Extracto
Antecedentes
La comprensión de los conductores para la metástasis en el cáncer humano es importante para potencial desarrollo de terapias para tratar las metástasis. El papel de la pérdida de las actividades de supresión tumoral TGF en el proceso metastásico es esencialmente desconocida.
Metodología /Principales conclusiones
La utilización de
in vitro
y
in vivo
técnicas, que han demostrado que la pérdida de la señalización TGF supresor de tumores es necesaria para permitir que el último paso del proceso metastásico - colonización del lugar de la metástasis. Este trabajo demuestra por primera vez que la reconstitución del receptor de TGF ocasiona una disminución de la colonización metastásica. Además, hemos identificado un nuevo TGF /PKA vía supresor de tumores que actúa directamente sobre un mecanismo de supervivencia celular conocido que responde al estrés con la inhibición dependiente de survivina /XIAP de las caspasas que efecto apoptosis. El vínculo entre la señalización y el control de la metástasis a través de la inducción de la muerte celular transduceome TGF /PKA se demostró por la restauración receptor TGF con la reactivación de la vía de TGF /PKA en células metastásicas con deficiencia de receptores de cáncer de colon que conducen al control de la supervivencia celular aberrante.
Conclusión /Importancia
Este trabajo afecta nuestra comprensión de los posibles mecanismos que son críticos para el crecimiento y mantenimiento de las metástasis, así como la comprensión de una nueva función de TGF como un supresor de metástasis. Estos resultados plantean la posibilidad de que la regeneración de la señalización de TGF atenuada sería un objetivo eficaz en el tratamiento de la metástasis. Nuestro trabajo indica el potencial clínico para el desarrollo de la terapia anti-metástasis basado en la inhibición de este importante mecanismo de supervivencia celular aberrante por la vía transduceome inducida por TGF multifacético /PKA. Desarrollo de tratamientos efectivos para la enfermedad metastásica es una necesidad apremiante desde la metástasis son la principal causa de muerte en los tumores sólidos
Visto:. Chowdhury S, Howell GM, Rajput A, Teggart CA, Brattain LE, Weber HR, et Alabama. (2011) identificación de un nuevo TGF /PKA Señalización Transduceome de control mediador de la supervivencia celular y la metástasis en el cáncer de colon. PLoS ONE 6 (5): e19335. doi: 10.1371 /journal.pone.0019335
Editor: Dhyan Chandra, Roswell Park Cancer Institute, Estados Unidos de América
Recibido: 18 de febrero, 2011; Aceptado: March 27, 2011; Publicado: 3 Mayo 2011
Derechos de Autor © 2011 Chowdhury et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyada por los Institutos nacionales de Salud subvenciones CA72001 y CA38173 a MGB. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer colorrectal (CCR) es una de las neoplasias más comunes con las altas tasas de incidencia a nivel mundial [1] y es la segunda causa de muerte relacionada con el cáncer en adultos en [2] de los Estados Unidos. CRC se puede curar mediante cirugía y el tratamiento multimodal en alrededor de la mitad de los individuos con esta enfermedad (estadios I-III). Sin embargo, la metástasis a órganos distantes (estadio IV) es la causa más frecuente de fracaso [2] tratamiento. El trabajo reciente ha subrayado en la importancia del desarrollo de la supervivencia celular inapropiada de señalización para varias etapas en el proceso metastásico. Especialmente digno de mención en el contexto de la señalización en el proceso metastásico de supervivencia es la importancia de la supervivencia celular aberrante a la colonización exitosa en sitios de metástasis en órganos distales [3]. Es importante destacar que los mecanismos moleculares implicados en la etapa temprana de metástasis crítico para el diagnóstico y la terapia no se conocen bien [1]. Muchos jugadores clave que incluyen la Bcl-2, inhibidor de la apoptosis (IAP) proteínas XIAP y survivin, y la fosfoinositida 3-quinasa (PI3K) - AKT /PKB que transmiten señales anti-apoptóticas en la promoción del crecimiento de células de cáncer se han implicado en metástasis [4], [5].
