Extracto
Antecedentes
El activador del plasminógeno uroquinasa (uPA) y su receptor (uPAR /CD87) son importantes reguladores de la degradación de la matriz extracelular y están involucrados en la migración celular y la invasión bajo condiciones fisiológicas y condiciones patológicas. El sistema uPA /uPAR ha sido de gran interés en la investigación del cáncer ya que está involucrado en el desarrollo de la mayoría de los fenotipos de cáncer invasivo y es un fuerte predictor de pobre supervivencia del paciente. Sin embargo, se sabe poco sobre el papel de uPA /uPAR en el cáncer de pulmón de células pequeñas (SCLC), el tipo más agresivo de cáncer de pulmón. Por lo tanto, se determinó si uPA y uPAR están involucrados en la generación del fenotipo de células SCLC resistentes a los medicamentos.
métodos y las conclusiones
Hemos examinado seis CEP líneas celulares humanas de marcadores de superficie de las células madre y cáncer putativo. Se utilizó la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS), la microscopía de fluorescencia y ensayos clonogénicos para demostrar la expresión de uPAR en una subpoblación de células derivadas de líneas celulares de SCLC primarios y metastásicos. Se utilizaron ensayos citotóxicos para determinar la sensibilidad de las células uPAR-positivas y negativas-uPAR a los agentes quimioterapéuticos. Los uPAR de células positivas en todas las líneas SCLC demostraron resistencia a múltiples fármacos, alta actividad clonogénico y co-expresión de CD44 y MDR1, marcadores de células madre del cáncer putativos.
Conclusiones
Estos datos sugieren que uPAR de células positivas pueden definir una población funcionalmente importantes de las células cancerosas en SCLC, que son resistentes a las quimioterapias tradicionales, y podrían servir como dianas críticos para intervenciones terapéuticas más eficaces en SCLC
Visto:. Gutova M, Najbauer J , Gevorgyan A, Metz MZ, Weng Y, Shih CC, et al. (2007) Identificación de células chemoresistant uPAR-positivas en el cáncer de pulmón de células pequeñas. PLoS ONE 2 (2): E243. doi: 10.1371 /journal.pone.0000243
Editor Académico: Christopher Arendt, Sanofi-Aventis, Estados Unidos de América
Recibido: Enero 15, 2007; Aceptado: 31 Enero 2007; Publicado: 28 Febrero 2007
Derechos de Autor © 2007 Gutova et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan.
Introducción
cáncer de pulmón de células pequeñas (SCLC) es el tipo más agresivo de cáncer de pulmón y tiene un mal pronóstico. Las metástasis se desarrollan rápidamente, principalmente a la médula ósea y el cerebro, y son por lo general presente en el momento del diagnóstico. En los pacientes no tratados, la supervivencia media es de dos meses a partir del inicio de los síntomas [1].
En varios tipos de tumores niveles de activador del plasminógeno uroquinasa (uPA) y su receptor uPAR (CD87) aumento se correlaciona fuertemente con mal pronóstico y el resultado clínico desfavorable [2], [3], [4], [5], [6]. uPA y uPAR son instrumentales en el control de la proteolisis extracelular y transmembrana de señalización asociada a la membrana, lo que afecta a la migración celular y la invasión en condiciones fisiológicas y patológicas [2], [7], [8], [9], [10]. uPAR sobre-expresión en células malignas resultados de la activación de varias vías oncogénicos, incluyendo MAPK, RTK, ERK2 y FAK [2], [7], [9]. mutaciones oncogénicas múltiples, incluyendo p53 en células de cáncer conducen a la expresión incontrolada de uPA /uPAR [11]. La inhibición de uPAR en un modelo de ratón de cáncer de pulmón de células no pequeñas y otros tumores inhibe el crecimiento tumoral, la invasión, la angiogénesis y la metástasis [12], [13], [14]. Los niveles elevados de uPAR están correlacionados con una mayor mortalidad en pacientes con células escamosas y el cáncer de pulmón de células no pequeñas [15], [16], sin embargo, poco se sabe sobre el papel de la expresión de uPA /uPAR en el CPCP.
