//6 × diámetro más grande x (diámetro más pequeño) [13]. Los ratones se sacrificaron 4 semanas después de la iniciación del tratamiento. Se recogieron los tumores y los órganos tejidos (hígado, corazón, pulmón, bazo y riñón) para H & amp;. E tinción y análisis de inmunotinción
La inmunohistoquímica y ensayo de TUNEL
El análisis inmunohistoquímico para Ki-67 tinción en el tejido de xenoinjerto de ratón embebidos en parafina se realizó tal como se describe anteriormente [13]. Las células con tinción positiva para Ki-67 se contaron y se calculó el porcentaje de células positivas. Un promedio de las 8 lecturas se utilizó para el análisis estadístico.
ensayo TUNEL se realizó por inmunofluorescencia utilizando las mismas muestras que el anterior, siguiendo el procedimiento proporcionado por el fabricante (Promega, Madison, WI). Para analizar los resultados del ensayo, el número total de células y el número de células positivas en la misma zona se contaron cinco áreas al azar; el resultado se presenta como una relación media del número de células positivas con respecto al número total de células.
Análisis estadístico
La significación estadística de tratamiento de las células en el
in vitro
ensayo de citotoxicidad se evaluó a través de Student
t-test
. Para
vivo
ensayo de eficacia antitumoral en un modelo mixto log-lineal con intercepto aleatorio se utilizó para comparar la significación de los volúmenes tumorales medios entre cada grupo. La significación estadística del efecto del tratamiento sobre los microtúbulos, la apoptosis y la proliferación celular en los tejidos tumorales de xenoinjerto se evaluó mediante la prueba de Kruskal-Wallis (ANOVA de una vía).
P
. & Lt; 0,05 fue considerado estadísticamente significativo en todos los análisis
Resultados
honokiol reduce la viabilidad e induce la apoptosis en las células cancerosas resistentes a múltiples fármacos Humanos
La MDR líneas celulares de cáncer KB-8-5, KB-C1 y KB-V1 se derivaron de su contraparte sensible a los fármacos células KB-3-1, y se han usado ampliamente como un modelo clínicamente relevante en el estudio de la resistencia a fármacos [14] , [15]. Estas células mostraron sensibilidades distintas a tratamiento con paclitaxel. Como se muestra en la Fig. 1a, 1b, la IC
50 valores en las líneas celulares MDR (KB-8-5:26.73 ± 1,01 ng /ml, KB-C1:195.0 ± 11.11 ng /ml, y KB-V1:6560.0 ± 439,52 ng /ml) se incrementaron en 16-, 117- y 4000 veces, respectivamente, en comparación con la línea celular KB-3-1 parental (1,66 ± 0,09 ng /ml). En consonancia con su fenotipo resistente, las líneas celulares resistentes a múltiples fármacos expresan sustancialmente la clásica MDR marcador P-glycoprotien (Fig. 1b). Curiosamente, una h-tratamiento 72 con honokiol reduce eficazmente la viabilidad de las células MDR (KB-8-5:3.22 ± 0,14 g /ml, KB-C1:3.04 ± 0,30 g /ml, KB-V1:2.77 ± 0,22 g /ml), con IC
50 valores similares a los de KB-3-1 células (3,35 ± 0,13 g /ml) (Fig. 1c, 1d). análisis Apoptosis mostró además que honokiol la apoptosis inducida de una manera tiempo y dependiente de la dosis (Fig. 1e). 24 h después del tratamiento honokiol, el porcentaje de células apoptóticas KB-3-1 fue 11,9 ± 3,9% (5 g /ml de honokiol), 32,9 ± 0,9% (10 g /ml), y 47,1 ± 2,7% (15 g /ml); el porcentaje de células apoptóticas aumentó a 18,4 ± 2,1%, 51,5 ± 0,6% y 65,3 ± 1,6%, respectivamente, después de un tratamiento h-48, que se incrementó aún más a las 72 h. Honokiol también indujo un grado similar de apoptosis en otras células MDR, incluyendo KB-8-5, KB-C1 y KB-V1 (Fig. 1e). Por ejemplo, un tratamiento de 48 h con 10 g /ml de honokiol dio lugar a la apoptosis en 51,5% de las células KB-3-1, 52,7% de las células KB-8-5, 52,9% de las células KB-C1 y 67,6% de Las células KB-V1, respectivamente. Estos datos son consistentes con el ensayo de viabilidad (Fig. 1c, 1d), y sugieren que honokiol es un potente agente citotóxico en células KB, independientemente de sus diferentes sensibilidades de paclitaxel.
