Extracto
Un reto importante en el tratamiento de pacientes con cáncer de próstata es la identificación de aquellos individuos en riesgo de desarrollar la enfermedad metastásica, como en la mayoría de los casos la enfermedad permanecerá indolente. Analizamos agruparon muestras de suero de 4 grupos de pacientes (n = 5 muestras /grupo), recogidos de forma prospectiva y monitoreados de forma activa durante un mínimo de 5 años. Los grupos de pacientes fueron: (i) el diagnóstico histológico de hiperplasia prostática benigna sin evidencia de cáncer 'BPH', (ii) cáncer localizado sin evidencia de progresión, "no progresa '(iii) cáncer localizado con evidencia de progresión bioquímica, que progresa ', y (iv) la metástasis ósea en la presentación "metastásico". Las muestras combinadas fueron inmuno-agotado de las 14 proteínas más abundantes y altamente analizados utilizando un enfoque iTRAQ 4-Plex. En general se identificaron 122 proteínas y relativamente cuantificados. Las comparaciones de progresar
frente
grupos no progresan identificaron la expresión diferencial significativa de 25 proteínas (p & lt; 0,001). Las comparaciones de metastásica
frente
grupos progresan identificaron la expresión diferencial significativo de 23 proteínas. Mapeo de las proteínas expresadas diferencialmente en la vía de la progresión del cáncer de próstata reveló la expresión desregulada de las proteínas individuales, pares de proteínas y "paneles" de las proteínas para asociarse con etapas particulares de desarrollo de la enfermedad y la progresión. La mediana de intensidad de inmunotinción de la traducción eucariótica factor de elongación 1 alfa 1 (eEF1A1), uno de los candidatos identificados, fue significativamente mayor en los osteoblastos en las proximidades de las células tumorales metastásicas en comparación con los osteoblastos en el hueso de control (p = 0,0353, Mann Whitney U). Nuestro enfoque proteómico ha identificado clientes potenciales para biomarcadores séricos potencialmente útiles asociados con la progresión metastásica de cáncer de próstata. Los paneles identificados, incluyendo la orden de eEF1A1 una mayor investigación y validación
Visto:. Rehman I, CA Evans, Glen A, Cruz SS, Eaton CL, Abajo J, et al. (2012) iTRAQ Identificación de Candidato Suero biomarcadores asociados con la progresión metastásica del cáncer de próstata humano. PLoS ONE 7 (2): e30885. doi: 10.1371 /journal.pone.0030885
Editor: Karl X. Chai, University of Central Florida, Estados Unidos de América
Recibido: 26 Agosto, 2011; Aceptado 27 de diciembre de 2011; Publicado: 15 Febrero 2012
Derechos de Autor © 2012 Rehman et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por becas de PROMET (proyecto no. FP6-LSH-5-2004-018858), y P-MARK (contrato no. LSHC-CT-2004-503011), dentro del sexto programa marco de la UE y el símbolo del CNRI (próstata Mecanismos de cáncer de progresión y tratamiento) beca de colaboración con el Dr. Hamdy, y donaciones de Ingeniería y Ciencias físicas de Investigación (EPSRC) al Dr. Wright: EP /E036252 /1 y GR /S84347 /01. Estamos muy agradecidos con el Dr. Nicholas Hoyle en Roche Diagnostics, Penzberg, Alemania por su apoyo hacia los consumibles y reactivos para el proyecto. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, la decisión de publicar o preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Estamos muy agradecidos con el Dr. Nicholas Hoyle en Roche Diagnostics, Penzberg, Alemania por su apoyo hacia los consumibles y reactivos para el proyecto. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE en los datos y materiales de uso compartido.
Introducción
En Europa y en los EE.UU., el cáncer de próstata es el segundo cáncer más común el diagnóstico y el tercera causa más común de muerte por cáncer en los hombres [1], [2]. Por otra parte, la incidencia ha aumentado desde la introducción generalizada de antígeno específico de próstata (PSA) [3]. La mayoría de los pacientes con cáncer de próstata son diagnosticados en una etapa temprana, pero incluso con la detección de más de 7% de los casos se desarrollan enfermedad metastásica [4]. En los hombres con metástasis a distancia el pronóstico es malo, con una supervivencia media de 24 a 48 meses. El hueso es el sitio más común para la metástasis del cáncer de próstata y se asocia con dolor en los huesos, compresión de la médula espinal y de insuficiencia de la médula [4]. Actualmente, las lesiones metastásicas óseas se determinan mediante formación de imágenes tales como la gammagrafía ósea isotópica, sin embargo, la identificación de un biomarcador basado en suero (s) para la predicción de la susceptibilidad de los pacientes a desarrollar metástasis en los huesos podría permitir una evaluación clínica más precisa de la guía de la enfermedad y ayuda la terapia.
