Extracto
El cáncer colorrectal (CCR) es la principal causa de muerte por cáncer en todo el mundo. inestabilidad cromosómica (CIN) es una importante fuerza impulsora de microsatélites estables (MSS) CCR esporádico. tumores de CIN se caracterizan por un gran número de aberraciones cromosómicas somáticas número de copias (SCNA) que afectan con frecuencia oncogenes y genes supresores de tumores. El objetivo principal de este trabajo fue identificar nuevos genes candidatos conductor CRC afectados por el recurrente y SCNA focal. hibridación comparativa del genoma (CGH) matrices de todo el genoma de alta resolución se utiliza para comparar el ADN tumoral y normal que los 53 casos de CCR esporádicos. Contexto corregida la aberración común (COCA) de análisis y algoritmos personalizados identificaron 64 supresiones y 32 aumentos de las regiones focales mínimas comunes (FMCR) a alta frecuencia (& gt; 10%). La comparación de estas FMCR con perfiles genómicos publicados de CRC reveló solapamiento común (42,2% de las deleciones y 34,4% de las ganancias de copia). Pathway análisis mostró que la apoptosis y la señalización de p53 vías eran comúnmente afectados por borrada FMCR, y MAPK y las vías del canal de potasio por las ganancias de FMCR. genes supresores de tumores candidato en FMCR borrado incluyen
RASSF3
,
IFNAR1
,
IFNAR2 y NFKBIA
y candidatos oncogenes en FMCR ganado incluido
PRDM16
,
TNS1, RPA3 y KCNMA1
. En conclusión, este estudio confirma algunas aberraciones previamente identificados en MSS CRC y proporciona
in silico
pruebas para algunos nuevos genes candidato conductor
Visto:. Burghel GJ, WY Lin, Whitehouse H, I Brock , Hammond D, Bury J, et al. (2013) La identificación de genes candidatos conductor en común focal aberraciones cromosómicas de microsatélites Estable del cáncer colorrectal. PLoS ONE 8 (12): e83859. doi: 10.1371 /journal.pone.0083859
Editor: Amanda Ewart Toland, Ohio State University Medical Center, Estados Unidos de América
Recibido: 26 Julio, 2013; Aceptado: 8 de noviembre de 2013; Publicado: 18 de diciembre 2013
Este es un artículo de acceso abierto, libre de todos los derechos de autor, y puede ser reproducido libremente, distribuir, transmitir, modificar, construir, o de otra forma utilizado por cualquier persona para cualquier propósito legal. El trabajo está disponible bajo la advocación de dominio público Creative Commons CC0
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por la Universidad de Sheffield (Facultad de Medicina Odontología y Salud) beca de doctorado, e Investigación y Premio a la innovación, y una beca de Yorkshire Cancer Research del PhD (S003PHD). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer colorrectal (CCR) es el tercer cáncer más común en hombres y la segunda en las mujeres [1]. Más de 1 millón de nuevos casos de CCR son diagnosticados anualmente y 600.000 muertes relacionadas ~ fueron estimadas en todo el mundo en el año 2008, por lo que el CRC 3
er mayor causa de muerte relacionada con cáncer en ambos sexos [1,2]. inestabilidad cromosómica (CIN) es la forma más común de la inestabilidad genómica en CRC y se asocia con 65-85% de los casos de CCR esporádicos [3-6]. Los tumores que se desarrollan a través de la vía de CIN se caracterizan por numérica frecuente y /o ganancias estructurales y pérdidas de segmentos cromosómicos o cromosomas enteros a un ritmo aumentado de manera significativa en comparación con las células normales [7]. se conocen tumores de CIN de estar asociado con
TP53
mutaciones y bajos niveles de inestabilidad de microsatélites (MSI) [8,9]. CIN se piensa para impulsar el desarrollo de CRC a través copia aumento de número de oncogenes como
MYC
y la supresión de los genes supresores de tumores tales como
SMAD4
y
TP53
[3,9 -13]. Esta opinión es apoyada por la asociación observada entre las anomalías del número de copias de genes relacionados con el cáncer, y sus niveles de expresión en muestras de CRC [14-16].