(a, b) efecto de inhibición del crecimiento de paclitaxel y la expresión de P-gp en KB-3-1, 8-5-KB, células KB-C1 y KB-V1. El IC
50 valores de paclitaxel en KB-8-5 resistente a los fármacos, las células KB-C1 y KB-V1 se incrementaron en un 16, 117-, y 4000 veces, respectivamente, cuando en comparación con células KB-3-1 parentales . (C, d) Crecimiento efecto de inhibición de honokiol en KB-3-1, 8-5-KB, células KB-C1 y KB-V1. El IC
50 valores de honokiol en KB-8-5 resistente a fármacos, KB-C1 y las células KB-V1 fueron similares a la de las células parentales KB-3-1. (E) Honokiol induce la apoptosis en células KB. KB-3-1 y células KB-8-5 se trataron con 5, 10, 15 g /ml de honokiol para 24, 48, y 72 h. células KB-C1 y KB-V1 se trataron con honokiol para 48 h. La apoptosis se midió mediante tinción con anexina V-ficoeritrina. * Indica valores estadísticamente significativos (p *, en comparación con el control, p & lt; 0,05; **, frente a 5 mg /ml, p & lt; 0,05).
honokiol Induce Mitochondria- y la muerte del receptor (DR) - la apoptosis dependientes en el cáncer humano células
Hemos investigado el mecanismo de la apoptosis inducida por honokiol en células KB. Como se muestra en la Fig. 2a-c, el tratamiento honokiol induce la escisión de PARP y la caspasa-3 en la dosis y de manera dependiente del tiempo en todas las células KB probados, lo que indica la activación de señales de apoptosis. Los análisis de transferencia de Western se encontró que honokiol no sólo induce la liberación de citocromo
c
en el citoplasma de una manera dependiente de la dosis (Fig. 2d), pero también aumentó la expresión de DR5 (Fig. 2d), una superficie receptores para ligandos pro-apoptóticos Apo2L /TRAIL. Tomados en conjunto, estos datos sugieren que honokiol podría activar simultáneamente las mitocondrias-dependiente (intrínseca) apoptosis y DR-dependiente (extrínseca) apoptosis en células KB.
(a) células KB-3-1 y (b) KB -8-5 células se trataron con 5, 10, 15 g /ml de honokiol para 24, 48 h. De longitud completa y PARP escindida, exfoliados caspasa-3 y β-actina como control de carga se detectaron por inmunotransferencia utilizando lisados de células enteras. (C) KB-C1 y las células KB-V1 se trataron con 5, 10, 15 g /ml de honokiol para 48 h. PARP escindida se detectó por inmunotransferencia utilizando lisados de células enteras. (D) Panel superior, las células KB-8-5 se trataron con 5, 10, 15 g /ml de honokiol para 48 h. Citoplásmica y mitocondrial fracciones se separaron y a inmunotransferencia con citocromo c de anticuerpos (cito C). COX4 (una proteína mitocondrial) se utiliza para mostrar la eficacia de fraccionamiento de la célula. Panel inferior, las células KB-8-5 se trataron con 5, 10, 15 g /ml de honokiol de 24 y 48 h. DR5 se detectó por inmunotransferencia utilizando lisados de células enteras. Todos los experimentos se repitieron al menos tres veces, y se presentan datos representativos.