genes supresores de tumores (TSG) contribuir a la inducción de la apoptosis en respuesta al estrés. El fracaso para inducir la apoptosis en respuesta a diversos tipos de daño celular ha sido reconocido desde hace tiempo como una contribución a la oncogénesis. Un ejemplo de la pérdida de TSG contribuir a la formación y progresión del cáncer es TGF señalización [2]. La vía de señalización de TGF ha contribuido tanto positiva como negativamente en la regulación de la inhibición del crecimiento, la proliferación, la replicación, la invasión, metástasis, apoptosis, la vigilancia inmunológica y la angiogénesis de manera dependiente de contexto [6]. TGF respuestas supresores de inhibidor /tumorales se reducen con el aumento de la progresión y en tumores malignos etapa tardía a menudo están dañados de una manera que es compatible con la invasión y metástasis [6]. Si bien la corrupción de las respuestas de TGF para apoyar la metástasis implica la presencia de receptores funcionales en estas células, es igualmente evidente que hay un número considerable de modelos que van desde ratones transgénicos a xenoinjertos de cáncer de humanos indican que la pérdida o atenuación, de la expresión del receptor en una amplia variedad de tipos de tumores conduce a una mayor malignidad [7], [8], [9], [10]. Estos resultados sugieren que algunos subgrupos de cánceres han seguido una vía hacia la progresión maligna que implica la pérdida de la expresión del receptor de TGF mientras que otros tienen, de una forma aún por determinar, usurpada TGF señalización para conducir la progresión maligna. Hay varios ejemplos de silenciamiento del receptor de TGF en muestras clínicas que indican que el receptor de TGF RI y /o RII (designado TGFβRI y TGFβRII respectivamente) regulación a la baja son eventos tempranos en la oncogénesis y que la pérdida de la expresión del receptor por silenciamiento epigenético se correlaciona con la progresión maligna en los subgrupos de varios tipos de cáncer [11], [12].
Hemos demostrado que TGF señalización en un modelo de carcinoma de colon no metastásico etapa temprana conduce a la muerte celular en células de cáncer de colon en respuesta a la tensión en asociación con la inactivación de Pakt y la inhibición de la expresión de la proteína survivina IAP [13]. La formación de complejos entre la survivina y otra proteína IAP XIAP en el citoplasma en respuesta al estrés permite la estabilización de XIAP y la inhibición de sus objetivos efectoras y la caspasa ejecutor para inhibir la muerte celular [14]. Por lo tanto, dado el papel dominante de la señalización /AKT PI3K en los mecanismos de supervivencia celular y la asociación de XIAP y survivin en la progresión del cáncer [5], que postula que la pérdida de la señalización de TGF puede contribuir a la mayor expresión de XIAP /survivina y por lo tanto la pérdida de la señalización de TGF puede ser una clave para un mecanismo de supervivencia aberrante que permite el crecimiento metastásico en los sitios de órganos distales en contraste con la visión actual que TGF TSG es principalmente un controlador de acceso para evitar la oncogénesis.
señalización de TGFß se ha demostrado que activan la proteína dependiente de cAMP quinasa A (PKA) [15]. PKA desempeña un papel dominante en la integración de múltiples redes de transducción de señales [16], incluyendo la capacidad de alterar el complejo /survivina XIAP través de la fosforilación de survivina en Ser
20 [17].
Los mecanismos moleculares implicados en la regulación a la baja mediada por TGF de IAP fueron investigadas con el fin de determinar los efectos de la señalización del receptor TGF sobre la metástasis en un modelo ortotópico metastásico del carcinoma de colon. Ahora informe de la identificación de un nuevo TGF /PKA /AKAP transduceome mediada que converge en función de XIAP en el control de la supervivencia celular aberrante. Además, hemos demostrado que el rescate receptor TGF en células altamente metastásicas con silenciamiento epigenético de los receptores de TGF conduce a la disminución de las metástasis en un TGF /PKA señalización mecanismo dependen de la vía en un altamente metastásicas modelos de cáncer de colon ortotópico in vivo. Rescate de aspectos específicos supresores de tumores de la vía de señalización TGF puede proporcionar beneficios terapéuticos sin promover la supervivencia de las células metastásicas y los efectos de TGF. Si estos efectos supresores de tumores TGF se pueden imitar tumores en estadios tardíos, en última instancia, podría obtenerse un valor terapéutico contra el CCR metastásico.