A pesar de que la mayor parte de las aberraciones cromosómicas surgen de una manera aleatoria, algunos son recurrentes y se encuentran comúnmente en otros tipos de cáncer, además de CRC [13,16,17]. El aumento de la frecuencia de algunas aberraciones número de copias somáticas (SCNA) es probablemente un resultado de la selección clonal durante el desarrollo del tumor. Recurrente SCNA proporcionar el tumor con una forma de dirigir genes supresores de tumores y oncogenes para adquirir una o más de las características distintivas de cáncer y conducir la tumorigénesis [13]. Varias anomalías cromosómicas comunes se han identificado a través de técnicas citogenéticas convencionales, tales como hibridación genómica comparativa metafase (CGH) y la hibridación fluorescente in situ (FISH) [18-20]. Estos defectos cromosómicos incluyen las ganancias de 8q, 13q y 20q y pérdidas de 18q, 5q, 8p, 17q [18,20]. Sin embargo, debido a su gran tamaño, la identificación de genes específicos del controlador dentro de estas regiones es problemática [16,17,21].
El uso de CGH-array permite a base de la adquisición de información de todo el genoma con alta resolución (hasta unas pocas kilobases) y la identificación de las regiones focales y mínimos comunes (FMCR) [16,17]. FMCR son generalmente más pequeños que 3Mb de tamaño y por lo tanto contiene un número relativamente pequeño de genes, por lo tanto simplificar la identificación de genes de controladores [16,17]. Recientemente, FMCR han conducido a la identificación de nuevos genes de cáncer de controladores con potencial valor terapéutico y pronóstico en varios tipos de cáncer, incluyendo CRC [16,17,22-27]. El objetivo principal de este trabajo es la aplicación de una serie de métodos analíticos basados en los datos CGH basadas en matrices de alta resolución para un conjunto de esporádica de microsatélites estables tumores (MSS) CRC tanto a replicar observaciones de aberraciones identificados en estudios previos e identificar nuevo candidato CRC genes conductor.
Materiales y Métodos
Ética Declaración
Los sujetos dieron su consentimiento informado por escrito para los datos y la recogida de muestras y el estudio fue aprobado por el Comité de Ética de Investigación de South Yorkshire (Reino Unido) (09 /H1310 /54).
Los sujetos de estudio y muestras de ADN
Las muestras de tejido se obtuvieron de 53 pacientes con tumores colorrectales del SMS. Treinta y ocho de ellos fueron sometidos a cirugía por un tumor colorrectal primario en el Sheffield Royal Hallamshire y los hospitales generales (Sheffield Norte de marzo de 2001 - junio de 2005). Quince de las muestras de tejido de casos eran de banco de tejidos Sheffield Hospital Royal Hallamshire (HTA Licencia 12182). Antes de la inclusión en el estudio, el estado de tumor de todas las muestras fue confirmado por un patólogo (JB). Todas las muestras de tejidos tumorales fueron micro-diseccionado antes de la extracción de ADN, de modo que el material extraído contenía al menos 80% de células cancerosas. Las muestras de ADN a partir de sangre periférica o en los tejidos normales del colon también estaban disponibles de todos los pacientes reclutados. Los datos adicionales que incluyen; sexo, localización del tumor, grado de diferenciación, el estadio y la edad de diagnóstico estaban disponibles a partir de los registros de patología (Materiales y Métodos S1). ADN genómico fue extraído de tumor, tejido normal y muestras de sangre periférica usando el QIAamp DNA Minikit, (Quiagen, Hilden, Alemania).
MSI estado
El estado de MSI de todo el ADN del tumor muestras se determinó utilizando el kit de sistema de análisis de MSI, v1.2 (Promega, Madison, EE.UU.), basada en los marcadores de microsatélites mononucleótido BAT-25, BAT-26, NR-21, NR-24 y MONO-27. Los productos de PCR se separaron por electroforesis capilar utilizando un ABI PRISM
TM 3730 Analizador de ADN y se analizaron usando software v4.0 GeneMapper (Applied Biosystems, Warrington, Reino Unido). Las muestras sin ningún marcador inestables se clasificaron como MSS [28]. El kit de análisis de MSI también incluye 2 marcadores penta-nucleótidos altamente polimórficos que se utilizaron para comprobar la identidad de la muestra.