Un estudio reciente de Alfano
et al
subraya la importancia de uPAR señalización en la prevención de la apoptosis por la resistencia de las células cancerosas a la anoikis (la apoptosis inducida por la pérdida de anclaje). expresión uPAR promueve la supervivencia celular mediante la activación de factor anti-apoptosis Bcl-xL transcripción a través de la MEK /ERK- y PI3K /Akt dependiente de [17]. Por lo tanto, la hipótesis de que la expresión de uPAR puede estar implicado en el desarrollo del cáncer de fenotipo resistente a los medicamentos en el CPCP.
Presentamos aquí la presencia de una población rara de uPAR de células positivas en líneas celulares de SCLC humanas que demuestran drogas significativa resistencia a los agentes quimioterapéuticos tradicionales, tales como 5-fluorouracilo (5-FU), cisplatino y etopósido. Las células uPAR-positivas expresan marcadores de células stem- y cáncer, incluyendo CD44 y MDR1. La identificación y detección de uPAR de células positivas en SCLC pueden proporcionar información valiosa sobre la biología del cáncer de pulmón humano y pueden establecer nuevos objetivos críticos para las terapias contra el cáncer más eficaces.
Métodos
La inmunotinción y análisis de citometría de flujo
primaria (pulmón) de carcinoma de pulmón de células pequeñas (SCLC) líneas celulares (H1688, H1417, H69AR), metastásico SCLC fueron obtenidas de la médula ósea (BM) metastásico SCLC (H211, H1882) y el cerebro (H250) las líneas celulares de pulmón primario humano y tejidos metastásicos (ATCC), cultivadas en RPMI 1640 modificado medio (ATCC, N: desde 30 hasta 2001) suplementado con 10% suero bovino fetal (FBS). La línea celular metastásico BM (H1882) se cultivó en medio Hites completa (D-MEM /F-12, N: 30-2006 suplementado con insulina 5 mg /ml, transferrina 10 mg /ml, selenito de sodio 30 nM, hidrocortisona 10 nM , β-estradiol 10 nM, L-glutamina 2 mM, HEPES 10 mM y FBS al 5%). Las células se cultivaron durante dos semanas y se analizaron por citometría de flujo usando los siguientes anticuerpos: CD59 (CBL467P), CD109 (CBL585P), CD62E (CBL180F) de Chemicon, CD87 (3936CJ) de American Diagnostica, CXCR4 (FAB170F) a partir de R & amp; D sistemas, CD24 (555.427), CD90 (555.596), CD38 (347.680), CD44 (555478), CD45 (555.482), CD13 (555.394), CD49b (555.498), CD29 (555.443), CD3 (30104X) de BD Pharmingen, ABCG2 /BCRP1 (10400) de Tecnologías de Células Madre, CD133 /2 (clon 293C3) y CD133 /1 (clon AC133) de Miltenyi Biotec, CD34 (347,660) de Becton Dickinson, CD105 (326-050) de Alexis, MNF116 (F0859 ), Cyt18 (F7212) del DACO, y CD166 (3 pies) de la RDI. Para el análisis FACS cada línea celular se separó por tripsinización y se re-suspendió en tampón de tinción (SB) (HBSS, Irvine Scientific, 9228) suplementado con 2% de FBS y HEPES 10 mM a una densidad de 5 x 10
6 células /ml. Cincuenta l (2,5 × 10
4 células) se añadió a cada pocillo de una placa de 96 pocillos en forma de v. Se añadieron anticuerpos (FITC o PE conjugado) en las concentraciones recomendadas por el fabricante (20 l /10
6 células). Los anticuerpos frente a CD133, CD34, CD44, CD87 y MDR1 han sido ajustada individualmente. Las placas de 96 pocillos se colocaron en hielo y las células se tiñeron con anticuerpos para 30 min en la oscuridad. Después de la tinción, /pocillo se añadieron 150 l de tampón de lavado (HBSS, suplementado con 15% de FBS y HEPES 10 mM) y las placas se centrifugaron a 500 ×
g
durante 5 min a 4 ° C. Los sedimentos celulares se resuspendieron en SB, suplementado con yoduro de propidio (PI) (1 mg /ml) para excluir las células no viables, seguido por análisis de citometría de flujo.
