Extracto
El cáncer de ovario es la causa más común de muerte por cáncer ginecológico. La comprensión de la biología de esta enfermedad, en particular la forma en linfocitos y fibroblastos asociados a tumores contribuyen a la progresión y la metástasis del tumor, se ha visto obstaculizada por la falta de un modelo de xenoinjerto de tumor adecuado. Se presenta un sistema simple y reproducible en el que el tumor y el estroma tumoral se injertaron con éxito en ratones NOD-SCID IL2Rγ
nula (NSG). Esto se logra mediante la inyección de los agregados de células tumorales derivadas de tejidos frescos de ovario de biopsia del tumor (incluyendo células tumorales, y linfocitos asociados a tumores y fibroblastos) i.p. en ratones GSN. la progresión del tumor en estos ratones se asemeja mucho a muchos de los eventos que se observan en los pacientes con cáncer de ovario. Los tumores establecen en el epiplón, ovarios, hígado, bazo, útero y páncreas. El crecimiento del tumor es inicialmente muy lenta y progresiva dentro de la cavidad peritoneal con un desarrollo último de ascitis tumorales, metástasis espontánea al pulmón, el aumento de los niveles en suero y ascitis de CA125, y la retención de los fibroblastos humanos asociados a tumores y los linfocitos que permanecen funcional y sensible a las citoquinas durante periodos prolongados. Con este modelo se podrá determinar cómo fibroblastos y linfocitos dentro de la microambiente tumoral pueden contribuir al crecimiento del tumor y la metástasis, y hará que sea posible evaluar la eficacia de las terapias que están diseñados para dirigir estas células en el estroma del tumor.
Visto: Bankert RB, Balu-SV Iyer, Odunsi K, Shultz LD, Kelleher RJ Jr, Barnas JL, et al. (2011) humanizado modelo de ratón de cáncer de ovario recapitula Paciente sólida progresión del tumor, la formación de ascitis, y la metástasis. PLoS ONE 6 (9): e24420. doi: 10.1371 /journal.pone.0024420
Editor: Sandra Oršulić, el Cedars-Sinai Medical Center, Estados Unidos de América
Recibido: 30 de junio de 2011; Aceptado: August 8, 2011; Publicado: 15 Septiembre 2011
Derechos de Autor © 2011 Bankert et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. El estudio fue apoyado en parte por el NIH subvención CA34196 (LDS) y por el NIH subvenciones CA131407, CA108970 y AI079188 (RBB), T32AI1007614 (MSA), Grupo de cáncer de ovario de Trabajo de subvención del Instituto de Investigación del cáncer (KO) y NIH subvención HL-70227 (SB -YO). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Tanto los tejidos humanos normales y neoplásicas se han incorporado con éxito en células T y células B con deficiencia de
prkdc
scid (SCID)
ratones. El primer éxito del injerto de células humanas en estos C.B-17
ratones SCID se informó hace más de 20 años [1]. El uso de xenoinjertos de tejido humano en estos ratones inmunodeficientes ya ha llevado a conocimientos sobre la biología del cáncer humano, la autoinmunidad y las enfermedades infecciosas [2]. El potencial del uso de varios modelos de xenoinjertos de tumores humanos diferentes para estudiar y evaluar las terapias contra el cáncer junto con las limitaciones y dificultades de los modelos ha sido revisado [3]. Uno de los mayores impedimentos de los modelos de xenoinjerto anteriores fue la (HVG) respuesta del huésped contra injerto que se observó después de la implantación de tejidos humanos. Mientras que
SCID
ratones carecían funcional B y células T, estos ratones tenían una respuesta inmune innata intacta que era responsable de la respuesta compleja HVG celular y molecular. La intensidad de esta respuesta HVG variado considerablemente de ratón a ratón y con el tipo histológico del tumor utilizado para el injerto [3]. mejorar el nivel del injerto de tejido humano han dependido principalmente de modificaciones genéticas de ratones inmunodeficientes huésped [2]. Un avance importante fue la generación de ratones inmunodeficientes que son homocigotos para mutaciones dirigidas en la cadena γ receptor locus interleucina-2 [2]. Estos ratones son severamente deteriorados en el desarrollo y función de las células T, células B y células NK [2]. Un ejemplo de este nuevo tipo de cepa de ratón inmunodeficiente es la NOD.Cg-
Prkdc
scidIL-2RG
tm1Wjl
, abreviado GSN. ratones inmunodeficientes que carecen de la cadena de IL-2 receptor γ se han encontrado para apoyar el injerto prolongado de células hematopoyéticas humanas y las células mononucleares de sangre periférica [2] mejor que los anteriores cepas inmunodeficientes de ratón.