El diagnóstico de cáncer de próstata es más comúnmente hecha por una tríada de antígeno prostático específico (PSA) mediciones, el examen rectal digital (DRE), y la evaluación histológica de la ecografía transrectal (ETR) material de biopsia guiada [ ,,,0],5]. Aunque PSA se aprobó un FDA biomarcador para la detección de cáncer de próstata, su utilidad es controvertida ya que se ha demostrado ser poco fiables para el diagnóstico de enfermedades, y en particular para distinguir indolente de formas agresivas de la enfermedad [6], [7]. Además, el PSA se asocia con un alto grado de resultados falsos positivos y falsos negativos, como los niveles pueden estar elevados en condiciones no cancerosas de la próstata, incluyendo hiperplasia prostática benigna (BPH). Por lo tanto, se necesitan con urgencia biomarcadores adicionales que podrían mejorar la especificidad de diagnóstico de PSA y predecir la probabilidad de progresión de la enfermedad.
sangre y sus productos, tales como plasma y suero son fluidos ideales para la identificación de biomarcadores de cáncer, ya que contienen proteínas tanto secretada y arrojar a partir de células cancerosas, en combinación con la facilidad de muestreo. Sin embargo, la composición variable y amplio rango dinámico de las proteínas presentes en el plasma (se estima que 10
10 órdenes de magnitud o más), plantean retos formidables en la identificación de biomarcadores clínicamente relevantes entre el fondo de abundantes proteínas como la albúmina, inmunoglobulina y transferrina [8]. De los 22 o menos proteínas más abundante en el plasma, estos constituyen más del 99% de la masa de las proteínas plasmáticas totales, mientras que el 1% restante se pensó que se compone de las proteínas de abundancia media /baja e incluyen la piscina biomarcador [9 ]. Las grandes órdenes de magnitud en la concentración de proteínas han obstaculizado los esfuerzos basados en la espectrometría de masas anteriores encaminadas a la identificación de biomarcadores clínicamente relevantes, debido principalmente a la supresión de la ionización de las proteínas de baja abundancia por las proteínas de mayor abundancia [10]. Sin embargo, la eliminación previa de algunas de las proteínas más altamente abundantes se ha demostrado que mejora la detección de proteínas relativamente abundantes inferior [11], [12]. Aunque hay muchos diferentes metodologías de fraccionamiento de proteínas en base a diferencias en el peso molecular, forma, carga, pI, hidrofobicidad y afinidad a través de interacciones biomoleculares específicas, se ha informado de que la alta abundancia de separación de proteínas utilizando el anticuerpo basado IgY-12 immunodepletion sistema es altamente reproducible [13].
Entre las tecnologías proteómicas utilizados para la identificación de biomarcadores, 'isobáricas Etiquetas para la cuantificación relativa y absoluta' (iTRAQ) tiene la ventaja de ser relativamente alto rendimiento, y pueden proporcionar simultáneamente información sobre la cuantificación e identificación de péptidos , como se informó anteriormente por nosotros y otros [14] - [16]. En pocas palabras, en un flujo de trabajo típico se reducen las muestras, alquilada y digeridos proteolíticamente para generar péptidos. Los péptidos se etiquetan con un conjunto de reactivos iTRAQ (en un formato de 4 o 8-plex), se reunieron y se fraccionó por intercambio catiónico fuerte (SCX). Las fracciones se analizaron entonces mediante cromatografía líquida espectrometría de masas tándem (LC-MS /MS), con los espectros de masas resultantes proporcionan información de la secuencia (a partir de los fragmentos de péptidos), y la cuantificación relativa (de los iones grupo informador).
en un esfuerzo por identificar nuevas proteínas asociadas con la progresión metastásica del cáncer de próstata humano, hemos realizado un análisis de iTRAQ 4-plex utilizando muestras de suero reunidas recogidas de forma prospectiva a partir de 4 grupos bien definidos de pacientes que fueron monitoreados de forma activa durante al menos 5 años, y seleccionado para representar el espectro de la enfermedad prostática. Tras el análisis de datos, se encontró un número de candidatos a ser significativamente expresadas diferencialmente en las muestras de cáncer en comparación con las muestras benignas. Uno de los candidatos identificados como significativamente hasta reguladas en grupos de cáncer fue factor de elongación de la traducción eucariótica 1 alfa 1 (eEF1A1), y se procedió a investigar por inmunohistoquímica usando muestras de tejido de próstata a partir de casos localizados y metastásicos. El biomarcador cabeza de serie en nuestro estudio de fase "descubrimiento", incluyendo eEF1A1 se discuten en relación a su importancia en la progresión del cáncer de próstata.