honokiol Inhibe EGFR-STAT3 señalización en las células de cáncer humano
La vía de señalización del EGFR-STAT3 desempeña un papel importante en la regulación del crecimiento y la supervivencia de las células cancerosas. Se investigaron los efectos de honokiol en varios componentes clave de la vía de señalización del EGFR-STAT3. KB-3-1 y KB-8-5 células fueron tratadas con honokiol (5 mg /ml) durante 0,5, 1, y 2 h. El análisis de transferencia de Western usando lisados de células totales reveló una fosforilación marcadamente reducida de EGFR en Try1173, un indicador de EGFR activado (Fig. 3a). Asimismo, examinó el estado de fosforilación de STAT3 (Tyr705), Akt (Ser473), y ERK (Thr202 /Tyr204), tres EGFR conocida aguas abajo componentes de señalización. Curiosamente, el tratamiento honokiol rápidamente phosphorlylation inhibido de STAT3 y AKT, pero no tuvieron efecto sobre la fosforilación de ERK (Fig. 3 bis ter). Para examinar si el nivel de expresión del EGFR y sus proteínas diana aguas abajo también se inhibió por el tratamiento honokiol (5 mg /ml), se trataron las células durante 24, 48 y 72 h. Como se muestra en la Fig. 3CD, el tratamiento honokiol inhibe la expresión de proteínas de EGFR, STAT3, ERK y AKT en una forma dependiente del tiempo en KB-3-1 y células KB-8-5. Del mismo modo, la fosforilación de las proteínas se redujo tras el tratamiento honokiol (Fig. 3CD). Consistentemente, los niveles de expresión de tres genes diana conocidos STAT3, es decir, survivina, Bcl-2 y MCL-1, se redujeron drásticamente tras el tratamiento honokiol (Fig. 3e).
KB-3-1 y KB- 8-5 células se trataron con 5 mg /ml de honokiol por corto tiempo (0,5, 1, o 2 h) o mucho tiempo (24, 48, o 72 h). Lisados de células enteras se inmunotransfirieron para las proteínas indicadas. El efecto de honokiol en puntos de tiempo tempranos: (a) la fosforilación de EGFR y STAT3; (B) honokiol disminuye la fosforilación de AKT y ERK. El efecto de honokiol a finales de los puntos de tiempo: (c) la fosforilación y la expresión de EGFR y STAT3; (D) la fosforilación y la expresión de AKT y ERK; (E) la expresión de survivina, Bcl-2, MCL-1. (F) Honokiol inhibe la vía de señalización de EGFR y regula a la baja los genes diana STAT3 en una forma dependiente de la dosis. KB-3-1 y células KB-8-5 se trataron con 5, 10, 15 g /ml de honokiol para 48 h. Lisados de células enteras se inmunotransfirieron para las proteínas indicadas. (G) honokiol inhibe la vía del EGFR-STAT3 en células KB-V1-C1 y KB. células KB-C1 y KB-V1 se trataron con 5, 10, 15 g /ml de honokiol para 48 h. Todos los experimentos se repitieron al menos tres veces, y se presentan datos representativos.
A continuación examinó la respuesta dependiente de la dosis de EGFR-STAT3 señalización al tratamiento honokiol en KB-3-1 y KB-8 células -5. Como se muestra en la Fig. 3f, la expresión y la fosforilación de EGFR (Try1173) se redujeron en presencia de 5 o 10 mg /ml de honokiol (48 h), y se redujeron aún más a una dosis de 15 g /ml de honokiol (Fig. 3f). Consistentemente, la expresión y /o la fosforilación de los componentes de señalización corriente abajo de EGFR, incluyendo ERK, Akt, STAT3, survivin, Bcl-2 y MCL-1, fueron también inhibió dramáticamente de una manera dependiente de la dosis (Fig. 3f). Un efecto similar de honokiol en la señalización de EGFR-STAT3 también se observó tanto en las células KB-V1 (Fig. 3G) KB-C1 y. De particular interés, un análisis de RT-PCR se encontró que la inhibición de la expresión de survivina honokiol puede implicar la supresión de la transcripción survivina en el ARNm (Figura S1).
honokiol potencia la citotoxicidad in vitro de paclitaxel en células de cáncer MDR
Hemos investigado si la inhibición de la survivina, Bcl-2 y MCL-1 por honokiol podría sensibilizar a las células cancerosas resistentes a múltiples fármacos a la quimioterapia convencional, tal como palictaxel. Como se muestra en la Fig. tratamiento 4, 24-h con cualquiera honokiol (5 g /ml) o paclitaxel (450 ng /ml) dio lugar a ≤20% de apoptosis en las células KB-C1, mientras que el tratamiento combinado utilizando tanto honokiol y paclitaxel dio lugar a aproximadamente 30% de apoptosis . apoptosis Por otra parte, en los puntos de tiempo 48 h y 72 h, el tratamiento combinado indujo de manera más eficaz (76% y 86%, respectivamente) en las células KB-C1 que cualquier agente solo (≤25%) o el control del vehículo. En consonancia, el tratamiento combinado fue más eficaz en la inducción de apoptosis que cualquier agente solo en las células MDR KB-8-5 y KB-V1 (Fig. 4). El uso de células KB-8-5 como un ejemplo, un índice de combinación (IC) de ensayo confirmó el efecto sinérgico del tratamiento combinado con honokiol y paclitaxel en la reducción de la viabilidad de las células cancerosas resistentes a múltiples fármacos (Tabla S1).