Resultados
TGF activa PKA en células de cáncer de colon
Un informe crítico del laboratorio Simeone tomó nota de que la señalización de TGF activa PKA en células Mv1Lu y media el control de crecimiento TGF respuestas inhibitorias [15]. la activación de la PKA TGF fue mediada por un mecanismo dependiente de -independiente Smad, AMP cíclico (AMPc). Esto planteó la posibilidad de que el TGF señalización mediada por el control de la supervivencia celular aberrante observada en la etapa temprana TGF-sensible FET de colon modelo de carcinoma podría implicar la activación de PKA. La hipótesis de que TGF activa PKA en células FET en un mecanismo independiente de cAMP, Smad dependiente. Con este fin, las células FET se trataron con TGF (5 ng /ml) para los tiempos especificados, y un ensayo de proteína quinasa se llevó a cabo para medir la actividad PKA (Figura 1A). Después del tratamiento TGF, la actividad de PKA aumentó aproximadamente 2 veces dentro de 15 min y 4 veces en 1 h. Se observó que la activación de PKA mediada por TGF se abolió completamente después del pretratamiento de las células con H89 (15 mM), un inhibidor de PKA farmacológica [15]. TGF activación mediada por PKA también fue dependiente de la concentración (Figura 1B), con actividad máxima en células FET observados a 5 ng /ml TGF. Para confirmar que la activación de PKA era de aguas abajo de la activación de Smad por TGF, se observó que el pretratamiento con H89 no tuvo ningún efecto sobre la fosforilación de Smad2 por TGF usando análisis de inmunotransferencia (Figura S1). Desarrollamos estable PKA subunidad catalítica α shRNA desmontables en las células FET (FET designado PKACatα KD) para validar la respuesta H89 genéticamente (Figura S2). TGF tratamiento para los tiempos especificados era incapaz de activar PKA en los desmontables células en oposición a la activación robusta en las células FET parentales (Figura 1C). La activación de PKA por TGF ha demostrado ser cAMP independiente en las células Mv1Lu [15]. la activación de PKA clásica implica cAMP unión a las subunidades reguladoras de PKA para desencadenar la disociación de las subunidades catalíticas. Un mecanismo alternativo de la activación de PKA implica la asociación de I? B con PKA subunidades catalíticas, manteniendo así un estado inactivo de la PKA. Tras la degradación de I? B, hay activación de PKA independiente de la activación de AMPc [18]. Se determinó si la activación de PKA por TGF depende de la activación de AMPc en las células FET por tratamiento de las células con TGF y la medición de los niveles de AMPc usando un no radiactivo de inmunoensayo enzimático de cAMP (Figura 1D). Se observó que TGF fue incapaz de aumentar la producción de cAMP en contraste con el tratamiento Forskolin que proporcionó un aumento significativo en los niveles de AMPc como se esperaba. A continuación, se analizó la proteína TGF I? B tras el tratamiento para los tiempos especificados para determinar si la activación de la PKA por TGF era debido a la degradación de I? B (Figura S3). Los niveles de I? B se mantuvo sin cambios después del tratamiento TGF. Por lo tanto, la PKA es activada por TGF en un campo y de manera independiente de I? B en células FET de acuerdo con el informe de Zhang et al (2004). Para confirmar aún más la importancia funcional de la activación de PKA mediada por TGF, factor de transcripción CREB se puso a prueba, que ha sido identificado como un objetivo directo de la cAMP-PKA vía [15] de señalización. Hemos observado que la TGF fue capaz de estimular la fosforilación de CREB (Figura 1E) sin ningún cambio en los niveles totales de CREB (datos no mostrados). El pretratamiento de las células con H89 seguido de la exposición TGF redujo significativamente la fosforilación de CREB. Zhang et al (2004) hizo hincapié en el papel de Smad3 activa en la activación de PKA mediada por TGF. Desarrollamos estables desmontables shRNA Smad3 en las células FET (FET designado Smad3KD) (figura S4). tratamiento TGF en estas células Smad3 desmontables fue incapaz de activar PKA (Figura 1F) que indica a la dependencia de TGF mediada por la activación de PKA en Smad3 como se informó anteriormente [15].