Secuenciación y análisis de la mutación
Para el análisis de la mutación de
BRAF
exón 15 ,
KRAS
exón 2,
APC
región de la mutación grupo (MCR),
TP53
exones 4-9 y
PIK3CA
exones 9 y 12, el exones respectivos se amplificaron PCR (secuencias de los cebadores enumerados en Materiales y Métodos S1), y se secuenciaron usando PRISM
TM BigDye Terminator v3.1 prototcol estándar (Applied Biosystems). Los datos de secuencia se analizaron usando el software STADEN [29] y las mutaciones se confirmaron por comparación con la secuencia de referencia NCBI. números de acceso se proporcionan en Materiales y Métodos S1.
aCGH perfiles
Agilent todo el genoma CGH arrays 4x44K (Diseño ID 014950) y 4x180K (Diseño ID 022060) se aplicaron en 6 y 47 muestras, respectivamente (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EE.UU.). Las matrices de sondas de oligonucleótidos que contenían 60-mer de 42.494 (44K) y 170.334 (180K) distintas localizaciones cromosómicas con una separación media de la sonda de 43kb (44K) y 13kb (180K). Los análisis se realizaron según el protocolo v6.0 CGH basada en matrices de oligonucleótidos de Agilent. Evaluación de la calidad de las matrices se basó en la relación log derivado de propagación (DLRS), intensidad de la señal y la reproducibilidad, ruido de fondo, la colocación de red de rejilla y las demás sondas presentados por el software de extracción de características Agilent (v 10.5.1.1) como 11 métricas de control de calidad bien definidos ( microarrays información de acceso a datos:. GSE 418413)
array CGH análisis de datos
el análisis aCGH se realizó utilizando el software de banco de trabajo genómico de Agilent (v 5.0.14). SCNA se detectaron utilizando el algoritmo de puntuación ponderada de la calidad de intervalo, también conocido como método de detección de aberraciones 2 (ADM2) algoritmo (Umbral: 6.0) con la centralización defecto y difusa de corrección cero. filtros de acceso predeterminados y la aberración se aplicaron y se combinaron las réplicas de la sonda dentro de la matriz. Las muestras de tumor se consideraron cromosómicamente inestable si se identificaron una o más aberraciones significativas [8]. Recurrente SCNA se identificaron utilizando el contexto corrige la aberración común algoritmo (COCA) con un alcance cromosómica, un valor de p de 0,05 y el umbral de solapamiento de 9,0.
FMCR se define como las regiones que son menos de 3Mb en tamaño y definido por al menos 2 focal independiente o SCNA superposición (considerado como eventos de tamaño de la determinación (SDE)). Una frecuencia mínima de & gt; 10% de los casos y una puntuación de COCA ~ También se requiere 2.0 (valor de p = 0,01).
Validación técnica
Con el fin de validar los resultados aCGH, se realizaron 2 experimentos por duplicado utilizando 44K y 180K matrices. Por otra parte, 3 FMCR (2 suprimirá y se amplificó 1) se confirmó por el uso del número de copias de PCR cuantitativa.
se utilizó el análisis de TP53
LOH en base a los resultados de la secuenciación para confirmar las eliminaciones 17p.
Resultados
CIN, MSI y la mutación de estado
Las 53 muestras seleccionadas para este estudio fueron MSS. El análisis de los
APC, TP53
,
KRAS
,
BRAF
y
PIK3CA mutaciones
indicaron que la frecuencia y el patrón de estas mutaciones de acuerdo con el publicado anteriormente datos sobre MSS CCR esporádico [30-33] y (http://www-p53.iarc.fr/index.html). De los 53 casos de CCR analizadas con éxito por CGH array, 5 tenían sin aberraciones significativas y fueron considerados cromosómicamente estable. El algoritmo ADM2 no llamó a las aberraciones de 2 muestras y una muestra adicional falló en & gt; 4 métricas de control de calidad. Un resumen de las características moleculares de las 53 muestras se presenta en la Tabla S1 S1 en el archivo.