Materiales y Métodos
Pacientes y suero colección
la sangre periférica se recogió de forma prospectiva de pacientes que asisten a la clínica de Urología del hospital Royal Hallamshire en el momento de su visita inicial, tras el consentimiento informado por escrito. Muestra de sangre recogida fue aprobado por el Comité de Ética de la Universidad de Sheffield. El suero se recogió por permitiendo que la sangre coagule durante 30 min, se centrifugó a 1200 xg durante 10 min a 4 ° C y después se almacenaron a -80 ° C en alícuotas de 100 l. Todas las muestras de sangre se recogieron antes de la administración de cualquier tratamiento. Veinte muestras de suero fueron cuidadosamente seleccionados para representar las diferentes etapas y grados de la enfermedad de la próstata y se agruparon (n = 5 pacientes /grupo), para formar 4 grupos de pacientes. Todos los pacientes fueron monitorizados de forma activa durante al menos 5 años desde el momento de su toma de muestras de sangre inicial. Los 4 grupos de pacientes fueron: Grupo 1: diagnóstico histológico de hiperplasia prostática benigna 'HPB', sin evidencia de cáncer en al menos 2 grupos independientes de biopsias prostáticas, y un nivel de PSA por debajo de 10 ng /ml (media de edad de 61 años) . Grupo 2: diagnóstico histológico de cáncer de próstata con un nivel de PSA por debajo de 10 ng /ml, y no hay evidencia de un aumento del PSA después de 5 años de vigilancia activa - "no progresa" grupo, (edad media de 67 años); Grupo 3: el diagnóstico histológico de cáncer clínicamente localizado con un nivel de PSA inicial inferior a 13 ng /ml, seguido de 3 aumentos consecutivos en los niveles de PSA durante 5 años de vigilancia activa -'progressing grupo, (edad media de 69 años); Grupo 4: pacientes con un PSA & gt; 19 ng /ml y la evidencia de metástasis en los huesos de una gammagrafía ósea positiva radionucleótida - grupo "metastásico", (edad media de 73 años). Se encontró que las diferencias en las edades medias de los pacientes que no deben ser estadísticamente significativa entre los 4 grupos (p = 0,146, prueba de Kruskal-Wallis). Las características de la enfermedad de los 20 pacientes que comprenden los 4 grupos se muestran en la Tabla S1.
material de tejido del paciente
microarrays de tejidos (TMA), que constan de 56 casos de adenocarcinoma de próstata, que van de los grados individuales Gleason (es decir, 2 grado, n = 5; grado 3, n = 32; grado 4, n = 9; grado 5, n = 10), y 40 casos de tejido no maligno adyacente, y se construyeron como se describe anteriormente [17] , [18]. Otros 23 casos adicionales de biopsias óseas de los pacientes con y sin cáncer de próstata metástasis ósea se obtuvieron por 8 mm biopsia por trépano que se realiza bajo anestesia general. se obtuvo el consentimiento informado del paciente y la aprobación del Comité de Ética antes del estudio (Comité de Ética de Investigación del Sur, Sheffield SSREC /02/155 y 00/172).
Las líneas celulares
líneas celulares de cáncer de próstata humano LNCaP, PC-3, DU145 y VCAP se adquirieron de la American Type Culture Collection (ATCC), (http://www.lgcstandards-atcc.org/). Se obtuvieron células DuCaP a través del consorcio del proyecto PRIMA (http://www.primaproject.org/participants.php). El LNCaP-Pro5, LNCaP-LN3, PC-3M y PC-3M-LN4 células fueron una especie de regalo del doctor Curtis Pettaway (Universidad de Texas, M. D. Anderson Cancer Centre), [19]. Las líneas celulares LNCaP-C4-2 y LNCaP-C4-2B se obtuvieron del Prof. George Thalmann [20]. Las células de osteosarcoma TE-85 fueron una especie de regalo del Prof. J. A. Gallagher, Universidad de Liverpool. Todas las líneas celulares de cáncer de próstata se cultivaron como se describe y se confirmó que estar libre de Mycoplasma anteriormente [15].