un modelo de xenoinjerto en el que los tumores humanos y las células T y B asociados a tumores autólogos podrían ser co-injertados y sus interacciones estudiadas
in vivo
proporcionaría una oportunidad para determinar cómo las células humanas y células tumorales inmunocompetentes se influyen mutuamente. Los resultados podrían ser utilizadas para evaluar enfoques inmunoterapéuticos para el cáncer. Además, en vista de la creciente conciencia de que las células estromales no malignas incluyendo fibroblastos, células epiteliales y otros leucocitos interactuar con y que tienen un impacto sobre el crecimiento del tumor y las metástasis, el desarrollo y uso de modelos en los que se mantiene en la [4] el microambiente tumoral xenoinjerto también es fundamental para la obtención de conocimientos sobre la patogénesis de la progresión del tumor. Mediante la implantación de piezas no interrumpido de tumores humanos por vía subcutánea en ratones GSN, se establecieron xenoinjertos en la que la arquitectura de los tejidos, incluyendo los leucocitos asociado a tumor, los fibroblastos del estroma y las células tumorales se conserva y se mantiene durante períodos prolongados [5]. Este modelo fue útil para demostrar la capacidad de IL-12 exógena entregado por microesferas biodegradables para activar las células T de memoria en reposo dentro del microambiente del tumor [5]. Sin embargo, debido a que estos xenoinjertos tumorales no se establecieron de forma ortotópica, y no se observó Esta distribución sólo limitada evidencia de tumor, el modelo no refleja con exactitud los patrones de crecimiento y metástasis que se observan en los pacientes con cáncer, y por lo tanto de valor potencial limitado era en la identificación de factores que contribuyen a la metástasis del tumor o para evaluar la eficacia de los protocolos de inmunoterapia.
Un xenoinjerto de tumor modelo ha sido desarrollado y es reportado aquí en el cual se establecen los xenoinjertos de tumores de ovario epiteliales humanas ortotópica, y el patrón de crecimiento tumoral y la metástasis refleja la que se observa en pacientes con cáncer de ovario. Linfocitos T y B y fibroblastos co-injertan dentro de los nódulos tumorales y las células T asociados a tumores siguen siendo funcionales y sensible a administrado exógenamente de citoquinas. CA125 está presente en los sueros y la ascitis de ratones portadores de tumor CA125 + y proporciona una oportunidad para controlar la presencia y progreso de xenoinjertos de tumor periódicamente. Se espera que este modelo hará posible el estudio de la capacidad de los leucocitos y tumor del estroma asociado a un tumor humano para modular
in situ
la progresión tumoral. Además, el modelo proporciona el potencial para evaluar la eficacia de un solo, así como la combinación, los enfoques terapéuticos para el cáncer de ovario.
Resultados
tumores epiteliales de ovario humano se injertan ortotópicamente en el ovario y otro órgano sitios después de la inyección intraperitoneal (ip) de los agregados de células derivadas de tumores en ratones GSN
se estableció previamente que la implantación subcutánea de piezas sólidas de tejidos tumorales humanos frescos en ratones NSG dio como resultado la creación de microambientes tumorales [ ,,,0],5]. Las ventajas de este enfoque sobre los métodos anteriores fueron que los xenoinjertos resultantes mantienen su arquitectura original, incluyendo los leucocitos asociados a tumores, fibroblastos del estroma y las células tumorales, y los xenoinjertos sobrevivieron durante períodos prolongados sin interferencia HVG o la infiltración de células huésped. Una limitación importante de este modelo de xenoinjerto anterior era que no refleja los patrones de crecimiento y la diseminación tumoral que se observan en los pacientes con cáncer, y algunos tumores rechazaron el injerto o traducido en xenoinjertos con grandes áreas de necrosis debido a una vascularización inadecuada de la piezas sólidas de tumores.