Distribución de SCNA Común
Un total de 3097 SCNA se identificaron en los 45 casos cromosómicamente inestables. El número de SCNA por muestra varió de 1-411, con una mediana de 43 por muestra. SCNA variaron en tamaño de 0.014Mb-147.48Mb (mediana: 2.29MB). Una visión general de la estructura y frecuencias de estas SCNA se presenta en la Figura 1. Las ganancias más comunes fueron en regiones cromosómicas 20q (73,3%, n = 33), 13 (57,8%, n = 26), 8q (53,3%, n = 24), 7 (51,1%, n = 23) y X (51,1%, n = 23) y las eliminaciones más comunes se realizaron en regiones cromosómicas 18 (55,6%, n = 25), 8p (51,1%, n = 23) y 17p (51,1%, n = 23). Algunas de estas regiones contienen genes clave del controlador de la CRC, como
MYC
en 8q,
SMAD4
en 18q y
TP53 Restaurant at 17p. Un resumen de la SCNA para cada muestra se presenta en la Tabla S1 en el archivo S1 y Figura 2.
Los datos del formato de matriz de 180K se muestran. El rojo representa las ganancias y el verde representa supresiones. El eje Y refleja la frecuencia.
Representación de los CNA identificó en 40 casos cromosómicamente inestables analizó utilizando la plataforma de 180K. El rojo representa la ganancia y el verde representa la eliminación. Las líneas discontinuas marcan centrómeros. características moleculares y clínicas en orden de arriba;
PIK3CA
,
APC
, TP53, KRAS y BRAF estado de mutación (azul y el blanco representa mutantes y WT, respectivamente), CIMP (rojo, naranja y verde representan CIMP-H, CIMP-L y CIMP-N, respectivamente), el sexo del paciente (rosa y gris representan femenino y masculino, respectivamente) y la localización del tumor (amarillo y cian representan proximal y distal, respectivamente).
análisis de la aberración Común y FMCR
Fuera del 3097 SCNA identificado en las 45 muestras cromosómicamente inestables, 1689 aberraciones fueron focales (& lt; 3.0MB) que varían en tamaño desde 0.014Mb hasta 3.00MB (mediana: 0.71Mb). Las aberraciones focales consistieron de 746 aumentos de copia con un intervalo de tamaño de 0.014Mb-2.99MB (mediana: 0.92Mb) y 943 eliminaciones, con un intervalo de tamaño de 0.025Mb-3,00 Mb (mediana: 0.58MB). Para identificar análisis FMCR, COCA combinado con las definiciones descritas en los métodos fueron aplicados en la salida ADM-2 y este análisis resultó en la identificación de 64 deleciones y 32 ganancias que satisfacen los criterios FMCR. El 64 suprime FMCR varió de tamaño entre 0.03-2.64Mb (mediana: 0.42Mb) y contenía un total de 714 genes conocidos con un rango de 0-69 genes suprimidos por región (mediana: 4 genes) (Tabla S2 S1 en Archivo) . El ganado 32 FMCR osciló entre 0.03-1.96Mb de tamaño (mediana: 0.83Mb) y contenía un total de 288 genes conocidos con un rango de 0-34 genes obtenida por cada región (mediana: 3 genes) (Tabla S1 S3 en Archivo) .
Identificación de genes conocidos de cáncer en el FMCR
Para identificar los genes del cáncer conocidos dentro de la eliminan y ganaron FMCR, las listas de genes FMCR se compararon con los dos genes lista completa del proyecto de censo gen del cáncer ( http://cancer.sanger.ac.uk/cancergenome/projects/census/~~number=plural, consultada en junio de 2013), y el CRC y el cáncer de mama genes controladores identificados en un estudio de alto rendimiento de re-secuenciación reciente [34]. Este análisis indicó la presencia de 27 "genes del cáncer", ubicado dentro de la FMCR borrado (~ 3,8% del número total de genes suprimidos; Tabla S2 en Archivo S1) y 11 "genes del cáncer" en el FMCR ganado (~ 3,8% de la número total de genes obtenidos;. Tabla S1 S3 en archivo)
La aparición de un gen del cáncer dentro de un FMCR no implica necesariamente que está actuando como un gen controlador. Para algunos "genes del cáncer", el tipo de FMCR (suprimido o amplificados) no era compatible con la función de genes conocidos, siendo un ejemplo la supresión del oncogén conocido
ANR
. Sin embargo, la función de los genes y el tipo de la FMCR a menudo eran consistentes con las expectativas, incluyendo ejemplos de eliminaciones
MAP2K4
y
CDKN2C gratis (Tabla S2 en Archivo S1) y la ganancia de
FGFR1 gratis (Tabla S3 en archivo S1). Tal vez, lo más importante, la clásica
SMAD4
eliminación supresor de tumores y
MYC
ganancia oncogénico fueron tanto observarse en un plazo borrada y ganado FMCR respectivamente. La frecuencia de ambos
SMAD4
supresiones y
MYC
ganancias en los 45 casos cromosómicamente inestables fue alta en ~ 53% (cuadros S2 & amp; S3 en Archivo S1).
