Extracto
La hormona liberadora receptores (GnRH) se expresan en el cáncer de próstata, específicamente en la etapa más agresivo del tumor (cáncer de próstata resistente a la castración, CRPC) para los que el tratamiento estándar, la quimioterapia basada en docetaxel, sólo puede mejorar la mediana del tiempo de supervivencia por pocos meses. Anteriormente puso de manifiesto que los agonistas de la GnRH ejercen una actividad antitumoral en las células CRPC; sin embargo, una relación entre los receptores de GnRH y la maquinaria apoptótica queda por definir. Objetivo de este estudio fue evaluar si, en las células CRPC, agonistas de la GnRH pueden afectar a la expresión /actividad de las proteínas relacionadas con la apoptosis y pueden sensibilizar, o resensitize, las células cancerosas a agentes quimioterapéuticos. Hemos demostrado que, en las células DU145 p53-positivos, los agonistas de GnRH: a) aumentar la expresión de la proteína proapoptótica Bax; este efecto es mediado por la fosforilación (activación) de p53, desencadenada por la MAPK p38; b) potenciar la actividad antiproliferativa /proapoptótico de docetaxel; c) resensitize células docetaxel resistente a la actividad antitumoral del fármaco citotóxico. Estos datos indican que los agonistas de GnRH sensibilizan y, más importante, resensitize células DU145 CRPC a la quimioterapia de una manera dependiente de p53. Para confirmar el papel crucial de p53 en la actividad de agonistas de GnRH, los experimentos se realizaron en células PC3 p53 nulo. Hemos encontrado que los agonistas de GnRH no aumentan la expresión de Bax y no potencian la actividad citotóxica de docetaxel. Estos resultados pueden proporcionar una base para nuevas estrategias de tratamiento de combinación, especialmente para los pacientes CRPC docetaxel resistentes que expresan una proteína p53 funcional
Visto:. Moretti RM, Marelli MM, DM Taylor, Martini PGV, Marzagalli M, P Limonta (2014) hormona liberadora de gonadotropina agonistas Sensibilizar y resensitize, las células del cáncer de próstata con docetaxel en una Manera dependiente de p53. PLoS ONE 9 (4): e93713. doi: 10.1371 /journal.pone.0093713
Editor: Antimo Migliaccio, II Università di Napoli, Italia |
Recibido: 14 Octubre, 2013; Aceptado: March 5, 2014; Publicado: 10 Abril 2014
Derechos de Autor © 2014 Moretti et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue financiado por la Università degli Studi di Milano, programa de PUR (. subvenciones n 12/01/95 y 12-1-104). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de próstata es el cáncer más comúnmente diagnosticado en los hombres y la segunda causa principal de muerte por cáncer entre los hombres en los países occidentales [1]. La mayoría de los cánceres de próstata dependen de la presencia de andrógenos para el crecimiento y la supervivencia, y la terapia de ablación de andrógenos, con el objetivo de bloquear la secreción de andrógenos /actividad, representa el tratamiento inicial más eficaz [2], [3]. Esta terapia incluye la castración quirúrgica o química, logrado a través de: la administración de la hormona liberadora de gonadotropina (GnRH) análogos; bloqueo de la unión de los andrógenos a su receptor por antiandrógenos; la inhibición de las enzimas androgénica. Por desgracia, a pesar de una excelente respuesta inicial, en aproximadamente 2 a 3 años, la mayoría de los cánceres de próstata entrarán en fase resistente a la castración cáncer de próstata (CRPC) con el aumento de la proliferación y la malignidad [4], [5]. Para los pacientes CRPC, la quimioterapia basada en taxanos representa el tratamiento de elección [6], [7]. Docetaxel actúa mediante la unión a tubulina para promover la polimerización y despolimerización de microtúbulos impide en ausencia de trifosfato de guanosina. También se ha demostrado que induce la muerte de células tumorales por afectar la expresión /actividad de múltiples objetivos específicos de cáncer, incluyendo la regulación por disminución de la proteína antiapoptótica Bcl-2 y la regulación positiva de la proteína proapoptótica Bax [8], [9]. Sin embargo, a pesar de la manifestación inicial de una mejor supervivencia con quimioterapia basada en docetaxel, se encontró que la mejora de ser sólo una supervivencia libre de progresión de algunos meses [6], [10]. Por lo tanto, el tratamiento de los pacientes con CRPC que progresa después de la quimioterapia basada en docetaxel sigue siendo un problema clínico importante. La identificación de nuevas estrategias orientadas a la superación de la resistencia de docetaxel es probable que mejorar las opciones terapéuticas para estos pacientes.