Cell tinción y Ordenando
líneas celulares de SCLC (H211, H69AR, H1417) se cultivaron en medio RPMI 1640 y 4 × 10
se recogieron 6 células y luego se resuspendieron en 800 l de SB, seguido por tinción con uPAR (CD87) FITC-conjugado anticuerpo como se describe anteriormente. uPAR de células positivas y negativas-uPAR fueron ordenados por FACS, seguido de cultivo en la "base" de los medios metilcelulosa (Stem Cell Technologies, 04100) durante 16 días a 37 ° C, 5% de CO
2.
Ensayo clonogénico de líneas celulares de SCLC
RPMI 1640 completo esta en medio MethoCult H4100 (40 ml) para alcanzar un volumen final de 100 ml. uPAR de células positivas y uPAR-negativos derivados de las líneas celulares de SCLC (H211, H69AR, H1417) se sembraron en medio MethoCult por triplicado que contienen 3 × 10
3, 1 × 10
3, o 1 × 10
2 células /ml. Las células se cultivaron a 37 ° C, 5% de CO
2 en un incubador humidificado durante 16 días. Las colonias se contaron usando un microscopio de campo claro invertida en 4 × magnificación.
Ensayo de citotoxicidad
Las células derivadas de tres líneas SCLC se inmunotiñeron y ordenados por análisis de citometría de flujo (como se describe más arriba). Las líneas celulares (H211, H69AR, H1417) se contaron y se colocaron en placas de 96 pocillos (4 × 10
3 células /pocillo, por triplicado) con concentraciones finales de las drogas 0, 3, 10, 100, 200 mg /ml . Después de incubación durante 72 horas, las células viables y muertas se contaron mediante el uso de ensayo de guayaba ViaCount, y sólo se incluyeron las células viables en el análisis de datos. El ensayo de guayaba ViaCount distingue entre células viables y no viables sobre la base de la permeabilidad diferencial de colorantes de unión al ADN en el reactivo ViaCount, y por lo tanto la fluorescencia de los colorantes permite la evaluación cuantitativa tanto de células viables y no viables en suspensión. Alternativamente, se aplicaron las células no clasificadas en placas de 48 pocillos (1 x 10
4 células /pocillo) y se trataron con cisplatino, etopósido y su combinación en concentraciones de 0, 3, 10, 100 mg /ml. Las densidades de siembra por unidad de área (mm
2) fueron los mismos para ambas placas 48 y 96 pocillos (densidad = 125 células /mm
2). Después de 72 horas de incubación, las células viables se tiñeron con anticuerpos uPAR-FITC y evaluados por citometría de flujo.
doble etiquetado para citometría de flujo
Las líneas celulares se tiñeron con CD44-PE y MDR1- PE, se lavaron y después se tiñeron con uPAR-FITC (1 × 10
5 células /1 g de anticuerpo). Iso-PE- tipo corresponde o se utilizaron anticuerpos conjugados con FITC como control. Las células teñidas se analizaron por citometría de flujo.