la comparación con los datos publicados SCNA
con el fin de validación cruzada de nuestros resultados con los datos publicados, se comparó la FMCR a aberraciones cromosómicas comunes de menos de 3Mb identificado en cuatro estudios recientes CRC [13,16,22,35] . El total de las aberraciones focales identificados en estos estudios fue de 187 aumentos y 189 eliminaciones. Entre los 4 estudios publicados, sólo había 10 deleciones superpuestas focales (5,3%) y 29 aumentos focales superpuestos (15,5%). Una mayor proporción de la FMCR en nuestro estudio se superponen las regiones publicados. En total, 27 de los 64 suprime nuestra FMCR (42,2%) y 11 de nuestra ganaron 32 FMCR (34,4%) se superponen supresiones focales y las ganancias en los 4 estudios publicados.
Un estudio SCNA grande se llevó a cabo recientemente en el 26 diferentes tipos de cáncer, incluyendo CRC [17]. El estudio identificó una lista de las 20 deleciones somáticas más comunes y ganancias a través de los tipos de cáncer analizadas. Por otra parte, un gen candidato conductor también fue seleccionada para cada una de la SCNA común. Una comparación entre nuestra FMCR y las regiones más comunes en el estudio Beroukhim et al reveló una superposición con 5 de las zonas de deleción (25% del total) y 3 de las áreas de ganancia (15% del total). Todos los genes candidatos identificados por Beroukhim y colegas en su estudio fueron contenidos dentro de las áreas de solapamiento de nuestro FMCR.
Pathway análisis
Con el fin de buscar cualquier patrón o vías específicas afectadas por los genes dentro del borrado o ganado FMCR, la base de datos para anotación, visualización, integrada Discovery se utilizó (DAVID) v6.7 (http://david.abcc.ncifcrf.gov/) [36]. DAVID realiza el análisis de enriquecimiento (en base a las anotaciones biológicas de los genes diana) para identificar cualquier vías biológicas que son significativamente estadísticamente más representadas en la lista de genes analizados [36]. Para el FMCR eliminado, la vía más enriquecido relacionada con el cáncer era apoptosis (p = 0,014) (Figura S1) con 10 genes de apoptosis se produce dentro del FMCR eliminado. Siete de estos genes (
CASP3
,
CASP8
,
CASP10
,
NFKBIA
,
capn1
,
BAD
,
TNF
y
TNFRSF1A
) tienen un rol pro-apoptóticos y 3 (
PIK3R5, PIK3R2 y CFLAR
) son anti-apoptótica. Además, la vía de señalización de p53 se enriqueció en las regiones suprimidas (P = 0,079) con 5 genes afectados (Figura S2);
CCNB1
,
GADD45G
,
SERPINE1
,
SESN2
y
SFN
, todos los cuales han reportado funciones anti-supervivencia.
Por otro lado, la vía de señalización MAPK oncogénico fue la vía más sobrerrepresentados en el FMCR ganado (P = 0,032) con 9 genes afectados (Figura S3). Siete de estos genes (
CACNA1H
,
FGF23
,
FGF6
,
FGFR1
,
MAPKAPK2
,
ELK4
y
MYC
) se sabe que tienen promotora del crecimiento y las funciones de supervivencia, mientras que los otros 2 (
DUSP8 y DUSP2
) tienen funciones anti-supervivencia.
relaciones Gene entre también se realizó un análisis (GRAIL) Loci Implicado (http://www.broadinstitute.org/mpg/grail/) [37] para buscar las relaciones funcionales entre las regiones genómicas. La apoptosis términos, la apoptosis y la caspasa se encuentran entre los más enriquecido significativamente entre los FMCR eliminado. Para las ganancias, los canales de conductancia de potasio y las vías hedgehog fueron algunos de los términos más enriquecido significativamente.