GnRH fue identificado por primera vez como el regulador clave hipotalámica de las funciones reproductivas. Mediante la unión a receptores específicos (GnRH-R) en la hipófisis gonadotropes GnRH activa el eje hipofisario-gonadal. Los agonistas de GnRH, cuando se administra de forma continua y en dosis altas, desensibilizar la hipófisis GnRH-R, por lo que suprime la secreción de esteroides gonadales; sobre la base de su actividad, estos compuestos representan el tratamiento médico más amplia y exitosamente utilizado para el cáncer de próstata andrógeno-sensibles [2], [11].
Ahora está bien establecido que los receptores de GnRH se expresan en la próstata células de cáncer, específicamente en las células y tejidos CRPC [12] - [15]
Estos receptores (así como los receptores de GnRH en las células de cáncer de mama y ginecológicos y tejidos) se han caracterizado por primera vez en términos de afinidad de unión.. Sin embargo, se han reportado resultados contrastantes: una clase de unión de baja afinidad sitios [12], [13], [16] - [18]; dos tipos de receptores (una con alta afinidad y otra con baja afinidad) [19] - [21]; una sola clase de alta afinidad GnRH sitios de unión [22] - [25]. En particular, se informó de la presencia de receptores de GnRH de baja afinidad en células de cáncer de próstata [12], [13]. La razón de esta discrepancia es todavía un tema de debate; sin embargo, podría ser debido a las diferentes condiciones experimentales adoptadas (diferentes líneas celulares de cáncer y ligandos, la evaluación de la afinidad de unión en células de cáncer /tejidos que expresan los sitios de unión
vs
. células modificadas para sobreexpresar los receptores, célula modificaciones postraduccionales específicos de del receptor,
etc.
).
Estas observaciones iniciales contrastantes estimularon la caracterización de los receptores de GnRH del cáncer a nivel molecular. Concretamente, se informó de que tanto el ARNm que codifica para el receptor humano pituitaria GnRH y la proteína correspondiente se expresa en células de cáncer de próstata, ya sea dependiente de andrógenos o resistente a la castración [26]. Además, la secuencia de nucleótidos del ADNc que codifica para los receptores de tumor se ha demostrado que corresponden a las que se informó anteriormente para los receptores de la pituitaria [27], [28].
Demostramos además que los agonistas de GnRH, a través de la activación de receptores de GnRH expresados a nivel local, ejercen un fuerte efecto antiproliferativo sobre las células del cáncer de próstata, tanto
in vitro
y
in vivo
[12], [29], [30]; esta actividad antitumoral es específica ya que está completamente abrogado después de que el silenciamiento del receptor de GnRH por medio de un siRNA específico [31].
Además de la proliferación celular reducida, la apoptosis se ha sugerido que participan en el antitumoral la actividad de los análogos de la GnRH. Sin embargo, los datos disponibles hasta la fecha sobre esta cuestión son objeto de controversia [30], [32] - [35]
A continuación, confirmamos nuestra observación anterior de que los agonistas de GnRH no sean, por sí mismos, inducen apoptosis en. células CRPC. Sin embargo, en células de cáncer de próstata DU145 expresa p53, que aumentan la expresión de la proteína proapoptótica Bax, a través de la fosforilación en Ser-15 (
es decir
., La activación) de p53, el principal regulador de la vía apoptótica intrínseca ; activación de esta señalización apoptótica p53-Bax se activa por fosforilación de p38 MAPK. También muestran que los agonistas de GnRH sensibilizar a las células DU145 a la actividad antimitótica de docetaxel. Más importante aún, los agonistas de GnRH resensitize células DU145 docetaxel resistente a la actividad inductora de la muerte del agente quimioterapéutico. Estos datos indican que, en células de cáncer de próstata p53-positivos, apuntando localmente expresa receptores de GnRH por medio de agonistas de la GnRH y sensibiliza resensitizes células cancerosas a la quimioterapia, de una manera dependiente de p53. El papel crucial desempeñado por p53 se demuestra por la observación de que los agonistas de GnRH no afectan a la expresión de Bax y fallan para potenciar la actividad apoptótica de docetaxel en células de cáncer de próstata PC3 p53 nulo. Tomados en conjunto, estos resultados representan el fundamento de las estrategias de tratamiento para los pacientes combinación con docetaxel CRPC resistente, que expresa una proteína p53 funcional.