células FET tratados con TGF (5 ng /ml ) activa PKA en un tiempo (a) y la concentración de B de manera dependiente (). PKA H89 inhibidor (15 mM) se utilizó para inhibir la activación de PKA. Forskolin (10 mM) se utilizó como control positivo. Comparación de los FET de los padres y las células FET PKACatα KD a la activación de PKA mediada por TGF (C). Desmontables de α-subunidad catalítica abrogada por la activación de PKA TGF. la activación de PKA por TGF es independiente de la generación de cAMP como se determina por el ensayo de cAMP (D). TGF conduce a la activación de CREB en células de FET (E). Actina se utilizó como control de carga para transferencias de Western. la activación de PKA por TGF es Smad3 dependiente como se determina por caída de Smad3 en células FET (F). Los resultados se expresan como media ± S.E.M. (n = 3). Todos los experimentos se han repetido tres veces de forma independiente.
TGF /PKA señalización mediada por la regulación negativa de XIAP
XIAP y survivin están bien caracterizados miembros de la familia IAP recientemente documentados como los genes metastásicos [5]. Su papel concertada en la promoción de la supervivencia celular y la metástasis ofrece una fuerte razón fundamental para la orientación de la expresión y /o actividad de estas IAPs en etapas avanzadas de cáncer. Un evento temprano asociado con la activación de PKA es la fosforilación de survivina en Ser
20 en el citosol, pero no en la mitocondria [17]. Esta fosforilación de survivina se ha demostrado que alteran la interfaz de unión para XIAP, que conduce a la degradación de XIAP. Nuestros datos, así como los informes anteriores indican que la respuesta de activación de PKA es un evento temprano después del tratamiento con TGF y alcanza niveles máximos dentro de 1 h de tratamiento TGF. La hipótesis de que TGF provoca una desconexión de la supervivencia celular aberrante mediante la estimulación de la PKA mediada por la interrupción del complejo XIAP /survivina. células FET se trataron con TGF para los tiempos especificados seguido de la determinación de XIAP y survivin (Figura 2A y S5). tratamiento de TGF downregulated tanto XIAP y survivin en los tiempos especificados. A medida que la fosforilación de survivina ya se ha demostrado estar relacionada con la activación de PKA, nos centramos nuestra atención en la regulación de XIAP. La degradación de XIAP fue bloqueado por H89 tratamiento previo antes de la exposición TGF para los tiempos especificados (Figura 2B). Para examinar la especificidad de la respuesta, se comparó el efecto de TGF sobre las células FET PKACatα KD y células FET parentales (Figura 2C). tratamiento TGF tuvo ningún efecto sobre los niveles de proteína XIAP en células FET PKACatα KD que indican la dependencia de la subunidad catalítica de PKA en TGF pérdida mediada de la proteína XIAP. Para confirmar la especificidad de la vía de TGF /PKA en esta respuesta, las células FET Smad3 KD se trataron con TGF para los tiempos especificados y la expresión de proteína XIAP se determinó (Figura 2D). En consonancia con la dependencia Smad3 de la activación de PKA mediada por TGF, estable desmontables shRNA de Smad3 abrogada XIAP regulación a la baja. Se utilizó un inhibidor de proteasomal (MG132) para determinar si la pérdida de XIAP era dependiente de la degradación proteasomal (Figura 2E). Se observó que el pretratamiento de las células con MG132 de FET (15 M) durante 1 h antes de TGF tratamiento completamente abolido la degradación de XIAP que indica que XIAP se degrada dentro de la proteasoma. PKA es un importante regulador de la actividad proteasomal y PKA se ha demostrado que la co-purificar con el proteasoma [19], [20]. La hipótesis de que TGF /PKA mediada por la regulación de la actividad proteasomal puede proporcionar otro nivel de control de la expresión de IAP (más allá de la fosforilación inducida por PKA de survivina en Ser
20). Informes anteriores indican que PKA fosforila la Rpt6 ATPasa, que se despliega y se transporta sustratos en el proteasoma y esta fosforilación mejora las actividades de proteasomal quimotripsina del proteasoma [21]. Con este fin, se determinó si la activación de PKA mediada por TGF es capaz de aumentar la actividad proteasomal quimotripsina usando un ensayo de la actividad proteasomal. tratamiento de las células TGF FET estimula selectivamente la actividad de tipo quimotripsina del proteasoma dentro de 1 h (Figura 2F). H89 tratamiento previo antes de la exposición TGF completamente abrogada el nivel basal de la actividad de tipo quimotripsina proteasomal y abolió completamente los efectos estimulantes de TGF en el proteasoma.