Resultados
Flujo Análisis de citometría de SCLC humano líneas celulares
Para identificar los fenotipos de SCLC más invasivos, que proyectará seis CEP líneas celulares humanas (H1688, H1417, H69AR derivan de sitio del tumor primario en el pulmón, H250 de metástasis en el cerebro y H211, H1882 de metástasis en la médula ósea) con un panel de anticuerpos para determinantes de la superficie de células tumorales, incluyendo uPAR, CD13, CD29, CD44 , CXCR4, CD105, CD109, CD166, y para los marcadores de células madre CD34, CD90, CD133, ABCG2 /BCRP1. CEP líneas celulares muestran fenotipos heterogéneos con respecto a los determinantes de la superficie del tumor. Las seis líneas celulares de SCLC fueron positivas para CD29 (20-99%), CD44 (8-98%), CD105 (3-34%), CD166 (85-98%), y negativo para CD90, y CXCR4. uPAR (CD87) fue el único antígeno de superficie celular expresado en una pequeña subpoblación de células (1-4%) en cada una de las seis líneas celulares de SCLC, cuando se analiza por FACS utilizando el anticuerpo anti-uPAR-FITC (Figura 1,
paneles inferiores
).
Flujo de análisis de citometría de uPAR expresión en líneas celulares derivadas de SCLC. (A, B, C A) Pulmón-derivados de líneas celulares de SCLC, (D, E) de la médula ósea metastásica y líneas de células cerebrales metastásicos (F). Todas las células se cultivaron en medio RPMI 1640, se tiñeron con anticuerpo uPAR-FITC y se analizaron por citometría de flujo (
paneles inferiores
). tinción de control se realizó utilizando conjugado con FITC, corresponde con el isotipo IgG de ratón (
paneles superiores
). Se detectó una pequeña población de células uPAR-positivas en todas las líneas celulares examinadas, y se indica como porcentaje de células viables gated-R1. Los resultados mostrados son representativos de tres experimentos independientes.
Las muestras de control teñidas con mismo isotipo IgG-FITC fueron negativos para la expresión de uPAR (Figura 1,
paneles superiores
). La presencia constante de una pequeña subpoblación uPAR-positivo de células en todas las escuelas primarias (de pulmón, la Figura 1,
paneles inferiores
A, B, C) y metastásico (médula ósea; Figura 1,
paneles inferiores
D, e, y el cerebro; F) CEP líneas celulares, a diferencia de otros marcadores, que variaba en abundancia, sugiere que las células uPAR-positivas pueden comprender una subpoblación funcionalmente única de las células
quimiorresistencia de uPAR. células positivas
la hipótesis de que la población de células que expresan uPAR puede ser resistente a los agentes quimioterapéuticos. Hemos realizado ensayos de citotoxicidad en tres líneas celulares seleccionadas utilizando no ordenados (a granel), así como las poblaciones de células uPAR-positivas y negativas-uPAR según. El aumento de las concentraciones de 5-fluorouracilo (5-FU) (10, 100, 200 mg /ml) se añadieron a estos cultivos de células y se incubaron durante 72 horas, seguido por recuento de ambas células viables y muertas. Los datos se normalizó a 100%, lo que significó el número de células uPAR-positivas y uPAR-negativas sin fármaco añadido. Un efecto de destrucción celular se detectó en las tres líneas celulares sin ordenar (H211, H69AR, H1417), donde el 40-80% de las células fueron asesinados por 5-FU (Figura 2A). Es importante destacar que, uPAR-positivas células clasificadas a partir de estas tres líneas celulares mostraron un aumento significativamente la resistencia a 5-FU, con sólo el 40-50% de las células que se mató en el caso de H211 y H1417 (Figura 2B). Aunque la línea celular H69AR también mostró matanza diferencial de uPAR de células positivas y uPAR-negativos (por ejemplo, 10 mg /ml 5-FU mató a 30% de las células uPAR-influjo positivo frente a 85% de las células uPAR-negativa), en alta concentración de 5-FU (200 mg /ml), el efecto letal para ambas poblaciones (H69AR) era el mismo (~ 100%). El análisis estadístico (ANOVA de 2 vías) de uPAR (+) y uPAR (-) conjuntos de datos revelaron diferencias significativas en la supervivencia de uPAR (+) y uPAR (-) de las células después del tratamiento con 5-FU (
P
= 0,0002, 0,0027, 0,0008 para H211, H69AR, H1417 células, respectivamente) (Figura 2B).