(una ) KB-8-5, (b) KB-C1, y (c) células KB-V1 fueron tratados con 5 mg /ml de honokiol, paclitaxel (15 ng /ml para KB-8-5, 450 ng /ml para KB-C1, y 6 mg /ml de KB-V1), o la combinación de dos fármacos en las concentraciones indicadas durante 24, 48, y 72 h. La apoptosis se midió. * Indica valores de p estadísticamente significativas (*, combinación frente honokiol, p & lt; 0,05; **, combinación frente a paclitaxel, p & lt; 0,05). Todos los experimentos se repitieron tres veces.
Western blot encontró además que el tratamiento combinado con honokiol y paclitaxel fue más efectiva que cualquiera en la inducción de la escisión de la caspasa-3, PARP agente, y la liberación del citocromo
c
de las mitocondrias en las células KB-8-5 (Fig. 5a, 5b). Un tratamiento de 48-h con honokiol solo o la combinación de honokiol y paclitaxel disminuyó la expresión y la fosforilación de EGFR, así como otros componentes de señalización EGFR-STAT3 clave, incluyendo STAT3, p-STAT3 (Tyr705), ERK, p-ERK ( Thr202 /Tyr204), Akt y p-Akt (Ser473). La expresión de la proteína de survivina, Bcl-2 y MCL-1 también se redujo notablemente en el tratamiento con honokiol o la combinación de honokiol y paclitaxel. Curiosamente, sin embargo, el tratamiento con paclitaxel solo no tuvo efecto significativo sobre estos componentes de señalización o genes diana de la vía EGFR-STAT3 (Fig. 5c)
.
(a) honokiol mejora paclitaxel inducida PARP y caspasa 3 de escisión en las células KB-8-5. Las células se trataron con 5 mg /ml de honokiol, 15 ng /ml de paclitaxel, o la combinación de los dos fármacos durante 24, 48, y 72 h. De longitud completa y PARP escindida, exfoliados caspasa-3 y β-actina como control de carga se detectaron por inmunotransferencia utilizando lisados de células enteras. (B) honokiol mejora paclitaxel inducida por la liberación del citocromo
c Hoteles en el citoplasma de las células KB-8-5. Las células se trataron con 5 mg /ml de honokiol, 15 ng /ml de paclitaxel, o la combinación de 48 h. Citoplásmica y mitocondrial fracciones se separaron y a inmunotransferencia con citocromo c de anticuerpos (cito C). COX4 (una proteína mitocondrial) se utiliza para mostrar la eficacia de fraccionamiento de la célula. (C) honokiol inhibe la vía de señalización del EGFR-STAT3 y disminuir la expresión del gen diana STAT3 en células KB-8-5. Las células se trataron con 5 mg /ml de honokiol, 15 ng /ml de paclitaxel, o la combinación de 48 h. Lisados de células enteras se inmunotransfirieron para las proteínas indicadas. (D) El paclitaxel induce la polimerización de microtúbulos en las células KB-8-5. estabilización inducida por fármacos de los microtúbulos como se evidencia por un aumento de la masa de polímero de microtúbulos que resulta en la agrupación se observó después del tratamiento con paclitaxel y la combinación; sin embargo, honokiol sí sola no era eficaz en la estabilización de los microtúbulos (aumento de 400x). Las células se trataron con 5 mg /ml de honokiol, 15 ng /ml de paclitaxel, o la combinación de 24 h. Todos los experimentos se repitieron al menos tres veces, y se presentan datos representativos.