La identificación de genes candidatos dentro del controlador candidato FMCR
Con el fin de identificar nuevos genes candidatos conductor CRC, se hicieron más estrictos los criterios FMCR. Candidato FMCR fueron seleccionados si se definieron por 4 SDE, ocurrir en ≥20% de los casos y tienen un máximo de 12 genes dentro de 3.0MB de tamaño. Estas definiciones FMCR más estrictas identificaron 11 supresiones (Tabla 1) y 8 ganancias (Tabla 2). De los 28 genes dentro de las áreas eliminadas, 10 (35,7%) fueron identificados como genes conductor candidato con funciones supresoras de tumores conocidos o potenciales y fuera de los 31 genes dentro de las regiones ganadas, 6 (19,4%) eran candidatos con conocidos o potenciales función oncogénica (Tablas 1 y 2; véase la discusión). genes supresores de tumores candidato en FMCR borrado incluyen
RASSF3
,
IFNAR1
,
IFNAR2 y NFKBIA
y candidatos oncogenes en FMCR ganado incluyen
PRDM16, TNS1, RPA3
y
KCNMA1
. Es importante destacar que el estado número de copias del 2 de estos genes novela conductor candidato,
NFKBIA
y
KCNMA1
, fue confirmada por ensayos cuantitativos específicos de RT-PCR.
Localización cromosómica
de inicio
Fin
Tamaño (Mb)
recurrencia (%)
SDE
genes candidatos
genes
*
3p14.357521404576526910.1324.44433p14.260078018611958231.1231.1171
FHIT
4q22.191340468926745441.3333.3382
TMSL3
6q261623571251630498540.6922.2271
PARK2
11p15.4917244993636100.1922.225312q14.263277389633681090.0920.0041
RASSF3
14q13.234108596349503390.8428.8959
NFKBIA
16p13.3-p13.2613253670182750.8924.4471
A2PB1
17p13.1-p1210957541124009681.4448.8953
MAP2K4
20p12.114376202160711351.6937.78101
MACROD2
21q22.1133554005336512050.1028.8973
IFNAR1, IFNAR2 sobre Table 1. Los genes conductor Candidato en FMCR borrado.
* Los genes candidatos definidos en base a las funciones del cáncer relevantes. Descargar CSV CSV localización cromosómica
Principal
End
Tamaño (Mb)
recurrencia (%)
SDE
genes candidatos
genes
*
1p36.32241214436300361.2226.67711
PRDM16
1p34.336881028375358910.6520.00512q352183542272185560810.2020.0051
TNS1
7p22.1-p21.3703316278298870.8048.8954
RPA3
8q23.31138277911145474540.7251.1140NA10q22.378238542790846560.8520.0041
KCNMA1
12p13.32-p13.31428242953649991.0840.00412
FGF23, FGF6
22q11.2118517833186863130.1720.0041Table 2. Los genes conductor Candidato en FMCR ganaron.
* Los genes candidatos definidos en base a las funciones del cáncer relevantes. Descargar CSV CSV
Discusión
Identificación de FMCR y afectadas las vías
La frecuencia y el patrón de mutaciones en
APC, TP53
,
KRAS
,
BRAF
y
PIK3CA
eran típicos de los tumores MSS /CIN, lo que sugiere que la muestra analizada aquí es representativa de este tipo de tumor. FMCR se definieron inicialmente como regiones aberrantes menor que 3 Mb de tamaño, que ocurre en más del 10% de los casos, con al menos 2 SDE y una puntuación COCA ~ ≥2 (valor de p = 0,01). En general, el 64 y 32 suprimen ganaron FMCR se identificaron de acuerdo con estos criterios. Los estudios publicados anteriormente mostraron un nivel bastante bajo de solapamiento de las aberraciones entre ellos (5,3% de las supresiones focales y el 15,5% para los aumentos focales) [13,16,22,35]. Esto no es quizás sorprendente ya que el uso de diferentes plataformas, métodos analíticos y conjuntos de muestras dará lugar a la identificación de los diferentes puntos de acceso de aberraciones. Nuestro estudio mostró un mayor grado de coincidencia con los datos publicados anteriormente (42,2% de FMCR borrada y 34,4% de FMCR ganado), lo que sugiere la ausencia de niveles significativos de sesgo en nuestra toma de muestras y métodos.