tratamiento TGF (5 ng /ml) durante los tiempos indicados downregulates XIAP en células FET (a) y este efecto es mediado por PKA como pretratamiento con el inhibidor de PKA H89 antes de TGF exposición abroga la pérdida de XIAP (B). Estable desmontables shRNA de PKA subunidad catalítica en células FET conduce a la abrogación de la pérdida de XIAP (C). Estable desmontables shRNA de Smad3 conduce a la abrogación de la pérdida de XIAP en células FET (D). TGF (5 ng /ml) mediada XIAP regulación a la baja es un evento proteasomal. El pretratamiento con MG132 inhibidor proteasomal (15 M) anuló la pérdida de XIAP por TGF (E). TGF activación mediada por PKA conduce a la activación de la actividad de la quimotripsina dentro de la proteasoma y este efecto se suprime por H89 (F). Los resultados se expresan como media ± S.E.M. (n = 3). Actina se utilizó como control de carga para transferencias de Western. Todos los experimentos se han repetido tres veces de forma independiente.
conjunto, estos datos conducen a la hipótesis de que la señalización TGF /PKA regula la expresión de XIAP en múltiples niveles con la activación de PKA conduce a la fosforilación de los componentes clave que proteasomal promover la degradación proteasomal de XIAP.
AKAP regula TGF /PKA mediada por la regulación negativa de XIAP
Hay una abundancia de a-quinasa anclaje de proteínas (AKAPs), que compartimentar la PKA y otras enzimas a las inmediaciones de orgánulos celulares específicas para llevar a cabo la función enzimática. La hipótesis de que AKAPs son un componente crítico en TGF /PKA mediada por la regulación negativa de XIAP. Está bien documentado que la localización subcelular de subunidades reguladoras de PKA (PKARI y /o PKARII) está mediada a través de interacciones con AKAPs [22]. AKAP inhibidor HT31, un péptido de anclaje tiroidea sintética se ha demostrado que es un inhibidor competitivo muy potente de la interacción PKARII /AKAP, evitando de este modo PKA anclaje [23]. Para asegurar que el HT31 se dirige específicamente a las interacciones AKAP-PKA, se realizaron ensayos de actividad de PKA en células FET para determinar la extensión de la activación de PKA después del pretratamiento con HT31 (25 mM) antes de la exposición TGF (Figura 3A). De acuerdo con estudios anteriores [15], HT31 fue capaz de bloquear la activación de PKA mediada por TGF. Dado que la interacción AKAP-PKA parece ser un requisito para la activación de PKA mediada por TGF, razonó que también podrían ser necesarias estas interacciones para los eventos de señalización que conducen a la pérdida de XIAP (Figura 3B). La adición de Ht31inhibitor por 1 h antes de TGF tratamiento para tiempos especificados abrogó completamente la pérdida de XIAP
.
AKAP inhibidor HT31 (25 mM) de tratamiento durante 1 h antes de la exposición TGF abroga la actividad TGF mediada por PKA (A) y TGF pérdida de XIAP mediada (B). AKAP149 siRNA desmontables se realizó en células FET (C). Desmontables de AKAP149 conduce a la abrogación de la actividad TGF mediada por PKA (D) y regulación a la baja XIAP (E). Los resultados se expresan como media ± S.E.M. (n = 3). Actina se utilizó como control de carga para transferencias de Western. Todos los experimentos se han repetido tres veces de forma independiente.