La citotoxicidad del 5-FU en poblaciones no clasificados y ordenados (uPAR-positivas y negativas-uPAR) deriva del CEP líneas celulares. (A) 1 × 10
4 células (H211, H69AR, H1417) se colocaron en pocillos de una placa de 48 pocillos por triplicado y se incubaron durante 72 hr en la presencia de concentraciones variables de 5-FU. (B) líneas celulares de SCLC se FACS ordenados después de la tinción con anticuerpos anti-uPAR y se sembraron a la misma densidad de siembra (4 × 10
3 /pocillo de placa de 96 pocillos) y se trató con 5-FU en 0, 10 , 100, 200 g /ml durante 72 horas. La supervivencia celular se evaluó después de añadir el reactivo de guayaba ViaCount y el recuento de células viables y muertas. Sólo se incluyeron células viables en el análisis de datos, y 100% de viabilidad fue definido como el número de células viables cultivadas en ausencia de 5-FU. El análisis estadístico (ANOVA de 2 vías) de uPAR (+) y uPAR (-) conjuntos de datos revelaron diferencias significativas entre viabilidad de uPAR (+) y uPAR (-) células (
P
= 0.0002, 0.0027, 0.0008 para H211, H69AR, H1417 células, respectivamente). Los puntos de datos representan las medias ± desviación estándar de tres experimentos independientes.
Del mismo modo investigó el efecto citotóxico de cisplatino y etopósido, fármacos utilizados actualmente para el tratamiento de pacientes con SCLC. Las líneas de células no ordenados SCLC (H211, H69AR, H1417) fueron utilizadas en ensayos citotóxicos con cisplatino y etopósido en
in vitro
estudios (3, 10, 100 mg /ml) (Figura 3A). 60-80% de las células fueron asesinados por el cisplatino y etopósido (usado por separado o en combinación) en líneas no ordenados (Figura 3A). Una vez más, las células clasificadas uPAR-positivos de estas tres líneas celulares mostraron un aumento significativamente la resistencia al cisplatino y etopósido, con sólo el 30-50% de las células se mató, en comparación con 60 a 80% de destrucción de las células clasificadas uPAR-negativos (datos no mostrado). Estos datos sugieren que la subpoblación de células uPAR-positivas en SCLC puede ser responsable de la quimiorresistencia a 5-FU y otros fármacos quimioterapéuticos tradicionales, tales como cisplatino y etopósido.
efecto citotóxico de cisplatino y etopósido en células no ordenados derivan del CEP líneas celulares. (A) líneas celulares de SCLC (no clasificado) tratados con cisplatino, etopósido a concentraciones de 0, 3, 10, 100 mg /ml o sus combinaciones (cisplatino y etopósido a concentraciones finales de 10 mg /ml, 100 mg /ml) durante 72 h. La supervivencia celular se evaluó después de la adición del reactivo de guayaba ViaCount y el recuento de los dos supervivientes y muertos células utilizando software de guayaba ViaCount. Los datos se normalizaron como 100% de viabilidad de las células cultivadas en ausencia de fármacos. Las barras de error indican la desviación estándar de cultivos por triplicado (resultados de tres experimentos independientes). (B) Después de cisplatino y etopósido tratamiento, las células adherentes viables se separaron mediante tratamiento con tripsina y se tiñeron con anticuerpos y porcentaje de células uPAR-positivas se determinó mediante análisis FACS contra-uPAR-FITC. Muestra con anticuerpo de control de isotipo IgG de ratón se utiliza para establecer el valor de la puerta de FACS, que se aplicó a todas las muestras teñidas con uPAR-FITC.