IgY-14 empobrecimiento por afinidad de muestras de suero
muestras de suero reunidas se agota de los 14 más proteínas plasmáticas comunes utilizando el IgY-14 sistema de agotamiento Seppro [21]. Estudios anteriores han demostrado que la agrupación de suero seguido por el agotamiento de las proteínas más altamente abundante es una estrategia eficaz para reducir el rango dinámico de las proteínas, y por lo tanto mejorar la identificación de biomarcadores de suero, como se demostró por el método de proteómica cuantitativa de iTRAQ (R) [ ,,,0],22]. Las muestras de suero a partir de 5 pacientes que representan a cada uno de los 4 grupos de pacientes se agruparon en volúmenes iguales para dar un volumen total de 200 l para cada grupo (40 l de cada muestra). Las muestras de suero reunidas se envían en hielo seco para Genway (Digilabs Biovision, Alemania), para la inmuno-agotamiento utilizando el sistema Seppro Ig-Y14. La fracción de flujo pasante (empobrecido de la albúmina, inmunoglobulina IgG, fibrinógeno, la transferrina, IgA, IgM, haptoglobina, alfa2-macroglobin, glicoproteína alfa 1-ácido, alfa 1-antitripsina, Apo AI HDL, Apo A-II HDL, complemento C3 y LDL (ApoB)), se utilizó para la posterior análisis iTRAQ.
iTRAQ etiquetado de la muestra y SCX fraccionamiento
Antes del análisis iTRAQ, las muestras se concentraron y se intercambió el tampón usando 5 kDa de peso molecular de corte de giro concentradores (Millipore). Las muestras fueron intercambio de tampón tres veces contra 500 l de 1 M triethylammoniumbicarbonate (TEAB) de tampón y se concentró hasta un volumen de aproximadamente 80 l. Las muestras se marcaron con los reactivos iTRAQ de acuerdo con las instrucciones del fabricante, y como se describe anteriormente [14], [15]. Cada muestra se marcó con uno de los cuatro reactivos iTRAQ (iones reportero iTRAQ de relación de 114,1, 115,1, 116,1, 117,1 masa /carga). El orden de etiquetado etiqueta era BPH- 117; localizada no progresa cáncer-116; progresando cáncer-115; metastática-114). muestras marcadas se agruparon y se fraccionaron mediante intercambio catiónico fuerte (SCX), usando una columna de HPLC BioLC (Dionex, Surrey, Reino Unido), y se analizaron por LC-MS /MS como se describe anteriormente [14], [15].
Tandem espectrometría de masas análisis
espectrometría de masas (MS) se realizó utilizando un espectrómetro de masas en tándem de tiempo de vuelo QStar XL Hybrid ESI cuadrupolo, ESI-qQ-TOF-MS /MS (Applied Biosystems, Framingham, MA; MDS-Sciex, Concord, Ontario, Canadá), junto con un sistema de cromatografía líquida capilar en línea (Famos, Switchos y Ultimate de Dionex /LC Embalajes, Ámsterdam, Países Bajos). Las muestras secas se volvieron a suspender en 60 l de 3% de acetonitrilo y 0,1% de ácido fórmico listo para la MS, y 10 a 15 l (dependiendo de la concentración de péptido como se ve en la intensidad del pico del cromatograma SCX) se inyectaron a la nano- sistema de MS para cada análisis LC-ESI-MS /. separación inicial se llevó a cabo en una columna PepMap C
18 RP capilar (LC Embalajes) con un caudal constante de 0,3 l /min. tampones LC A y B se prepararon como 3% de acetonitrilo, ácido fórmico al 0,1% y 97% de acetonitrilo, ácido fórmico al 0,1%, respectivamente. El gradiente se inició como 97% de tampón A y 3% de tampón B durante 3 minutos, seguido de 3 a 25% de tampón B durante 120 minutos, 90% de tampón B durante 7 minutos y finalmente 97% de tampón A durante 7 minutos. La adquisición de datos en el espectrómetro de masas se establece en el modo de ion positivo, con un intervalo de masa seleccionado de 350 a 1800 m /z. Espectrometría de masas se realizó en péptidos con +2, +3, +4 estados de carga a través de un rango de exploración de 65 a 2000 m /z.