Presentamos aquí un método de injerto, en los que los tumores de ovario se pueden establecer con éxito como xenoinjertos de forma ortotópica en el ovario y otros sitios de órganos de ratones receptores. El crecimiento tumoral refleja el patrón y la progresión observada en los pacientes con cáncer de ovario. Esto se ha logrado mediante la inyección de una suspensión de agregados de células (que se deriva de una interrupción leve de los tumores de ovario sólidos) i.p. en ratones NSG (véase la sección Métodos). Para asegurar el éxito del injerto del tumor, los tejidos de biopsia de tumor deben consistir en áreas de células tumorales viables que incluyen linfocitos asociados a tumores, y los fibroblastos como se muestra en la Fig. 1. Las suspensiones de células derivadas de tumor resultantes de la alteración de los tejidos frescos de tumores sólidos contienen pequeñas (200 a 300 micras de diámetro) agregados de células que incluyen los leucocitos CD45 +, células tumorales positivas de citoqueratina, células T CD3 + y tricrómico de colágeno positiva que es producido por los fibroblastos (Fig. 2A-E). los agregados celulares derivadas de tumores de ovario obtenidos a partir de cinco pacientes diferentes (experimento 1-5) fueron inyectados i.p. en ratones GSN y los ratones receptores se sacrificaron a los tiempos indicados en la Tabla 1. Si bien se observó evidencia histológica de la unión y el crecimiento de los agregados de células tumorales en el epiplón ya en 8 días después de la inyección i.p. inoculación (datos no mostrados) pruebas bruto e histológico de tumor de estroma tumoral y dentro de los diferentes sitios de órganos (véase más adelante) no se estableció hasta 80 hasta 177 días después de la inoculación (Tabla 1). Ninguno de los ratones mostraron signos clínicos evidentes de desarrollo del tumor durante las primeras 10 semanas de observación después de la inoculación del tumor. La muerte era a menudo el primer signo de injerto del tumor. Un ratón de cada experimento murió sin evaluación, y no se incluyó en el análisis final
Una sección de un adenocarcinoma seroso papilar del ovario se tiñeron con hematoxilina y eosina (H & amp; E).. Se muestra en un aumento de 100x y B en 400 × magnificación racimos de células tumorales (T) que muestran la infiltración linfocítica (L), junto con el tejido conectivo fibroso (F).
Histología e inmunohistoquímica del tumor -derivado agregados de células derivadas por la ruptura leve de un tumor ovárico primario. H & amp; E tinción muestran grupos de células de diferentes tamaños (A) La tinción inmunohistoquímica para CD45 humano (B) y CD3 (C) muestra evidencia de leucocitos humanos y de células T, es decir, células marrón manchado oscuro. Trichrome tinción (D) revela la presencia de colágeno que es producido por los fibroblastos y las manchas de color aguamarina. Las células tumorales se tiñen de color marrón oscuro con tinción inmunohistoquímica para citoqueratina (E). Todas las cifras están a 400 × magnificación.
Los nódulos detectados groseramente dentro de la cavidad peritoneal de los ratones inyectados con los agregados de células derivadas de tumores fueron confirmados histológicamente como tumores (Fig. 3 bis bis y 3 bis ter). Los nódulos tumorales variaban en diámetro de 2 mm a 10 mm y se observaron con más frecuencia dentro o cerca de la zona del omento, es decir, adyacente al estómago, el bazo y el páncreas. En algunos tumores Los ratones fueron observados groseramente en la superficie del bazo y el hígado. Para determinar si los tumores se habían extendido a otras partes de órganos dentro de la cavidad peritoneal, se tomaron secciones de cada órgano, fijadas y teñidas. Higo. 3ac-3Ag revelar la presencia de tumor en el ovario, periovarian grasa, páncreas, útero, bazo y el hígado de un ratón sacrificado 140 días después de la inyección de aggreages celulares derivadas de tumores (Experimento 4).