Con el fin de confirmar que la expresión de uPAR confiere resistencia a tumor cisplatino y etopósido, se realizaron ensayos de citotoxicidad en las mismas líneas celulares de SCLC sin ordenar y miraron para el enriquecimiento de uPAR de células positivas en la población de células supervivientes. En efecto, hemos detectado un enriquecimiento significativo de uPAR de células positivas (40 a 70%) entre las células supervivientes, en comparación con sólo el 1-5% de las células uPAR-positivas en los cultivos de control cultivados en ausencia de estos medicamentos (Figura 3B). Estos datos apoyan la hipótesis de que la expresión de uPAR confiere quimiorresistencia en SCLC, y que las células uPAR-positivas deben ser considerados como una nueva diana para las terapias más eficaces.
Actividad clonogénico de uPAR de células positivas
Para demostrar que uPAR de células positivas poseen un alto potencial clonogénico y auto-renovación, nos lo solucionaron pulmonar primaria (H1417, H69AR), médula ósea metastásica líneas (H211) de células por FACS usando anticuerpos monoclonales anti-uPAR-FITC-conjugado. Después de la clasificación (97% de pureza), uPAR de células positivas y negativas-uPAR se sembraron en medios metilcelulosa a densidades de 3000, 1000, 100 células /pocillo (placa de 6 pocillos). uPAR de células positivas a partir de estas líneas SCLC primarios y metastásicos forman múltiples colonias distintas (Figura 4A). Se estimó que aproximadamente el ~ 10% de las células uPAR-positivas (pulmón, H1417, médula ósea, H211) colonias formadas (Figura 4B). Por el contrario, las células uPAR-negativas del pulmón primario células (H1417) no forman colonias, y desde la médula ósea metastásica (H211) y pulmón (H69AR) formado sólo pocas colonias (Figura 4B). Después se permitió uPAR de células positivas para formar colonias de 16 días en cultivo de metilcelulosa, se aislaron 20 colonias y se analizaron para la expresión de uPAR por citometría de flujo. Encontramos tanto uPAR de células positivas y uPAR-negativos en cada colonia analizados (H1417), con 30-50% de células que muestran positividad uPAR dentro de cada colonia, después de 18 días de incubación (Figura 4C). Esto sugiere que las células uPAR-positivas pueden dar lugar tanto a uPAR de células positivas y uPAR-negativos. uPAR expresión también se analizó en las colonias derivadas de líneas celulares H211 y H69AR. En todas las colonias derivadas de células uPAR-positivas clasificadas detectamos tanto uPAR de células positivas y uPAR-negativos (~ 50% cada uno después de 16 días en cultivo de metilcelulosa) (datos no mostrados). Análisis de las colonias derivadas de células uPAR-negativos (por ejemplo, la línea celular H211) reveló una pequeña proporción de uPAR de células positivas en las colonias (& lt; 1%). La razón de esto podría ser posible contaminación durante la clasificación. Alternativamente, las células de cáncer de uPAR-negativos pueden adquirir uPAR expresión en determinadas condiciones de cultivo. Varias colonias uPAR-positivas han sido recogidos y cultivados adicionalmente durante 2 semanas en medio de cultivo RPMI, seguido de separación FACS y ensayo clonogénico. Curiosamente, se detectó una proporción similar de uPAR de células positivas y uPAR-negativos (1-5% y 95-99%, respectivamente) en estos cultivos, lo que sugiere que las colonias de uPAR-positivas pueden recapitular el fenotipo de la célula parental. En los cultivos derivados a partir de colonias uPAR-negativos en el otro lado, se detectaron niveles más bajos (0,1 a 0,8%) de uPAR de células positivas, y pobre crecimiento total (datos no mostrados).
actividad de Colonia de formación uPAR de células positivas y negativas-uPAR derivados de líneas celulares de SCLC. (A) H1417- derivado, células clasificadas uPAR-positivas formadas múltiples colonias en medios metilcelulosa, mientras que las células uPAR-negativos de los mismos tipos muestran poca o ninguna actividad clonogénico. (B) Representación gráfica de la capacidad de formación de colonias de células uPAR-positivas y negativas-uPAR a diferentes densidades de galvanoplastia 3000, 1000, 100 células /placa de 6 pocillos (H1417, H69AR, H211). (C) Distribución de uPAR de células positivas en las colonias derivadas de células positivas uPAR según cultivadas en medio de metilcelulosa. Se analizaron un total de 20 colonias de células de la línea celular H1417.