Paclitaxel ejerce su actividad antitumoral mediante la unión a tubulina en el interior del lumen de los microtúbulos, lo que resulta en microtúbulos polimerización, la estabilización y la alteración de los microtúbulos dinámica, causando la detención mitótica y apoptosis en células en proliferación. Para investigar si honokiol puede mejorar paclitaxel inducida por la polimerización de microtúbulos y la estabilización, se analizó el efecto de cada tratamiento sobre los microtúbulos en las células KB-8-5 y KB-C1. Inducida por fármacos de estabilización de los microtúbulos en interfase de las células tumorales, como se evidencia por un aumento de la masa de polímero de microtúbulos que resulta en la agrupación, se observó después del tratamiento con paclitaxel y la combinación; sin embargo, honokiol por sí sola no era eficaz en la formación de haces de microtúbulos (Fig. 5d). En conjunto, estos datos indican que honokiol mejora la
in vitro
citotoxicidad de paclitaxel en los cánceres resistentes a múltiples fármacos, puede ser a través de la inhibición de la supervivencia EGFR-STAT3 señalización.
Honokiol mejora la eficacia in vivo de paclitaxel MDR en cáncer de xenoinjerto de tumores
Se evaluó la eficacia antitumoral de honokiol, paclitaxel y su combinación en el tratamiento del cáncer MDR en el modelo de xenoinjerto KB-8-5. El tratamiento se continuó durante 4 semanas. Como se muestra en la Fig. 6a, a una dosis de 20 mg /kg una vez por semana, una inyección de 4-semanas de paclitaxel solo no inhibió significativamente el crecimiento de KB-8-5 tumores subcutáneos, en comparación con el control de vehículo (p = 0,917). El tratamiento con honokiol solo (50 mg /kg, 3 veces por semana, a través i.p.) ligeramente suprimió el crecimiento tumoral, aunque la diferencia no fue significativa (p = 0,194) (Fig. 6a). En contraste, el tratamiento de combinación inhibió dramáticamente el crecimiento de los tumores KB-8-5, en comparación con todos los otros grupos (frente a control: p & lt; 0,0001; vs. honokiol: p = 0,036; vs. paclitaxel: p = 0,004). El volumen medio de los tumores en cada grupo de tratamiento en el punto final fue 2585.4 ± 510.0 mm
3 (de control), 1810.2 ± 483.2 mm
3 (honokiol), 2591.3 ± 726.2 mm
3 (paclitaxel), y 573,9 ± 146.1mm3 (combinación). ratones representativos de cada grupo se muestran en la (Fig. 6c). Estos resultados indican que honokiol podría potenciar significativamente la actividad antitumoral de paclitaxel en los tumores de xenoinjerto de cáncer de MDR.
(a) El crecimiento de los tumores de xenoinjertos de KB-8-5 se inhibió significativamente en el grupo tratado con la combinación en comparación con el control (p & lt; 0,0001), honokiol (p = 0,0356) y paclitaxel (p = 0,004) grupos tratados. Los volúmenes tumorales en la honokiol (p = 0,1942) grupo tratado y paclitaxel (p = 0,9165) grupo tratado no mostraron diferencias significativas cuando se compara con el control. pesos (b) del cuerpo de los ratones de todos los grupos. Los pesos corporales de los ratones en los cuatro grupos fueron similares. (C) del ratón representante de cada grupo. análisis (d) histopatológico de los órganos principales (hígado, bazo, riñón, corazón y pulmón) del grupo de control y el tratamiento de combinación. (e) los efectos del tratamiento de combinación de honokiol y paclitaxel en la división celular, la proliferación y la apoptosis in vivo. secciones de tejido embebidas en parafina de diferentes grupos de tratamiento se inmunotiñeron con anticuerpos anti-Ki-67 para la proliferación celular, y la tinción de TUNEL para la detección de células apoptóticas. Las células apoptóticas se muestran en verde; ADN contratinción con DAPI en azul (200 aumentos).
Se evaluó la toxicidad sistémica de honokiol, paclitaxel y el tratamiento de combinación en el modelo de xenoinjerto KB-8-5. En comparación con el grupo control, los pesos corporales de los ratones en los tres grupos de tratamiento fueron similares, lo que indica una toxicidad insignificante en las condiciones (Fig. 6B) ensayados. Consistentemente, los análisis histopatológico no encontró ningún daño tisular considerable en los principales órganos (incluyendo el hígado, bazo, riñón, corazón y pulmón) recogidas de cualquier grupo de tratamiento, incluyendo el tratamiento de combinación (Fig. 6d).