H & amp ; e tinción muestra evidencia de tumor (ver flechas) en los nódulos peritoneal desde omento (Aa y Ab), grasa de ovario y periovarian (Ac), páncreas (Ad), útero (Ae), bazo (Af), y el hígado (Ag) . Estos tumores resultaron de la i.p. inyección de agregados de células derivadas de tumores derivados de un carcinoma seroso papilar del ovario. Los ratones se sacrificaron 140 días después de la inoculación. Los linfocitos (flecha) se observaron en yuxtaposición con las células tumorales (punta de flecha) (Ba). La tinción inmunohistoquímica (B) muestra la presencia de CD45 + humanas leucocitos (Bb), las células T CD3 + (BC), células B CD20 + (Bd), las células CD138 + en plasma (BE), y nódulo tumoral HLA + adyacente al ovario (Bf). La proliferación de células tumorales se demuestra por tinción positiva con KI67 (Bg), y la evidencia de fibroblastos estromales ilustrados por tricrómico de tinción de colágeno ver flechas (BH). Punta de flecha muestra células tumorales. Todas las secciones en A están en un aumento de 100x y B en las secciones están a 400 × magnificación.
La frecuencia de los tumores observados histológicamente en diferentes sitios de órganos variaban de un tumor a otro y de ratón a ratón de cada agregado celular derivada de tumor implantado. En un ejemplo típico de la distribución de órganos en 15 ratones, 116 días después de la inyección i.p. inyección de agregados celulares derivadas de tumores de ovario sólidos (5A Experimento, Tabla 1), no se detectó evidencia histológica de tumor en el ovario de 10 ratones, el bazo de 10 ratones, el hígado de 8 ratones, y el útero de 2 ratones. Se considera probable que esta participación sitio de órgano es una subestimación de la frecuencia real de los tumores en los diferentes órganos, debido a que sólo una pequeña área de cada órgano se examinó histológicamente.
Human CD45 +, CD3 +, CD20 +, CD138 + Leucocitos , fibroblastos y la proliferación de células tumorales presentes en el microambiente de xenoinjertos de tumores
Secciones de nódulos tumorales retirados de la cavidad peritoneal y teñidas con hematoxilina y eosina reveló áreas en las que los linfocitos (ver flecha) estaban presentes en yuxtaposición con tumor las células (véase cabeza de flecha) (Fig. 3Ba). La tinción inmunohistoquímica de este tejido establecido que los linfocitos asociados a tumores eran CD45 + humanas e incluyó células T CD3 +, células CD20 + B y células CD138 + en plasma (Fig. 3BB-Be). Las células tumorales se tiñeron positivamente para HLA de clase I (Fig. 3BF), e incluyó dividiendo activamente Ki67 células positivas (Fig. 3BG).
A tricrómico de los nódulos tumorales puso de manifiesto que, además de las células inflamatorias, fibroblastos estaban presentes en el microambiente de los xenoinjertos de tumor (ver la flecha) (Fig. 3Bh). Los fibroblastos con tinción positiva para HLA de clase I (datos no mostrados).
Llegamos a la conclusión de que la arquitectura histológica y composición celular incluyendo las células tumorales, leucocitos inflamatorios y fibroblastos del tejido del tumor original se mantienen durante períodos prolongados (hasta a 177 días post-injerto) en el xenoinjerto de tumor, y que las células tumorales continúan proliferando dentro de los nódulos tumorales presentes en la cavidad peritoneal.