Materiales y Métodos
Cultivos Celulares
El humana líneas celulares de cáncer de próstata DU145 resistentes a la castración (p53-positivo) y PC3 (p53-null) se adquirieron de la American Tissue Culture Collection. Tanto las células PC3 y DU145 representan el modelo más adecuado y ampliamente utilizada de CRPC en la literatura [36] - [40]. Las células fueron cultivadas rutinariamente en Roswell Park Memorial Institute-1640 (RPMI-1640) suplementado con 5% de suero bovino fetal (FBS), glutamina (1 mmol /L) y antibióticos (100 UI /ml penicilina G sódica y 100 mg /ml sulfato de estreptomicina), en una atmósfera humidificada de 5% de CO
2/95% de aire a 37 ° C.
Materiales y anticuerpos
El acetato de goserelina agonista de la GnRH [D-Ser (tBu )
6Aza-Gly
10-GnRH, Zoladex, GnRH-A] fue proporcionado amablemente por AstraZeneca Pharmaceuticals. El antagonista de la GnRH Antida (Ant) y docetaxel (Doc) fueron adquiridos de Sigma-Aldrich.
En todos los experimentos, el agonista de GnRH se ha utilizado a la dosis de 10
-6 mol /L, sobre la base de estudios previos, desde el laboratorio de los autores, así como de los demás, tuvo como objetivo investigar los aspectos moleculares de la actividad antitumoral de análogos de la GnRH en las células CRPC [29], [41] - [46]. El mismo intervalo de dosis también se utilizaron para investigar la actividad antitumoral de los agonistas de GnRH en varios modelos experimentales de células cancerosas que sobreexpresan el receptor de GnRH [16], [47] - [49].
Pifithrin-a, la inhibidor específico de la actividad transcripcional de p53, y SB203580, el inhibidor específico de p38 MAPK, se adquirieron de Santa Cruz Biotechnology y de Sigma-Aldrich, respectivamente
los anticuerpos utilizados para los experimentos de transferencia Western:. Bax de conejo anti-humana (1 :500;#2772), conejo p38 MAPK anti-humano (1:1,000 ;.#9212) y conejo MAPK p-p38 anti-humano (1:1,000;#9211) de Señalización celular Tecnología; monoclonal de ratón anti-humano Bcl-2 (1:250;#Sc-7382), monoclonal de ratón anti-humano p53 (1:1,000;#Sc-53394), de conejo anti-humano p-p53 (Ser-15; 1: 1000;#SC-101762) y de cabra anti-humano actina 1-19 (1:1,000;.#SC-1616) de Santa Cruz Biotechnology
Análisis de microarrays
células de cáncer de próstata DU145 eran sin semillas (5 × 10
5 células /placa) en 10 cm placas de cultivo de tejidos; después de 48 horas, las células fueron tratadas con GnRH-A (10
-6 mol /L) durante 24 horas y el ARN total fue preparado con la utilización de la RNeasy mini kit (Qiagen), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después del control de calidad mediante un Bioanalyzer (Agilent 2100), los ARN fueron etiquetados de acuerdo con el protocolo de Affymetrix usando un kit Ciclo de etiquetar (Affymetrix). 15 g de ARNc resultantes se hibridaron sobre la totalidad de U133 genoma de microarrays plus 2.0. Después de la hibridación de 2,0 chips de Affymetrix HG-U133 Plus, se estimaron los valores de expresión de genes para cada conjunto sonda usando paquetes en la suite Bioconductor [50]. Los genes se normalizaron y se analizaron con el método robusto análisis multichip (RMA) dentro del paquete affy [51] y el paquete GCRMA [52]. Las diferencias en los niveles de expresión de registro tanto para los datos normalizados GCRMA RMA y se evaluaron mediante la prueba t de dos colas como se aplica en el paquete limma [53]. Los genes con
P-valores
& lt; 0,05 y la expresión absoluta de cambio veces mayor que 1,5 se consideraron significativamente expresadas diferencialmente (DE) entre las células tratadas y no tratadas. Una lista de genes fue generado tomando la superposición de genes DE generados por limma tanto de los métodos de normalización RMA y GCRMA.