llevaron a cabo otros análisis de IHC para examinar el
in vivo
efecto de cada tratamiento sobre la expresión de biomarcadores tumorales generales. El tratamiento combinado redujo significativamente el nivel de los tejidos de Ki-67 en KB-8-5 tumores (porcentaje de Ki-67 células positivas: 3,84 ± 1,10), en comparación con la del grupo control (11,96 ± 2,86; p & lt; 0,001) , grupo honokiol (7,18 ± 2,07, p = 0,027), o grupo paclitaxel (11,68 ± 1,82; p & lt; 0,001) (Fig 6e.). Consistentemente, ensayo de TUNEL reveló un aumento significativo en las células tumorales apoptóticas en los tejidos tumorales de el grupo de combinación (7,07 ± 2,11) en comparación con la del grupo control (1,64 ± 0,17; p & lt; 0,001), grupo honokiol (5,45 ± 1,19; P & lt; 0,05) y el grupo de paclitaxel (3,97 ± 3,58, p = 0,08) (Fig 6E).. Estos resultados indican que honokiol podría sensibilizar a las células cancerosas MDR a paclitaxel a través de la inducción de la apoptosis.
Discusión
A pesar de cierto éxito en el control de forma transitoria los síntomas clínicos de cáncer con quimioterapia, un porcentaje significativo de pacientes desarrollar "resistencia a múltiples fármacos", o MDR, e inevitablemente el progreso que no tiene cura. Es urgente desarrollar nuevas estrategias para superar la MDR y mejorar la eficacia de la quimioterapia. En este estudio, se investigó la utilidad potencial de la honokiol compuesto natural en el tratamiento de cáncer de quimiorresistente utilizando modelos preclínicos. Hemos demostrado que honokiol podría inducir eficazmente la muerte celular en células de cáncer independientemente de su resistencia al fármaco paclitaxel quimioterapia. Significativamente, honokiol aumentó notablemente la
in vivo
eficacia de paclitaxel en la inhibición del crecimiento del cáncer MDR en un modelo de xenoinjerto. Hemos proporcionado más evidencias moleculares de apoyo que la apoptosis inducida por la quimioterapia honokiol y mejorado a través de la inhibición de la señalización del EGFR-STAT3 y la regulación a la baja de varios factores de supervivencia, incluyendo la survivina, Bcl-2 y MCL-1. Estas observaciones indican que honokiol podría ser prometedora en la sensibilización de las células cancerosas a la quimioterapia y la mejora de la eficacia de paclitaxel en el ámbito clínico.
sobreexpresión de EGFR ha estado estrechamente asociado con la progresión tumoral, la resistencia terapéutica y pobre resultado clínico en cáncer de cabeza y cuello y otros tipos de cáncer [16], [17], [18], [19]. La señalización de EGFR vía, incluyendo sus múltiples vías aguas abajo, tales como PI3K /AKT, ERK1 /2, JAK /STAT3 y mTOR /NF-kappa B, juega un papel importante en la regulación de la proliferación, supervivencia, migración y quimiorresistencia en células de cáncer. la señalización del EGFR, por lo tanto, está siendo perseguido activamente como un objetivo prometedor para desarrollar terapias para la cabeza resistente y recurrente y el cáncer de cuello y otro tipo de cáncer usando inhibidores de moléculas pequeñas y anticuerpos [20], [21]. En este estudio, hemos demostrado que honokiol disminuyó tanto la fosforilación y la expresión de EGFR, lo que sugiere una inhibición de la señalización de EGFR que es consistente con estudios anteriores [5]. Como se esperaba, la expresión y actividad de varios componentes importantes de la señalización de EGFR, incluyendo AKT, ERK y STAT3, también se inhibieron en células KB quimiorresistentes por tratamiento honokiol. Un estudio reciente informó que regula a la baja honokiol proteína de choque térmico (HSP) 90 en células de cáncer de mama [22]. HSP90 y otras proteínas chaperonas tales como HSP70 y HSP40 regulan la degradación de EGFR. Interrupción del ciclo de HSP70 /HSP90-plegado conduce a ubiquitinylation y degradación de EGFR [23] [24]. Por lo tanto, es posible que honokiol promueve la degradación de EGFR e inhibe la señalización a través de un mecanismo de HSP90 dependiente de EGFR.
Varios genes diana STAT3, como survivin, Bcl-2 y MCL-1, tienen un papel central en la regulación