tumor ascítico en ratones Desarrollo GSN inoculados con células tumorales de ovario Agregados-Derivado
pacientes con cáncer ovárico por lo general se desarrollan ascitis tumorales en las últimas etapas de su enfermedad [6], [7]. Para determinar si la ascitis tumorales desarrollan en el modelo de xenoinjerto de tumor, los ratones fueron monitorizados GSN durante períodos prolongados después de la inyección i.p. inoculación de los agregados de células derivadas de tumores. Se observaron abdómenes distendidos en ratones por 14 semanas después de la inyección del tumor sugiere la presencia de ascitis. La paracentesis confirmó la presencia de fluido de ascitis en la cavidad peritoneal de los ratones. i.p. Para determinar si las células tumorales viables estaban presentes en el fluido de ascitis, se inyectaron los fluidos de ascitis de ratones portadores de tumores (generados por la inoculación i.p. de agregados de células derivadas de tumores de ovario a partir de tres diferentes pacientes con cáncer de ovario) en ratones no tratados previamente GSN. ratones Ochenta y siete a 94 días después de la inoculación tuvieron evidencia histológica de desarrollo del tumor en el ovario, el útero, hígado, bazo y pulmón (datos no mostrados). La mayoría de estos receptores secundarios también habían desarrollado ascitis en ese momento. Estos resultados establecen tanto la presencia de células tumorales viables en el fluido de ascitis del tumor original ratones portadores, y la capacidad de paso secundario del tumor y de esta manera ampliar el número de ratones con xenoinjertos tumorales. Los tumores han sido exitosamente sub-pases tres veces. Después del tercer paso los xenoinjertos tumorales parecen ser en gran parte desprovista de los fibroblastos asociados a tumores humanos y linfocitos asociados a tumores.
Presencia de CA125 en el suero y ascitis de tumor de ovario ratones portadores del GSN
CA125 es una glicoproteína de alto peso molecular que se encuentra elevado en el suero de aproximadamente 90% de los pacientes con cáncer de ovario epitelial avanzado [8], [9], y se utiliza para controlar la progresión del tumor y la respuesta a la quimioterapia en pacientes con cáncer de ovario [8]. Debido a que el único signo clínico de desarrollo de tumores en los ratones era ascitis tumorales que ocurrieron muy tarde, que era de interés para determinar si los niveles de CA125 pudieron ser detectados en los ratones GSN injertadas con agregados de células derivadas de tumores de ovario, y para establecer si este marcador podría ser utilizado para controlar periódicamente la presencia y la progresión de los tumores humanos en ratones después de la inoculación del tumor. Los agregados celulares se derivan de tumores sólidos de tres pacientes con cáncer de ovario diferentes con niveles séricos elevados (& gt; 500 u /ml) de CA125. Cada uno de los tres agregados de células derivadas de tumores se inyectaron i.p. en 10 ratones GSN y los niveles de CA125 en el suero y ascitis se ensayaron en diferentes momentos después de la inoculación del tumor. Por 80 días después de la inoculación del tumor, CA125 estaba presente en las ascitis y los sueros de todos los ratones inoculados con tumores derivados de los tres pacientes diferentes. En uno de los tres grupos de ratones se sangraron los animales periódicamente y los niveles séricos de CA125 determinados. La CA125 en el suero aumentó con el tiempo alcanzando un nivel de más de 500 unidades /ml a 100 días después de la inoculación de células agregado derivado del tumor. La cantidad de CA125 en la ascitis varió considerablemente de tumor a los niveles de llegar tumorales de 400-5800 unidades /ml 85-116 días después de la inoculación de células agregado derivado del tumor. La capacidad de detectar CA125 en el suero y ascitis de ratones portadores de xenoinjertos de tumor es un reflejo de otro evento que se observa en pacientes con cáncer de ovario, y es significativo, ya que proporciona una forma de supervisar periódicamente la presencia y la progresión del tumor, y en última instancia para evaluar la eficacia terapéutica de los diferentes protocolos de tratamiento.
diseminación metastásica de xenoinjertos de tumores ováricos de la cavidad abdominal en el espacio pleural
el intraabdominal difusión que se observó después de la IP inoculación de células derivado de tumor de ovario en ratones agregados GSN, y la generación de líquido ascítico tumoral son consistentes con lo que se ve en pacientes con cáncer de ovario en estadio IIIc [7]. En esta etapa de la enfermedad puede implicar el epiplón, mesenterio intestinal, las superficies peritoneales abdominales, superficie serosa del intestino y el diafragma. Los ratones que habían desarrollado ascitis tumorales a las 16 semanas después de la inyección i.p. inyección de agregados de células derivadas de tumores, tenía evidencia bruto de tumores en las superficies serosas del intestino y omento y se examinaron atentamente para implantes tumorales diafragmática. se observó evidencia bruto de posible el crecimiento del tumor en el diafragma de 12 de 15 ratones inoculados con los agregados de células derivadas de tumores. El análisis histológico confirmó la presencia de crecimiento del tumor en el diafragma (Fig 4A).