identificación y cuantificación de proteínas en relación
Identificación de proteínas y cuantificación relativa se llevó a cabo como se describe anteriormente [23], [24]. Identificación de los precursores de péptidos y fragmentos se llevó a cabo mediante la búsqueda de bases de datos en contra de la Swiss-Prot y Trembl
Homo sapiens
de datos de proteínas (41070, 71449 ORF respectivamente, descargado de UniProt, mayo de 2010). Los parámetros para la búsqueda se establecieron de la siguiente manera: MS tolerancia fue de 0,4 y la tolerancia de MS /MS se fijaron en: tolerancia péptido 0,4 Da, carga +2, +3 y +4, min longitud del péptido, z-score, max p-valor y la El marcador AC fueron 6, 6, 10
-6 y 6, respectivamente. Phenyx de puntuación por defecto 'turbo' fue activada con una restricción tolerancia de masa de 0,1 Da para MS y MS /MS y el porcentaje mínimo de la cobertura de secuencia del péptido mediante b
+ (b), b
2 + (b ++), y
+ (y) o una serie fragmento y
2 + (y ++) se establece en el valor predeterminado de 20%. Objetivo espacio de búsqueda de base de datos se limitó a los péptidos trípticos con un máximo de 1 miscleavage. Las modificaciones se establecieron como: cambios de masa 4-plex iTRAQ (144 Da, K y N-terminal), metiltiol (46 Da) y la oxidación de la metionina (16 Da). tasas de falso descubrimiento (FDR) se estimaron utilizando una base de datos de destino-señuelo concatenada como se describe por Elias y Gygi [25]. cambios en las proteínas fueron calificados usando un algoritmo de prueba de la t desarrollado en la casa [23].
La inmunohistoquímica para eEF1A1
La inmunohistoquímica se realizó esencialmente como se describe anteriormente [18]. Secciones de tejidos óseos y prostáticas se cortaron (4 m) y se montaron en portaobjetos Superfrost (VWR International, Alemania). Las láminas fueron incubadas con el anticuerpo monoclonal de ratón anti-eEF1A1 (Santa Cruz Biotechnology, CA, EE.UU. Cat. N
o sc21758), a 0.4 mg /ml en suero de caballo al 2% durante la noche a 4 ° C. Las secciones se lavaron dos veces en PBS-Tween 20 (PBST), y se incubaron durante 30 min con anti-IgG de ratón ImmPRESS HRP (Vector Laboratories, Cat. N
o MP-7402). Después de un lavado adicional en PBST, la localización del complejo de antígeno /anticuerpo se visualizó usando el sistema IMMPACT DAB (Vector Laboratories, Cat. N
o SK-4105). Las secciones de control se incubaron con control de isotipo IgG anti-ratón (Vector Laboratories I-2000), se diluyó a 0,4 g /ml en suero de caballo normal al 2%. eEF1A1 inmunotinción fue evaluada por la intensidad y la localización celular por un anatomopatólogo con experiencia (Dr. Simon Cruz), que desconocía el estudio. Cada caso se le asigna una intensidad de tinción, que van desde 0-3, donde 0 = ausente; 1 = débil; 2 = moderado y 3 = tinción intensa como se describe anteriormente [18].
Western Blot
Western Blot se realizó esencialmente como se describe anteriormente [26]. Anti-EF-Tu policlonal de cabra IgG anticuerpo primario se utilizó en una concentración de 1:1000 (Santa Cruz, Cat. N
o. Sc12990). El anticuerpo secundario era de conejo conjugado con HRP anti-cabra (Abcam), y fue utilizado a una concentración de 1:1400 (Abcam). de precisión doble color más marcadores de peso molecular se utilizaron para la estimación del tamaño (Bio-Rad, Hertfordshire, Reino Unido).