Pathway análisis mostraron que las vías relacionadas con el cáncer más enriquecido significativamente entre FMCR borrado eran apoptosis y p53 vías de señalización. Diez genes de apoptosis se eliminan habitualmente en nuestras muestras, de las cuales 7 han conocido las funciones pro-apoptóticos y 3 (
PIK3R2
,
PIK3R5
y
CFLAR
) tienen anti-apoptótica roles. Sin embargo,
CFLAR
se produce dentro de la misma FMCR como los genes pro-apoptóticos
CASP8
y
CASP10
. Del mismo modo,
PIK3R5
se encuentra aguas abajo de 1,2Mb
TP53
, y el 81% (n = 17) de las supresiones son comunes entre los 2 genes. Por lo tanto, parece probable que sea la deleción de los genes pro-apoptóticos en el FMCR que está actuando como un evento de controlador, con los genes anti-apoptóticos siendo co-pasajeros eliminado. Por la vía de señalización de p53, todos los genes suprimidos (n = 5) se sabe que tienen actividades anti-carcinogénico. Es notable que
TP53
en sí también ha sido eliminada en el 37,8% (n = 17) de los casos, pero no fue identificado dentro de un FMCR. Estos resultados sugieren que la FMCR suprimido podría jugar un papel importante en la supervivencia de las células tumorales a través de la desactivación de la apoptosis y /o la vía de señalización de p53. Por otra parte, el enriquecimiento de los genes apoptóticos dentro del FMCR eliminado apoya la correlación conocida entre la inestabilidad genómica y la apoptosis defectuosa [38].
La vía más significativamente enriquecido para los genes FMCR ganado era la vía MAPK oncogénico, con 9 genes siendo comúnmente afectadas. Siete de estos genes son conocidos o predice que tienen actividades oncogénicas, promoviendo el crecimiento del tumor y la supervivencia. Aunque, 2 genes tienen un papel anti-supervivencia, una de ellas (
DUSP8
), se produjo dentro de la misma FMCR como el crecimiento de la promoción gen oncogénico
IGF2
. En general, estos resultados confirman que las supresiones de contacto y el número de copias de genes objetivo gana dentro supresor de tumores y las vías oncogénicas, respectivamente.
genes de cáncer de controladores Candidato
En total, el FMCR identificadas contenidas ~ 1000 genes. Con el fin de identificar un conjunto de genes conductor candidato, el FMCR se dio prioridad aún más por el uso de una definición FMCR más estrictas. El candidato preseleccionado FMCR eran 11 supresiones y 8 aumentos, que contiene un total de 59 genes afectados.
Diez de los 28 genes (35,7%) en el 11 candidato suprime FMCR están con supresor de tumores conocidos o potenciales relacionados con el cáncer función. Seis de estos genes (
FHIT
,
TMSL3
,
PARK2
,
A2BP1
,
MACROD2
y
MAP2K4
) se han reportado consistentemente como eliminado en el CCR y otros tipos de cáncer [17,22,26,35]. Por otro lado,
RASSF3
,
IFNAR1
,
IFNAR2
y
NFKBIA
no se informó previamente a ser afectados en el CCR.
RASSF3
fue demostrado previamente para inhibir la proliferación celular en líneas celulares de cáncer de mama [39]. Los niveles de proteína de los receptores de interferón genes (
IFNAR1 y 2
), se mostró a ser reguladas en el cáncer de vejiga, y se asocian con la etapa avanzada y la resistencia a la quimioterapia [40]. Inactivación de las mutaciones de
NFKBIA
se han encontrado en el linfoma de Hodgkin, y heterocigóticos
fueron reportados NFKBIA
deleciones en ~ 25% de los casos de GBM [23,41] .. De acuerdo con sus funciones, la literatura y su ocurrencia dentro del candidato suprime FMCR, proponemos
RASSF3
,
IFNAR1
,
IFNAR2 Opiniones y
NFKBIA
como nuevos genes supresores de tumores candidato CRC.