análisis de transferencia Western
Al final de los experimentos, las células se lavaron con PBS y se lisaron en tampón RIPA (0,05 mol /L Tris · HCl pH 7,7, 0,15 mol /L de NaCl, 0,8% SDS, 10 mmol /L EDTA, 100 mmol /L NaVO4, 50 mmol /L NaF, 0.3 mmol /L PMSF , 5 mmol /L de ácido yodoacético) que contiene leupeptina (50 mg /ml), aprotinina (5 l /ml) y pepstatina (50 mg /ml). La concentración de proteína se determinó utilizando el método BCA. Los extractos de proteína (30 g) se resuspendieron en tampón de muestra (0,5 mol /L Tris · HCl pH 6,8, 20% de glicerol, 10% SDS, 0,2% 2β-mercaptoetanol, 0,05% de azul de bromofenol) y se calentó a 95 ° C durante 5 minutos . Después de la separación electroforética por SDS-PAGE, las proteínas se transfirieron a membranas de nitrocelulosa. Las membranas se bloquearon en leche seca no grasa al 3% antes de la incubación a temperatura ambiente durante 2 horas con los anticuerpos primarios específicos en las diluciones apropiadas. La detección se realiza utilizando un anticuerpo secundario con peroxidasa de rábano conjugada y reactivos de quimioluminiscencia (sistema de detección de quimioluminiscencia Supersignal). En cada experimento expresión de actina Western blot se evaluó como control de carga. Para cada análisis de proteínas, se realizaron tres experimentos diferentes; el análisis densitométrico se informa en las figuras se realizó en los resultados obtenidos de los tres experimentos diferentes.
Proliferación Celular y la viabilidad celular Estudios
DU145 y se sembraron las células PC3 (1 × 10
4 células por placa) en placas de 6 cm. Después de 2 días, las células fueron tratadas con GnRH-A (10
-6 mol /L) durante 24 horas, ya sea solo o en presencia del antagonista de la GnRH Antida (Ant, 10
-6 mol /L) , seguido de docetaxel (10 nmol /L) durante 48-72 horas. Las células tratadas con cada uno de los dos fármacos solos o sin tratamiento sirvieron como controles. Al final de los tratamientos, se recogieron las células y se contaron mediante un hemocitómetro. Para los estudios de viabilidad, DU145 y células PC3 se trataron como se ha descrito y la viabilidad celular se midió por el ensayo de exclusión de azul de tripano. El número de células muertas se midió por recuento de las células de tinción de azul de tripano.
caspasa-3 actividad enzimática Ensayo
Actividad de la caspasa-3-como se evaluó mediante el kit de ensayo colorimétrico CaspACE (Promega). Se sembraron las células DU145 (2 × 10
5 células /placa) en placas de 10 cm. Después de 2 días, las células se trataron previamente con GnRH-A (10
-6 mol /L) durante 24 horas y después se trató con docetaxel (10 nmol /L) durante 72 horas. Al final de los tratamientos, las células (tanto adherentes y individual) se lisaron en el tampón de lisis contenido en el kit, seguido de centrifugación (15.000 x
g
durante 10 minutos a 4 ° C). Actividad de la caspasa-3-como se evaluó siguiendo la escisión proteolítica del sustrato colorimétrico Ac-DEVD-pNA. Las muestras se leyeron a 405 nm en un espectrofotómetro usando un 100 l Quarz cubeta. El pan-inhibidor de caspasas Z-VAD-FMK se utilizó para confirmar la especificidad del ensayo.
Formación de Colonias Ensayo
Para el desarrollo de las células de docetaxel resistente (DU145-R), las células se sembraron en DU145 placas de 10 cm fueron tratados en serie con docetaxel (10 nmol /L, una vez a la semana) hasta que desarrollaron la capacidad de crecer y dividirse en presencia del fármaco (8 semanas). Para investigar si los agonistas de GnRH pueden resensitize células DU145-R para la actividad de docetaxel, se realizó un ensayo clonogénico estándar. células DU145-R se sembraron a 1.000 células /pocillo en placas de seis pocillos y se dejó que se unieran durante 24 horas. Las células fueron tratadas con GnRH-A (10
-6 mol /L) durante 24 horas seguido de docetaxel (10 nmol /L) durante 72 horas. Al final del tratamiento, las células se lavaron y se añadió medio fresco. Las células se cultivaron durante 14 días en 5% de FBS que contienen medio y después se fijaron y se tiñeron con cristal violeta. Imágenes de colonias teñidas fueron capturados por una Nikon photocamera.