H & amp;. tinción E (100 aumentos) revela la presencia de tumor en el diafragma (A), y en el pulmón 100 × aumento (B) y 400 × magnificación (C). La tinción inmunohistoquímica del tumor en el pulmón para HLA Clase I (D) establece que estos tumores son de origen humano. Las secciones se hicieron a partir de los tejidos de un ratón de 16 semanas después de la inyección i.p. inyección de una suspensión de tumor = agregados celulares derivadas.
Etapa IV pacientes de la enfermedad se presentan con evidencia de propagación extraabdominal del tumor y esto puede implicar el espacio pleural con metástasis en el parénquima pulmonar [7 ]. Si bien no se observó evidencia bruto de la metástasis tumoral en ratones por 16 semanas después de la inoculación de células agregado derivado del tumor, el análisis histológico de los pulmones estableció que micro-metástasis del tumor de la cavidad peritoneal se había producido en 4 de 15 ratones. Pequeños focos de tumores observados en el pulmón (Fig. 4B, C) teñidas positivamente para HLA de clase I (Fig. 4D). El número de ratones con metástasis de pulmón es probable una subestimación, ya que sólo una pequeña porción del pulmón se examinó histológicamente.
Nuestros resultados colectivos indican que el patrón lenta y progresiva del crecimiento del tumor y la metástasis de los tumores de ovario en ratones GSN después de la IP la inoculación de los agregados frescas de ovario humano derivadas de tumores de células estrechamente refleja que se observa en pacientes que desarrollan en etapas IIIc y IV de la enfermedad, que representa más del 70% de los pacientes con cáncer de ovario se observan en la clínica [7].
Las células T humanas presentes en los xenoinjertos producen IFN-γ después de la activación con células IL-12 y de plasma exógenos constitutivamente producir inmunoglobulina (Ig)
Los linfocitos, incluyendo las células de memoria T efectoras CD4 + [10], NY-ESO-1 específico de tumor Las células T CD8 + [11], las células T reguladoras CD4 + y CD8 + [12] - [14], y las células TH17 [15] se han encontrado dentro de microambientes tumorales de ovario. Estos y otros leucocitos infiltrantes de tumor se han demostrado estar asociados tanto con la mejora y la inhibición de la progresión del tumor [16]. Es de interés y relevante para la utilidad potencial de nuestro modelo de ratón humanizado para establecer si los linfocitos asociados a tumores que se encontraron en los xenoinjertos tumorales se mantuvieron viables y funcionales. Después de haber establecido por inmunohistoquímica la presencia de células T CD3 + CD45 + humanas leucocitos, células CD20 + B y células plasmáticas CD138 + en el microambiente tumoral de xenoinjertos establecido tras la inyección i.p. inyección de agregados de células derivadas de tumores (Fig. 3B), la viabilidad y la capacidad de estas células para responder a la estimulación de citoquinas exógenas
in vivo
se investigaron.
Hemos establecido previamente que T células en el microambiente tumoral tienen una señal de activación TCR impulsado atenuada, pero siguen siendo viables y responden a la estimulación con IL-12 mediante la producción de IFN-γ [17], [18]. Si las células T presentes en los xenoinjertos tumorales permanecieron viables predijimos que habría un aumento significativo de IFN-γ en el suero de ratones portadores de tumores después del tratamiento de los ratones con IL-12 [19]. los ratones portadores de tumores (21 días después de la inoculación del tumor) fueron inyectados por vía intraperitoneal ya sea con IL-12 humanos liposomas cargados (50 g de IL-12 por ratón) o liposomas de control (vacío), y sus sueros se ensayaron 5 días más tarde para la presencia de IFN-γ humano. Si bien el nivel de IFN-γ en el suero de los ratones tratados IL-12 varió de ratón a ratón, 9 de cada 10 de estos ratones mostraron niveles significativamente elevados de IFN-γ (233 a 5392 g /ml) (Tabla 2) . Todos los 5 de los ratones portadores de tumor tratados con liposomas de control tenían más bajos niveles en suero de IFN-γ que van desde 32 hasta 88 pg /ml. Estos resultados sugieren que los linfocitos humanos asociados a tumores T, y posiblemente células NK, presentes en el tumor ratones portadores son viables y sensibles a IL-12. El tratamiento solo con IL-12 no dio lugar a una disminución significativa en la progresión del tumor en comparación con los ratones control. se planean estudios futuros para evaluar el efecto de varios tratamientos de los ratones con
la viabilidad y función de las células B y las células plasmáticas en el tumor teniendo ratones IL-12 sola o en combinación con quimioterapia. se trataron mediante el ensayo de los sueros para la presencia de Ig humana. Hemos observado consistentemente altos niveles de Ig humana en el suero de los ratones portadores de tumor (Tabla 2). En un experimento representativo, se observaron niveles elevados de Ig en los ratones 78 días después del tratamiento, tanto en IL-12 tratada y los ratones de control, y no mejora consistente de los niveles séricos de Ig sin embargo se ha visto en respuesta a IL-12.