Co-expresión de uPAR con CD44 y MDR1
Además, la hipótesis de que si uPAR de células positivas representan las drogas población resistente y clonogénico en SCLC, que puede expresar CD44 y MDR1 (ABCB1) genes, que están involucrados en el desarrollo del fenotipo de células madre de cáncer y la resistencia a múltiples fármacos. Para caracterizar mejor la población uPAR-positivas, hemos realizado experimentos de doble etiquetado con uPAR-FITC y CD44-PE, así como MDR1-PE sobre las líneas celulares H211, H69AR, H1417. uPAR de células positivas derivadas de la CEP líneas celulares (H211, H69AR, H1417) expresan CD44 en un 50-80%, mientras que MDR1 en el 10-40% de las células (Figura 5A). Expresión de los marcadores anteriores también se confirmó utilizando microscopía de fluorescencia (Figura 5B). Las células uPAR-negativas también expresaron CD44 (~ 70% de las células H211 y H69AR; ~ 10% de H1417) y MDR1 (1-10% para todas las líneas celulares) (figura 5A.). Estos datos sugieren un enriquecimiento de la expresión de CD44 en H1417 células, mientras MDR-1 mostró una mayor expresión de uPAR de células positivas derivadas de las tres líneas celulares en comparación con las células uPAR-negativos (Fig. 5A).
Expresión de CD44 y MDR1 en uPAR de células positivas y uPAR-negativos. (A) Análisis FACS de, H211, H69AR y líneas celulares de SCLC H1417 doble etiquetado con uPAR-FITC y CD44-PE, PE-MDR1. Los porcentajes de células que expresan CD44 y MDR1 se calcularon por separado para uPAR de células positivas y uPAR-negativos. (B) análisis microscópico fluorescente de células de doble marcado y FACS ordenados. Ejemplos de uPAR-FITC /CD44-PE doble etiquetado (a, b, c) y uPAR-FITC /MDR1-PE doble etiquetado (d, e, f). (Bf-recuadro) línea celular H1417 teñidas con IgG de ratón de isotipo de control-PE (rojo), control de isotipo-FITC (verde) y DAPI (azul).
Discusión
La principal hallazgo de este estudio es la identificación de una subpoblación de células raro uPAR-positivas en líneas celulares de SCLC derivados de pulmón y metástasis a la médula ósea y el cerebro. Está bien documentado que uPAR sobreexpresión en diversos tumores malignos está fuertemente correlacionada con fenotipos de cáncer más invasivos y mal pronóstico [2], [4], [15], [18].
Varios estudios sugieren que la presencia de una población rara de células en tumores sólidos y leucemia que poseen la capacidad para regenerar y propagar el tumor [19], [20], [21], [22], [23]. Estas células también pueden ser responsables de mantener el potencial maligno del tumor y servir como la causa subyacente de la recurrencia del tumor [24], [25]. las estrategias de tratamiento actuales pueden fallar para orientar la subpoblación resistente a los medicamentos, y podría explicar la respuesta terapéutica inicial de la mayoría de las células tumorales, que es seguido por una recurrencia después
.