Análisis estadístico
Cuando sea apropiado, los datos se analizaron mediante el test de Bonferroni, después de un análisis unidireccional de la varianza.
P
valores. & Lt; 0,05 se consideró significativo
Resultados
Los agonistas de la GnRH Aumentar Bax expresión en células DU145
Hemos informado anteriormente de que los agonistas de la GnRH ejercen un antiproliferativo efecto sobre las células de cáncer de próstata DU145. Sin embargo, todavía no está claro si la apoptosis también podría estar involucrado en la actividad antitumoral de estos compuestos [30], [32] - [35]. La familia de Bcl-2 de los reguladores de la muerte celular (tanto pro-apoptóticos y prosurvival) representa un punto de control crítico en la vía intrínseca de la apoptosis. El equilibrio de estas dos clases de proteínas determina el destino de la célula. La proteína proapoptótico Bax, a través de la oligomerización con Bak, se transloca desde el citoplasma a las mitocondrias para aumentar mitocondrial permeabilización de la membrana externa, provocando citocromo
c
liberación y la caspasa-3 actividad [54]. Aquí, se investigó si los agonistas de GnRH pueden afectar a la expresión de genes implicados en la ruta apoptótica. células DU145 se trataron con GnRH-A durante 24 horas y los cambios de perfil de expresión génica se evaluaron por análisis de transcriptómica de todo el genoma. Entre los genes cuya expresión se vio modificada por el tratamiento nos centramos nuestra atención en la expresión de
Bax
.
Bax
expresión se incrementó significativamente por 1,67 veces (Tabla 1); este aumento se confirmó a nivel de proteínas mediante inmunotransferencia de tipo Western (Fig. 1A). Se encontró que el efecto estimulador de GnRH-A en la expresión de Bax ser específica, ya que fue abrogada por el cotratamiento de las células con el antagonista de GnRH Antida (Fig. 1B). Por otra parte, el agonista de GnRH no afectó a la expresión de la proteína antiapoptótica Bcl-2 (Fig. 1C).
(A) las células DU145 se trataron con GnRH-A (10
-6 mol /L) durante 24 o 48 horas. Western Blot se realizó en extractos de células enteras mediante el uso de un anticuerpo anti-Bax. Como era de esperar, GnRH-A tratamiento aumenta la expresión de la proteína Bax en las 24 horas de tratamiento. (B) las células DU145 se trataron con GnRH-A (10
-6 mol /L) y con el antagonista de GnRH Antida (Ant, 10
-6 mol /L), ya sea solo o en combinación, para 24 horas. La transferencia Western se realizó como se describe en A). Ant, se administra sola, no afecta a la expresión de Bax, mientras GnRH-A, como se esperaba, aumenta la expresión de Bax. Este efecto estimulador de GnRH-A es específico, ya que se suprime por el cotratamiento de las células con el antagonista de GnRH. (C) El tratamiento de células DU145 con GnRH-A (10
-6 mol /L) durante 24 o 48 horas, no afecta a Bcl-2 expresión, según se evaluó por transferencia Western. Por tanto Bax y análisis de expresión de la proteína Bcl-2 se muestra un representante de tres experimentos diferentes. Los datos representan la media ± SEM. *
P Hotel & lt; 0,05
frente
C (controles no tratados); **
P Hotel & lt; 0,05
frente
células GnRH-a-tratada
En las células DU145 Expresión agonistas de GnRH regular al alza Bax a través de la señalización de p53. vía
el papel clave de p53 en la vía apoptótica intrínseca está bien establecida [55]. Después de ser activado a través de la fosforilación en Ser-15, p53 se transloca en el núcleo para regular la expresión de genes proapoptóticos, como
Bax
[56]. Por otra parte, se informó de la fosforilación de p53 ser dependiente de la actividad de la MAPK p38 [57]. Por Western blot, se encontró que, en las células DU145, GnRH-A de tratamiento (1-48 horas) no afectó la expresión de p53; sin embargo, los niveles de la serina-15 fosforilada (
es decir
., activo) forma de la proteína se incrementaron significativamente después de 1 y 5 horas de tratamiento (Fig. 2A). Cuando se trataron previamente las células (2 horas) con pifithrin-α (el inhibidor de p53) el efecto estimulador de GnRH-A (24 horas) en la expresión de Bax fue completamente abolida (Fig. 2B). También se encontró que el tratamiento de las células con GnRH-A (5-15 minutos) no afectó el nivel de expresión de p38 MAPK; sin embargo, aumentó significativamente los niveles de la forma fosforilada de la MAPK, a intervalos de 5 y 10 minutos de tiempo (Fig. 3A). El tratamiento previo (30 minutos) de las células con SB203580 (1 mol /L), el inhibidor de p38 específico, redujo significativamente los efectos estimulantes de GnRH-A sobre la fosforilación de p53 (1 y 5 horas) (Fig. 3B). Por lo tanto, en las células DU145 agonistas de la GnRH upregulate la expresión de la proteína proapoptótica Bax través phoshorylation p53; MAPK p38 es un activador corriente arriba de esta vía de señalización de p53-Bax.