la presencia de células T y B tanto funcionales asociados a tumores en el xenoinjerto de tumor de ratones portadores de & gt; 100 días ofrece una oportunidad para investigar el posible papel que estos linfocitos (y los factores biológicamente activos que producen, es decir, citoquinas y anticuerpos ) desempeña en la supervivencia y la metástasis del tumor, y para determinar si es posible manipular estos linfocitos para que monten una respuesta eficaz antitumoral
In situ
.
Discusión
Desde el primer informe sobre el éxito del injerto de células humanas en el CB-17-SCID ratones [1], varios miles de documentos han sido publicados sobre el uso de estos y otros ratones inmunodeficientes para injertar tejidos malignos y no malignos humanos en los estudios de cáncer humano, la hematopoyesis, la adaptación y la inmunidad innata, enfermedades infecciosas, la autoinmunidad y la medicina regenerativa [2]. Los modelos de ratón se han utilizado para estudiar el crecimiento de células de cáncer y para evaluar preclínicamente la eficacia terapéutica de las estrategias de tratamiento basadas inmunes y no inmunes base para el cáncer. Las limitaciones de estos modelos anteriores incluían una respuesta inmune innata significativa de los ratones receptores que limitaban la duración del injerto y hacen difícil la interpretación de los resultados de los estudios de eficacia terapéutica. Estos modelos de xenoinjertos fracasaron recapitular los sitios y los patrones de crecimiento tumoral y en la mayoría de los modelos de co-injerto de las células del estroma no se estableció con el tumor [3].
Se presenta aquí un modelo humanizado que más de cerca es paralela a los patrones de progresión del tumor que se observan en los pacientes con cáncer de ovario que cualquier otro modelo antes descrito. Nuestro modelo capta varias características importantes del cáncer de ovario humano no se ve en los modelos anteriores. La difusión intra-abdominal, junto con el desarrollo de ascitis es sorprendentemente similar a lo que se observa en los pacientes. El co-injerto de los fibroblastos asociados a tumores y los linfocitos T y B que siguen siendo viables y funcionales durante períodos prolongados proporciona una oportunidad para investigar la posible contribución de estas células no malignas, y de los factores biológicamente activos que producen, para el crecimiento y propagación de las células tumorales.
el injerto y la difusión del tumor y co-injerto de las células inmunocompetentes asociados a tumores con estroma tumoral en este nuevo modelo de ratón humanizado ortotópico hacen posible el estudio de
in vivo
la interacción entre los linfocitos y el tumor, linfocitos y fibroblastos asociados a tumores y los fibroblastos y el tumor. Previamente se ha establecido que el estroma tumoral es fundamental para impedir o permitir la destrucción inmunológica de las células del cáncer [20]. Este trabajo fue confirmada más tarde [21], y luego se extendió mostrando que el estroma tumoral conduce a una erradicación mediada por células T del tumor establecido [22]. Orimo
et al.