Seis de los 31 genes (19,4%) en el 8 candidato ganó FMCR son cáncer relacionado con las funciones de predichos oncogénicos (
PRDM16
,
TNS1
,
RPA3
,
KCNMA1, FGF23
y
FGF6
).
FGF23
y
FGF6
han sido reportadas como ganado en el CCR y otros tipos de cáncer [15,17]. Sin embargo,
PRDM16
,
TNS1
,
RPA3
y
KCNMA1
no han sido reportados previamente en el CCR. PR-16 que contiene el dominio de genes (
PRDM16
) es un oncogén conocido implicados en la leucemia mieloide aguda (LMA) y el osteosarcoma [42,43] Tensin 1 gen (
TNS1
) es el único gen presente en la FMCR relevante, y
TNS1
sobreexpresión
in vitro
se había demostrado que promover de manera significativa la migración celular en fibroblastos [44]. proteína de replicación de genes A3 (
RPA3
) Recientemente se ha demostrado que se pueden obtener en el melanoma metastásico (dentro de un FMCR) y para jugar un papel esencial en la invasión tumoral [45]. gen de la subunidad alfa de gran conductancia de calcio activados por los canales de potasio (
KCNMA1
), el único gen en su FMCR, se ha demostrado que se pueden obtener en los casos de cáncer de próstata y sobreexpresa en el cáncer de mama metastásico [46,47]. Sobre la base de sus funciones, la literatura y la aparición dentro de la candidata ganaron FMCR, proponemos
PRDM16
,
TNS1
,
RPA3
y
KCNMA1
como novela candidatos oncogenes CRC.
En resumen, nuestros resultados, basados en el análisis de las regiones comunes mínimas focales, confirman informó anteriormente CRC loci y apoyan la hipótesis de que las aberraciones focales recurrentes se dirigen a los genes y las vías relacionadas con el cáncer. Por otra parte, se demostró que las supresiones y amplificaciones focales para afectar a los genes conocidos y oncogenes supresores de tumores, respectivamente. Proponemos aquí varios nuevos genes candidato conductor CRC. Se requiere una mayor validación y estudios funcionales para determinar su posible papel en la génesis tumoral CRC.
Apoyo a la Información
Figura S1.
genes apoptóticos en la (salida) DAVID FMCR borrado. DAVID salida que muestra la ruta de señalización de la apoptosis con genes eliminados marcados por una estrella roja
doi:. 10.1371 /journal.pone.0083859.s001 gratis (TIF)
figura S2.
vía de señalización p53 en el (salida DAVID) FMCR eliminado. DAVID salida que muestra la ruta de señalización P53, con genes eliminados marcados por una estrella roja
doi:. 10.1371 /journal.pone.0083859.s002 gratis (TIF)
Figura S3.
vía MAPK en el (salida DAVID) FMCR ganado. DAVID salida que muestra la ruta de señalización de MAPK con genes amplificados marcados por una estrella roja
doi:. 10.1371 /journal.pone.0083859.s003 gratis (TIF)
Materiales y Métodos S1.
Resumen de los pacientes y las características del tumor, secuencias de cebadores y temperaturas de recocido y números de acceso de genes NCBI.
doi: 10.1371 /journal.pone.0083859.s004 gratis (DOC)
Archivo S1.
cuadros S1-S3. Tabla S1: Resumen de las características moleculares de las muestras de tumor de 53. Tabla S2: Resumen del 64 suprimido FMCR. Tabla S3: Resumen de los 32 ganó FMCR.
doi: 10.1371 /journal.pone.0083859.s005 gratis (XLS)
Reconocimientos
Nos gustaría dar las gracias a todos los participantes en el estudio, Helen Cramp y Dan Connley para el paciente contratación y gestión de datos, Paul Heath para la ayuda con el aCGH y la instalación de secuenciación del núcleo de la Universidad de Sheffield para llevar a cabo la secuenciación del ADN.