(A) las células DU145 se trataron con GnRH-A (10
-6 mol /L) para diferentes intervalos de tiempo (1-48 horas). El análisis de transferencia Western se realizó sobre extractos de células enteras mediante el uso de (Ser-15) anticuerpos p53 o p-p53. El tratamiento con GnRH-A no afecta a la expresión de p53 en los intervalos de tiempo considerados; sin embargo, los niveles de la serina-15 forma fosforilada de la proteína se aumentan significativamente después de 1 y 5 horas de tratamiento. (B) las células DU145 se trataron con GnRH-A (10
-6 mol /L) ya sea solos o después de un tratamiento previo con pifithrin-α (PIF, 30 mmol /L, para 2 horas), el inhibidor de p53 específico. El análisis de transferencia Western se realizó sobre extractos de células enteras utilizando Bax antiobody. Los resultados obtenidos muestran que pifitrhin-α, cuando se administran solos, no afecta a la expresión de Bax. Como era de esperar, GnRH-A aumenta la expresión de Bax; este efecto es completamente abolida cuando las células se tratan previamente con pifithrin-α. Un representante de tres experimentos diferentes, para cada uno de los análisis realizados, se muestra. Los datos representan la media ± SEM. *
P Hotel & lt; 0,05
frente
C (controles no tratados); **
P
. & Lt; 0,05
células tratadas-A-GnRH frente
células DU145 (A) fueron tratadas con GnRH-A (10
-6 mol /L) para diferentes intervalos de tiempo (5-15 minutos). El análisis de transferencia Western se realizó sobre extractos de células enteras mediante el uso de anticuerpos p38 y p-p38. El tratamiento con GnRH-A no afecta a la expresión de p38 en cualquier intervalo de tiempo considerado. Por otro lado, GnRH-A aumenta significativamente los niveles de la forma fosforilada de p38 (p-p38) a los 5 y 10 minutos de tratamiento. (B) Como se esperaba, GnRH-A aumenta los niveles de expresión de p-p53, lo que confirma los resultados anteriores; análisis densitométrico de los datos demuestran que este efecto se reduce significativamente cuando las células se tratan previamente con el inhibidor específico de p38 SB203580 (SB, 1 mol /L, durante 30 minutos). Un representante de tres experimentos diferentes, para cada uno de los análisis realizados, se muestra. Los datos representan la media ± SEM. *
P Hotel & lt; 0,05
frente
C (controles no tratados); **
P
. & Lt; 0,05
frente a las células de GnRH-A-tratada
Los agonistas de la GnRH sensibilizar a las células DU145 p53 positiva a la actividad citotóxica de Docetaxel
una perturbación en el equilibrio entre los factores pro y anti-apoptóticas es un paso crucial en la decisión de células a someterse a la apoptosis o la supervivencia. Basándose en el efecto estimulante de agonistas de GnRH en la expresión de Bax, mediada por la activación de p53, se investigó si los agonistas de GnRH pueden inducir la apoptosis en las células DU145. Por análisis FACS, no se observó ningún efecto proapoptótico de GnRH-A en estas células (datos no mostrados). Estas observaciones no fueron inesperados, ya que fue previamente informado de que, en las células CRPC, agonistas de la GnRH reducen la proliferación celular sin inducir la apoptosis [30], [32], [35]. La razón por la cual, en las células DU145, agonistas de la GnRH aumentan los niveles de Bax sin que se dispare el evento de apoptosis es intrigante. Sin embargo, es bien sabido que las células DU145 sobreexpresan la proteína antiapoptótica Bcl-2, y los niveles de esta