transcripción inversa-PCR y secuenciación
ARN total fue extraído a partir de líneas celulares de cáncer de próstata utilizando TRI reactivo (Sigma-Aldrich, Reino Unido), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ARN se cuantificó espectrofotométricamente y 2 g se transcribe de forma inversa en ADNc utilizando el kit Superscript III de la transcriptasa inversa con 250 ng de cebadores al azar, de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Invitrogen, Reino Unido). cebadores de PCR específicos para la isoforma eEF1A1 fueron diseñados de forma manual, utilizando la secuencia de cDNA Ensembl: ENST00000316292 (http://www.ensembl.org/index.html). La secuencia del cebador hacia adelante fue eEF1A1-(5'-3 '): TCCTTCAAGTATGCCTGGGTCT (eEF1A1-F1), correspondiente a las posiciones de nucleótidos 157-178. La secuencia del cebador inverso era eEF1A1-: TGGCACAAATGCTACTGTGTCG (eEF1A2-R1), que corresponden a las posiciones de nucleótidos 555-576, para dar un producto de PCR de tamaño esperado de 420 pb. Del mismo modo cebadores de PCR específicos para la isoforma eEF1A2 se diseñaron utilizando la secuencia de cDNA Ensembl: ENST00000298049. La secuencia del cebador hacia adelante fue eEF1A2-: AGGAGGCTGCTCAGTTCACCT (eEF1A2-F3), correspondiente a las posiciones de nucleótidos 1004-1024; y la eEF1A2- inversa secuencia del cebador fue: CCGCTCTTCTTCTCCACGTTC (eEF1A2-R3), correspondiente a las posiciones de nucleótidos 1317-1336, con un tamaño de producto de PCR esperado de 334 pb. Los cebadores se sintetizaron usando la instalación comercial en Eurofins MWG Operon (http://www.eurofinsdna.com/products-services/oligonucleotides0.html).
La transcripción inversa se realizó la PCR mediante el uso de 1 l de cDNA a partir de cada de las líneas celulares, 10 pmol de cada cebador de avance /retroceso, y 0,5 l de Taq ADN polimerasa AccuPrime (Invitrogen, Reino Unido), en 20 volúmenes mu l. Los ciclos térmicos se realizó bajo las siguientes condiciones: desnaturalización inicial a 94 ° C durante 5 minutos; 30 ciclos de PCR de 94 ° C durante 1 min, 58 ° C durante 1 min, y 72 ° C durante 1 min, y una extensión final de 72 ° C durante 7 minutos. Los productos amplificados de PCR (10 l) se separaron en un gel de agarosa al 2,5% que contenía bromuro de etidio y la imagen utilizando la XR GelDoc
+ Molecular Imager (Bio-Rad). Banda intensidades se midieron utilizando el software Cantidad Uno (Bio-Rad).
Los productos de PCR fueron secuenciados en la facilidad de la base genética de la Universidad de Sheffield (http://www.shef.ac.uk/medicine/research /corefacilities/genetics.html). Las secuencias de ADN se visualizaron utilizando el software Chromas Lite versión 2.01, descargarse libremente desde http://www.technelysium.com.au/chromas_lite.html.
Resultados
análisis de agrupamiento jerárquico de los perfiles de proteínas
Análisis de los 4 grupos combinados de pacientes identificaron 122 proteínas con la información asociada en sus niveles relativos de expresión (Tabla S2). La tasa de falso descubrimiento fue de 1,4%, lo que está dentro del límite aceptable de 5% [25]. Para el conjunto de datos iTRAQ, se identificaron 75 proteínas únicas y relativamente cuantificados con ≥ 2 péptidos únicos, y se utilizaron estos datos para los análisis estadísticos para determinar las alteraciones en los niveles de proteína entre los grupos. La agrupación jerárquica se realizó para agrupar los datos en función del grado de similitud entre los grupos de BPH y cáncer. agrupación de aglomeración utilizando la distancia euclídea al cuadrado entre log
10 valor de los coeficientes iTRAQ más pequeño y procedimiento de vinculación intercluster disimilitud se realizó (Mathematica 7.0.0 para Mac), para generar el dendrograma se muestra en la Figura 1. Una característica clave del dendrograma es la separación de los grupos de pacientes según el estadio de la enfermedad. Los pacientes con metástasis separan más lejos y por lo tanto se considera que son los más diferentes de los pacientes con BPH. Los pacientes con HPB agrupado más de cerca con los pacientes en el grupo de no progresar en comparación con los grupos que progresan y metastásicos.
Las muestras se agruparon basan en la similitud de sus perfiles de expresión de proteínas observadas en el registro
10 de la relaciones iTRAQ y un dendrograma generado para indicar la relación entre las muestras. Se muestra la distancia euclídea al cuadrado entre los grupos (solo vínculo). Diferentes longitudes de los puntos de ramificación indican el grado de similitud; cuanto más corta la rama mayor será el grado de similitud.