Hemos encontrado que uPAR de células positivas eran más resistentes al tratamiento con el agente citotóxico 5-FU, mientras que las células uPAR-negativos murieron mucho más eficiente. El efecto citotóxico del 5-FU se ha atribuido a la incorporación errónea de fluoronucleotides en ARN y ADN y a la inhibición del nucleótido sintético enzima timidilato sintasa, que principalmente se dirige a las células en división rápida [26]. También se investigó el cisplatino y etopósido, fármacos quimioterapéuticos que se utilizan actualmente en el tratamiento de pacientes con CPCP. Es importante destacar que, el cultivo de las células de SCLC en presencia de cisplatino y etopósido resultó en la destrucción selectiva de las células uPAR-negativas con el enriquecimiento concomitante de la población celular uPAR-positivas.
uPAR de células positivas aisladas de tres líneas SCLC fueron capaces a proliferar y formar múltiples colonias en medios metilcelulosa, mientras que las células uPAR-negativas muestran poco o ningún potencial clonogénico. También puso de manifiesto la co-expresión de uPAR con CD44 y MDR1, lo que puede explicar la asociación entre enfermedad maligna avanzada y la resistencia a los medicamentos. Varios estudios han investigado el papel individual de uPAR, CD44 y MDR1 en diversos tumores malignos [5], [13], [14], [17], [19], 24,27,28,29,30,31,32, Sin embargo, a nuestro entender este es el primer estudio que proporciona evidencia para la expresión de CD44 y MDR1 en uPAR de células positivas en SCLC. También se detectó la expresión de CD44 y MDR1 en células uPAR-negativas, las implicaciones funcionales de lo que queda por determinar.
ATP vinculante cassette de (ABC) transportadores de fármacos han demostrado que protege las células madre del cáncer de los agentes quimioterapéuticos 33 . Un transportador principal de la familia ABC es P-glicoproteína, el producto del gen MDR1, que es producida por las células madre hematopoyéticas (HSC) 32. el gen MDR1 se convierte en el regulado en HSC sobre la diferenciación celular 32. P-glicoproteína y CD44 se han caracterizado y se sabe que son determinantes de la resistencia a múltiples fármacos en células de cáncer, que está mediada por interacciones físicas y genéticas entre CD44 y MDR1 30. la activación de CD44 produce a través de heterodimerización de CD44 con los receptores del factor de crecimiento (por ejemplo, EGFR, FGFR, HGFR, VEGFR, TGF-beta R), que conduce a la activación de la MAP quinasa y vías de señalización de PI3K-AKT estimulación 34. CD44 por su hialuronano ligando hasta regula la expresión de uPA y uPAR mRNA, a través de la activación de MAPK-Ras vía , mientras que la activación de PI3K estimula la expresión de MDR1 y la función 34. PI3K también actúa como un bucle de retroalimentación positiva para estimular la producción de hialuronano, que activa CD44 35,36. La señalización CD44-MAPK-PI3K conduce a la expresión incontrolada de uPA /uPAR y MDR1, que promueve fenotipo celular de cáncer resistente invasiva y a múltiples fármacos. Además de la señalización de CD44-MAPK-PI3K, uPAR sobre-expresión puede inducir la supervivencia celular mediante la activación del factor anti-apoptosis Bcl-xL transcripción 17.
Los estudios futuros en modelos animales abordarán si el uPAR-positivas células son responsables de crecimiento del tumor primario y la formación de metástasis a distancia en SCLC. En resumen, hemos identificado la subpoblación uPAR-positivo de las células de SCLC que poseen alta resistencia a múltiples fármacos y la actividad clonogénica, mientras que las células uPAR-negativas son sensibles a los fármacos quimioterapéuticos y mostrar poca o ninguna actividad clonogénico. También proporcionamos evidencia de asociación de uPAR, CD44 y MDR1 expresión en células de SCLC. La investigación adicional se justifica para determinar si la orientación de esta población celular será fundamental para el éxito terapéutico.
Reconocimientos
Agradecemos al Dr. Kristine A. Justus para la edición del manuscrito experto, Lucy Brown por ayudar con las mediciones de citometría de flujo y Sofía Loera de asistencia con técnicas de inmunohistoquímica. Agradecemos al Dr. Kemp Kernstine para proporcionar cisplatino y etopósido. Este trabajo está dedicado a la memoria amorosa de Hrach Shahmanyan.