proteína no se ven afectados por la GnRH-A de tratamiento (véase la Fig. 1C). Por lo tanto, es posible que, en estas células, el aumento de la expresión de Bax inducida por GnRH-A no es suficiente para mejorar de manera eficiente la relación de Bax /Bcl-2 para activar la apoptosis. Sobre la base de estas consideraciones, razonó que los agonistas de GnRH, a través de la regulación positiva de factores proapoptóticos, pueden sensibilizar a las células de cáncer de próstata a la actividad de los fármacos citotóxicos, se sabe que actúan aumentando la expresión de factores proapoptóticos la vez que disminuye el de las proteínas antiapoptóticas. Nos centramos nuestra atención en el docetaxel desde: a) que representa el tratamiento de elección para el CRPC [4], [5]; b) se ha demostrado que induce la muerte de células tumorales a través de la regulación positiva de la proteína proapoptótica Bax y regulación a la baja de la proteína antiapoptótica Bcl-2 [8], [9]. En primer lugar, por transferencia Western, se confirmó que docetaxel (48 horas) disminuye significativamente la expresión de Bcl-2, mientras que el aumento de la de Bax (Fig. 4A). A continuación, se evaluó si los agonistas de GnRH pueden potenciar la actividad antitumoral de docetaxel. En primer lugar, encontramos que, cuando se administran solos, GnRH-A (24 horas) no afecta a la proliferación de las células DU145. Esto no era inesperado, ya que previamente se ha informado de que, en las células CRPC, los agonistas de GnRH pueden ejercer un efecto antiproliferativo significativa sólo cuando los tratamientos se llevan a cabo durante intervalos más largos de tiempo (4-7 días) [29]. Datos similares se han reportado en otros tipos de tumores [58], [59]. A continuación, hemos demostrado que el pretratamiento de las células DU145 con GnRH-A (24 horas) mejora significativamente los efectos antiproliferativos de docetaxel (48-72 horas) a todos los intervalos de tiempo (Fig. 4B). Por otra parte, pudimos demostrar que el efecto sensibilizante de GnRH-A a docetaxel fue específica, ya que fue completamente abrogada por el co-tratamiento de las células con el antagonista de la GnRH Antida (Fig. 4C). En las mismas condiciones experimentales, la evaluación de la viabilidad celular se realizó mediante ensayo de exclusión de azul de tripano. GnRH-A, cuando se administran solos, no afectó a la viabilidad celular (Fig. 4D). Como era de esperar, docetaxel aumentó significativamente el número de células teñidas de azul de tripano positivos (células muertas). Este efecto se potenció significativamente mediante pretratamiento de las células con GnRH-A en todos los intervalos de tiempo (Fig. 4D). Para confirmar que el tratamiento previo con agonistas de la GnRH sensibiliza a las células CRPC a la actividad antitumoral de docetaxel, las células DU145 se trataron con GnRH-A (24 horas) y luego con el fármaco citotóxico durante 72 horas. a continuación, se evaluó la actividad de la caspasa-3 como un marcador de la muerte celular apoptótica. GnRH-A, se administra sola, no afectó a la actividad de caspasa-3; como se esperaba, docetaxel aumento de la actividad enzimática. El pretratamiento de las células con GnRH-A potenciaba significativamente el efecto proapototic del agente quimioterapéutico. El efecto es específico, ya que fue contrarrestado por el tratamiento simultáneo de las células con el inhibidor pan-caspasa z-VAD-fmk (Fig. 4E)
.