Gene ontología anotación
Para evaluar la gama de las proteínas identificadas, la ontología de genes (GO) anotaciones para los procesos biológicos fueron asignados mediante el proteína análisis a través de las relaciones evolutivas de software (Panther), que une los códigos de adhesión de proteínas para las entradas correspondientes en la base de datos de ontología de genes [14], [27]. El análisis PANTHER reveló la presencia de muchas proteínas plasmáticas común, tales como las asociadas con la inmunidad mediada por el complemento (14%), la inmunidad y la defensa (27%), la proteolisis (21%), la coagulación de la sangre (7%), y metabolismo de las proteínas y la modificación (22%).
Para el análisis de la red biológica, la plataforma MetaCore (GeneGo, Inc., St. Joseph, MI), fue empleado como se describe anteriormente [14], que reveló que muchos de los expresados diferencialmente proteínas tales como C4, C4a, C5, C5b, C9 y C6 asignan a la vía clásica respuesta inmune (Figura S1).
biomarcador de diagnóstico lleva
las diferencias en los niveles de proteína se presentan después de un t análisis de test como se describe anteriormente [23]. Los valores de p se calcularon basándose en el número de péptidos usados para la cuantificación y la varianza de las relaciones de reportero iTRAQ derivados de estos péptidos. A p-value≤0.01 se utiliza para asignar cambios significativos en los niveles de proteína entre los grupos de muestras. Es importante destacar que los cambios en las proteínas informado que la expresión diferencial significativa fueron seleccionados en base a la significación estadística en lugar de cambio veces [28]. Se espera que algunas de estas diferencias para ser potencialmente mayor debido a la conocida bajo la estimación asociada con la cuantificación basada iTRAQ [24].
Durante nuestro análisis que estábamos interesados en proteínas que muestran el aumento o disminución de los niveles de expresión, ya que estudios previos han informado de que tanto arriba de manera significativa y proteínas-regulado puede ser de relevancia clínica [15], [29].
la identificación de proteínas expresadas diferencialmente en no progresa, los grupos de pacientes metastásicos en relación con el progreso y HPB grupo eran de interés, ya que podrían proporcionar pistas para los biomarcadores de diagnóstico y pronóstico potencialmente útiles (Tabla S3). Por lo tanto, una comparación entre el grupo de cáncer no progresa frente al grupo BPH mostró una expresión diferencial significativa de 22 proteínas; 7 de los cuales son regulados hasta 15 y las reguladas (Tabla S3a). Del mismo modo, una comparación entre el grupo de pacientes que progresa frente al grupo BPH identificado la expresión diferencial de proteínas de 19; 11 de los cuales mostraron sobreexpresión significativa y 8 mostraron baja regulación (Tabla S3b). Las comparaciones del grupo de pacientes metastásico versus el grupo de BPH identificaron la expresión diferencial de proteínas de 35, con 19 proteínas que muestra significativa sobre-expresión y 16 que muestra significativa baja regulación (Tabla S3c). Además, se descubrió que la proteína C-reactiva (PCR) para ser elevado 41,1 veces en el suero de los pacientes con enfermedad metastásica en comparación con los pacientes con HPB (Tabla S2).
biomarcador pronóstico
lleva
Una vez un diagnóstico de cáncer se han realizado son los siguientes pasos para establecer la extensión (etapa) de la enfermedad, en un intento de predecir aquellos pacientes en los que es probable que el progreso de los pacientes en los que es probable que permanezca localizada la enfermedad de la enfermedad, y para obtener información sobre el pronóstico. En la actualidad, los niveles de PSA pre-tratamiento, la biopsia grado de Gleason y la estadificación clínica se utilizan para proporcionar información pronóstica; sin embargo, estos parámetros están asociados con una serie de limitaciones. Por lo tanto, una comparación de los pacientes con progresión versus no progresa la enfermedad identificado la expresión diferencial significativa de 25 proteínas; 13 hasta reguladas y 12 abajo reguladas (Tabla S4).