Mostró que los fibroblastos derivados de los carcinomas de mama invasivo humanos mejora de forma significativa el crecimiento tumoral en modelos de xenoinjerto [23]. fibroblastos asociados a tumores se ha demostrado por otros para mejorar o suprimir la función de las células T [24] - [26] y subconjuntos de células T asociados a tumores se sabe que interactúan con células tumorales y recíprocamente modular entre sí [27]. Ya sea de fibroblastos o leucocitos presentes dentro de microambientes tumorales humanas mejorar y /o suprimen los tumores aún no se ha establecido [28], [29]. Por el ozono, funcionalmente la inhibición o activación de subconjuntos específicos de células dentro de los agregados celulares derivadas de tumores antes de la inoculación en ratones NSG el efecto sobre el injerto y la difusión posterior intraabdominal y la metástasis en el espacio pleural extraabdominal puede ser determinada, estableciendo de ese modo el cual las células en el microambiente del tumor contribuyen a la detención del tumor o la mejora de la progresión tumoral.
el cáncer de ovario es el más a menudo asintomática en sus primeras etapas como la mayoría de los pacientes tienen enfermedad muy extendida en el momento del diagnóstico [30]. Nuevos conocimientos sobre la patogénesis y el origen del cáncer de ovario seroso en última instancia puede conducir a un diagnóstico más precoz de esta enfermedad. Cada vez más pruebas ha indicado que la mayoría o todos los carcinomas de ovario seroso de alto grado se originan en las trompas de Falopio [31], [32]. los niveles séricos elevados de CA125 (una proteína marcadora de tumores) se encuentran en & gt; 90% de los pacientes con cáncer de ovario en estadio avanzado, pero relativamente pocos pacientes con enfermedad en estadio I son CA125 positivo. De manera similar los ratones inoculados i.p. con agregados de células derivadas de tumores no muestran ninguna evidencia clínica de los tumores durante al menos 80 días cuando se detectaron primero niveles de CA125 elevados en los sueros. El nivel de CA125 en suero luego aumentó rápidamente alcanzando niveles superiores a 500 unidades /ml por día 100 después de la inoculación. En este momento y más allá de los ratones mostraron una patología consistente con el estadio IIIC y IV de cáncer de ovario, es decir, evidencia de diseminación intraabdominal en múltiples sitios de órganos, implantes diafragmáticas, desarrollo de ascitis tumoral y la diseminación extra-abdominal en el espacio pleural con metástasis al pulmón [7].
por lo tanto, mientras que los niveles de CA125 son un indicador fiable de la presencia y la expansión de los tumores de ovario en los pacientes y en nuestro modelo de ratón humanizado, no es adecuado para la detección temprana de tumores, ya sea en pacientes o en ratones inoculados con los agregados de células derivadas de tumores. Sin embargo, los niveles séricos de CA125 se utilizan actualmente de manera efectiva para controlar la respuesta del cáncer de ovario los pacientes a la quimioterapia y la cirugía [8]. Este biomarcador también se ha utilizado como un indicador de pronóstico para pacientes con cáncer de ovario. Esperamos que los niveles de CA125 en suero también ser un marcador cuantificable muy útil para supervisar periódicamente y comparar
in vivo
efectos terapéuticos en nuestro modelo de ratón humanizado.
La capacidad mejorada de pequeños agregados de tumor y las células tumorales no malignas para establecer, crecen y se propagan dentro de la cavidad peritoneal (en comparación con piezas sólidas no interrumpido de tejido tumoral) puede depender de la capacidad de los pequeños grupos de células para sobrevivir inicialmente hasta que se establezca un suministro vascular suficiente para permitir la expansión del tumor . El éxito de la injerto de agregados de células derivadas de tumores también puede depender en parte de la contribución de los factores biológicamente activas producidas por las células no malignas en los agregados de células que producen factores de crecimiento tumoral y estimulantes de la angiogénesis. Las masas tumorales más a menudo se producen primero en las áreas craneales de la cavidad peritoneal cerca de y dentro del epiplón. La posición de los nódulos tumorales, así como el crecimiento mejorado de los agregados de células y la progresión lenta de los tumores a otros órganos pueden resultar de la unión inicial de los agregados de células tumorales a las áreas altamente vascularizadas dentro del epiplón llamado manchas lechosas. Estas áreas discretas fueron reconocidos por primera Ranvier [33] y se ha demostrado que los sitios donde los tumores se unen preferentemente y proliferar después de la i.p. inyección de varias líneas de células tumorales murinas diferentes y una línea humana de células tumorales de ovario en ratones [34], [35].