(A) se realizó el análisis de transferencia Western para confirmar que la la actividad citotóxica de docetaxel (Doc) está mediada por una perturbación de la relación de proteínas pro-a antiapoptótico. células DU145 se trataron con docetaxel (10 nmol /L) durante 48 horas. Como era de esperar, docetaxel disminuye la expresión de la proteína antiapoptótica Bcl-2, mientras que el aumento de la expresión de Bax. Se muestra un representante de tres experimentos diferentes. (B) las células DU145 se trataron previamente con GnRH-A (10
-6 mol /L) para 24 y luego con docetaxel (10 nmol /L) para diferentes intervalos de tiempo (48-72 horas). Al final de los tratamientos, las células se contaron mediante un hemocitómetro. El pretratamiento de las células con GnRH-A aumenta significativamente el efecto antiproliferativo de docetaxel en todos los intervalos de tiempo considerados. células DU145 (C) se trataron previamente con GnRH-A (10
-6 mol /L) y con el antagonista de GnRH Antida (Ant, 10
-6 mol /L), ya sea solo o en combinación, para 24 hora, y luego con docetaxel (10 nmol /L) durante 60 horas. Al final de los tratamientos, las células se contaron mediante un hemocitómetro. El pretratamiento de las células con GnRH-A aumenta significativamente el efecto antiproliferativo de docetaxel; este efecto es específico puesto que está completamente abrogado por el cotratamiento de las células con Ant. (D) Al final de los tratamientos (realizado como se describe en B), la viabilidad celular se midió por el ensayo de exclusión de azul de tripano. El número de células muertas se midió por recuento de las células de tinción de azul de tripano. Los datos se expresan como porcentaje del total de células /células teñidas. Docetaxel aumenta significativamente el número de células muertas; en todos los intervalos de tiempo, este efecto se potencia significativamente por el pretratamiento de las células con GnRH-A. (E) células DU145 se trataron previamente con GnRH-A durante 24 horas y luego tratados con docetaxel durante 72 horas. Al final de la actividad de tratamiento de la caspasa 3-como se evaluó utilizando el kit de ensayo colorimétrico CaspACE. El pretratamiento de las células con GnRH-A potencia significativamente el efecto proapototic de docetaxel en términos de actividad de la caspasa-3. El efecto es específico, ya que es contrarrestado por el tratamiento simultáneo con el inhibidor pan-caspasa z-VAD-fmk. En B-E de cada grupo experimental consistió en seis réplicas y cada experimento se repitió tres veces. Los datos representan la media ± SEM. *
P Hotel & lt; 0,05
frente
C (controles no tratados); **
P
. & Lt; 0,05
en comparación con docetaxel
células tratadas con
Estos resultados indican que, en células de cáncer de próstata DU145 p53 positivo agonistas de la GnRH sensibilizar específicamente las células a la actividad citotóxica de docetaxel; este efecto es probablemente la consecuencia de la GnRH-A-inducida por la activación de la p38 /p53 /Bax apoptosis vía de señalización.
GnRH agonistas resensitize células DU145 p53 positiva a la actividad citotóxica de Docetaxel
para obtener células resistentes a docetaxel (DU145-R), las células DU145 se trataron en serie con docetaxel (una vez a la semana durante 8 semanas) hasta que desarrollaron la capacidad de crecer en presencia del fármaco. En estas células, la resistencia al compuesto citotóxico se asoció con una disminución significativa de los niveles de Bax, sin ningún cambio en el nivel de expresión de Bcl-2 (Fig. 5A), lo que confirma las observaciones previas de informes poco consenso entre taxano-resistencia y la sobreexpresión de Bcl-2 [60]. Por otro lado, nuestros datos indican claramente que las células DU145 se pueden contrastar y superar la actividad antitumoral de los fármacos quimioterapéuticos mediante el aumento de la relación entre las proteínas anti- y pro-apoptóticos. Por ensayo clonogénico, que luego investigó si los agonistas de GnRH pueden resensitize células de cáncer de próstata docetaxel resistente a la actividad proapoptótico del fármaco quimioterapéutico. El tratamiento de células DU145-R con GnRH-A (24 horas) por sí sola no afectó a la capacidad de las células para formar colonias (Fig. 5B). Como era de esperar, las células DU145-R formaron colonias en presencia de docetaxel (72 horas), lo que confirma su adquisición de resistencia a la droga. Sin embargo, el tratamiento de combinación (GnRH-A durante 24 horas seguido de docetaxel durante 72 horas) abolió completamente la capacidad de formación de colonias de células DU145-R (Fig. 5B). Estos resultados indican que los agonistas de GnRH pueden resensitize células de cáncer de próstata docetaxel resistente a la actividad antitumoral del fármaco quimioterapéutico.
próstata DU145 se hicieron resistentes a docetaxel (Doc) después del tratamiento con el fármaco quimioterapéutico las células cancerosas (10 nmol /L) una vez a la semana durante 8 ciclos. (A) análisis de transferencia de Western de Bcl-2 y Bax en las células resistentes a docetaxel (DU145-R).