niveles de proteína diferenciales asociados a la progresión de la enfermedad
Además de las comparaciones anteriores, diferencias en las proteínas fueron asignadas de acuerdo a la etapa de próstata el desarrollo y progresión del cáncer, es decir, como el cáncer desarrollado a partir de epitelio no maligno y progresaron a enfermedad localmente avanzada y metastásica (Figura 2). Las listas de las diferencias se basan en comparaciones entre la no progresión frente al grupo HBP; progresando en comparación con el grupo no progresa; y metastásico frente progresando grupos de cáncer. De la Figura 2, es evidente que las proteínas individuales, pares '' de proteínas y 'Paneles' de las proteínas (definidos como ≥3 proteínas), se observaron a ser expresadas diferencialmente en ciertas etapas del desarrollo de la enfermedad y la progresión. Por ejemplo, se observaron proteínas individuales tales como alfa-2-macroglobulina, lumican y amiloide A sérico P-componente que se expresa diferencialmente entre la no progresión versus el grupo de BPH. Otras proteínas tales como beta-2-glicoproteína 1 y somatomedina-B (fuente azul), se observaron tanto a ser relativamente reducido como "par" en el progreso frente a muestras no progresa, mientras que tanto la apolipoproteína A-1 V y que el componente del complemento 4B eran ve que es relativamente incrementada en la expresión en muestras metastásicas en comparación progresando muestras (fuente anaranjada). Adicionalmente, se observaron dos "paneles" que alterarse ya que la enfermedad se desarrolló y progresó. El primer panel compuesto por 3 proteínas: afamina, alfa-2-HS-glicoproteína cadena B y fibronectina 1 (que se muestra en la fuente roja), y fue visto a ser relativamente aumentó en la expresión en la no progresión en comparación con el grupo de la HPB, pero disminuyó como el cáncer progresó y se mantuvo relativamente bajo como el cáncer metástasis. El segundo panel compuesto de 7 proteínas: alfa-1-antiquimotripsina; cDNA FLJ55673, muy similares para complementar factor B; ADNc FLJ54228, muy similar a la alfa rica en leucina-2-glicoproteína; cDNA FLJ58564, muy similar a inhibidor de la proteasa C1 plasma; Ceruloplasmina, C5 del complemento y el componente del complemento C9b (fuente verde), y no se observaron a ser relativamente disminución en la expresión en el grupo de no progresar en comparación con el grupo de la HPB, y relativamente aumento en la expresión como el cáncer progresaba es decir, fueron relativamente crecido sobre la progresión grupo y se mantuvo elevada en el grupo metastásico
la lista de proteínas expresadas diferencialmente se muestran están basados en comparaciones entre no avanza contra la HPB.; progresando frente a la no progresión y metástasis en comparación con los grupos que progresan. Nótese la expresión diferencial de proteínas, ya sea de forma individual (tipo de letra negro), en forma de pares (azul, naranja y púrpura fuentes), o como un panel (≥ 3 proteínas, verde y rojo fuentes). (*) = Identificadas como un único péptido alta confianza.
Curiosamente, el factor de elongación de la traducción eucariótica 1 alfa 1 (eEF1A1), (también conocido como EF-Tu), fue visto a mostrar una mayor expresión significativa en la no -progressing cáncer en relación con BPH, y su expresión se incrementó aún más con progresión de la enfermedad, y se mantuvo durante la metástasis (Tabla S2 y la Figura 2). eEF1A1 fue el primero éxito tras la búsqueda BLASTP del péptido VETGVLKPGMVVTFAPVNVTTEVK identificado en las muestras de suero. La comparación de la secuencia de aminoácidos de longitud completa de eEF1A1 con su isoforma eEF1A2, indicó que la secuencia del péptido era única para eEF1A1. El péptido correspondiente en eEF1A2 difiere en un único aminoácido donde valina es sustituida por isoleucina. Dado que estos aminoácidos tienen una diferencia de 14 kDa de masa molecular podríamos asignar con confianza el péptido identificado para corresponder a la isoforma eEF1A1.
La confirmación de los candidatos identificados por iTRAQ
Para confirmar la expresión diferencial de proteínas candidatos identificados por iTRAQ, que posteriormente llevan a cabo una electroforesis en gel 1D utilizando suero agrupado de los 4 grupos de pacientes. Después de la tinción con azul de Coomassie, una banda débil se observó visualmente para estar presente a una intensidad ligeramente más alta en las muestras de pacientes con enfermedad metastásica en relación con los otros 3 grupos de pacientes (datos no mostrados). Esta banda se escindió del gel, se digirió con tripsina y los péptidos resultantes se analizaron por LC-MS /MS. Los datos de espectrometría de masas identificaron 7 péptidos de contrapartida para la PCR con una secuencia de cobertura del 27,6%, y se confirmaron los datos iTRAQ.