Dado que la familia AKAP incluye más de 50 miembros [24], el reto consistía en identificar un AKAP individual que estaba respondiendo a los efectos TGF /PKA en XIAP . Después de la selección inicial de la presencia de diferentes miembros de la familia AKAP en células FET, encontramos expresión de la proteína AKAP149 en estas células de cáncer de colon. AKAP149 (también denominado D-AKAP1 y AKAP121 en ratón) ha sido identificado como una proteína de membrana de la mitocondria [25]. Se ha informado de que AKAP121 mitocondrial participa en la orientación cAMP activa PKA en la membrana mitocondrial externa (OMM) y desempeña un papel en la biogénesis mitocondrial y la supervivencia [26]. Nuestra hipótesis basada en el entendimiento de que el mitocondrial XIAP y survivin movimiento para el citoplasma después de una respuesta de estrés que AKAP149 podría estar regulando la degradación mediada por TGF XIAP /PKA. La expresión de un AKAP149 pequeños ARN de interferencia (siRNA) previno la activación de PKA mediada por TGF (Figura 3C-D). Además, se observó que TGF fue incapaz de regular a la baja de proteína XIAP en células desmontables AKAP149 siRNA en comparación con células de control FET parentales (Figura 3E). Esta función pro-apoptótica de AKAP149 está en contraste con la función conocida de AKAP121 mitocondrial (o su homólogo humano AKAP149) en la promoción de la supervivencia.
A continuación preguntamos si el efecto de AKAP149 era selectivo en este efecto TGF /PKA . Mientras que la interacción AKAP-PKA es un fenómeno global, la validación de AKAP149 como selectivamente regulación de la señalización TGF /PKA sería una novela extensión de nuestra comprensión de la regulación a la baja de XIAP mediada por TGF /PKA. AKAP220 se ha demostrado que regulan la proteína fosfatasa 1 actividad (PP1) mediante la coordinación de la ubicación de PKA y PP1 subunidad catalítica [27]. Nos silenciado la expresión de AKAP220 en las células FET con AKAP220 siRNA. Estas células transfectadas cuando se trataron con TGF tuvo ningún efecto sobre cualquiera de la inducción de la actividad PKA o regulación a la baja XIAP (datos no mostrados). Tomados en conjunto, AKAP andamios juega un papel fundamental en la vía TGF /PKA mediada XIAP regulación a la baja con mitocondrial AKAP149 localizada sea necesario que la respuesta mediada por TGF /PKA.
Participación de PP2A en TGF /PKA mediada XIAP regulación a la baja
se ha observado que la activación de PKA conduce a la inactivación de AKT a través de la desfosforilación por la proteína fosfatasa 2A (PP2A) [28]. Esto condujo a la hipótesis de que la activación mediada por TGF de PKA es responsable de la represión de la activación de AKT que se informó anteriormente, como consecuencia de TGF señalización [13]. En consecuencia, se determinó la actividad de PP2A en células FET (Figura 4A). el tratamiento de TGF momentos determinados incrementó significativamente la actividad PP2A. PP2A inhibidor selectivo de ácido okadaico (OA, 50 nM) fue capaz de suprimir completamente la activación PP2A cuando se tratan solo o pretratada antes de la exposición TGF. A continuación, probamos el papel de TGF AKT en la mediación de la inactivación y la pérdida de XIAP (Figura 4B). Se observó que TGF desfosforilación mediada por AKT depende PP2A como se refleja por la capacidad de OA para bloquear la desfosforilación mediada por TGF de AKT. XIAP regulación a la baja también fue abolida por tratamiento de la OA. Aunque PP2A es un supresor de tumores implicados en el control de varias vías de supervivencia celular [29], la documentación de un papel en la subversión de la señalización celular dentro de la vía TGF la supervivencia es una novela de extensión de la función PP2A.
FET células fueron tratadas con TGF (5 ng /ml) para la actividad en la hora y PP2A indicado se determinó usando el protocolo de ensayo de actividad de PP2A como se describe en materiales y métodos (a). se utilizó inhibidor de PP2A ácido okadaico (OA, 50 nM) para inhibir la PP2A. El pretratamiento con OA antes de TGF (5 ng /ml) de tratamiento abrogada TGF pérdida de XIAP y mediada por la desfosforilación de AKT (B). Estable desmontables shRNA de PP2A catalítica α-subunidad se realizaron en las células FET (C). Desmontables de PP2A catalítica α-subunidad llevó a abrogación de TGF (5 ng /ml) mediada downregulation XIAP sin afectar la actividad PKA (D-E). estudios de inmunoprecipitación de XIAP en células FET tratados con TGF (5 ng /ml) o pretratadas con H89 o HT31 durante 1 h antes de la exposición TGF. XIAP se disocia de pAKT después del tratamiento TGF para el tiempo indicado (F). La inhibición de la actividad de PKA por H89 o interacción AKAP-PKA con HT31 abroga la disociación XIAP-pAKT mediada por TGF.
A fin de validar el papel de PP2A en la señalización de TGF /PKA, generamos estable catalítica de PP2A shRNA desmontables subunidad en células FET FET designado PP2A gato KD (Figura 4C). tratamiento de las células TGF FET PP2A Cat KD mostró la activación de PKA que indica que la activación de PKA está aguas arriba de la activación de PP2A (Figura 4D). Sin embargo, estable desmontables shRNA de la subunidad catalítica de PP2A completamente abolida TGF mediada inhibición XIAP y mostró la fosforilación de AKT sostenida también (Figura 4E). células FET PKACatα KD tratados con TGF también mostraron una fosforilación sostenida de AKT (datos no mostrados)
.
mientras que la inhibición de la activación de AKT tendría potencial para muchos efectos sobre la supervivencia de las células, un efecto que es de particular interés como relacionada a la función de TGF /PKA es en el contexto que se dirige a la estabilidad XIAP. Un estudio anterior informó de que XIAP es fosforilada por AKT en Ser
87 que conduce a una mayor estabilización de XIAP y la disminución de la apoptosis de células de cáncer de ovario en respuesta a cisplatino [30]. Pensamos que la inhibición de la actividad de PP2A AKT puede representar un mecanismo adicional para la interrupción de la estabilización de XIAP que se dirige por la ruta de TGF /PKA a través de la mejora de la actividad de PP2A. Con este fin, las células FET se trataron con TGF o pretratados con inhibidores diferentes de la vía TGF /PKA anteriores a la exposición TGF para momentos específicos y se inmunoprecipitaron para XIAP y inmunotransferencia para posibles proteínas unidas a XIAP. Encontramos una asociación de XIAP con pAKT (Figura 4F). Después del tratamiento TGF, había una disociación significativa del complejo XIAP-pAKT. Sin embargo, el pretratamiento con H89 o HT31 antes de TGF exposición completamente abrogada disociación XIAP-pAKT de las dos proteínas que indican que TGF /PKA de señalización mediada por la inactivación de AKT desestabiliza XIAP que conduce a su degradación proteasomal. Por lo tanto, el uso de inhibidores de estudios y desmontables estable, destacamos el nuevo hallazgo de que la señalización TGF /PKA media la pérdida de proteína XIAP mediante una represión dependiente de PKA-PP2A de la activación de AKT conduce a la pérdida de XIAP.
reconstitución del receptor de TGF lleva a disminución de la colonización metastásica: Impacto en TGF /PKA señalización
Hemos desarrollado una tecnología para la implantación del colon ortotópico de líneas de cáncer de colon humano en ratones atímicos que permite el análisis cuantitativo reproducible de metástasis en el hígado y los pulmones [31], [ ,,,0],32], [33]. El patrón metastásico que se muestra en este modelo de sistema refleja la naturaleza de la diseminación metastásica en pacientes humanos. Fácilmente se utilizaron células de cáncer de colon metastásico GEO para comprender mejor el impacto de TGF /PKA señalización sobre la metástasis. células GEO han atenuado TGFβRI expresión y de este modo atenuada supresor tumoral TGF señalización así como [8]. Hemos utilizado la implantación de xenoinjertos ortotópico de colon por vía subcutánea crecido para caracterizar los factores que influyen en la extensión de la metástasis en el hígado y los pulmones sin afectar a la invasión en el sitio del tumor primario [31], [33]. Se encontraron células GEO ser altamente metastásico en este modelo ortotópico como se refleja por la colonización metastásica en 53% de los animales implantados (Tabla 1). Rescate de la atenuación del receptor en las células GEO por transfección de un vector de expresión TGFβRI (designado GEORI) dio como resultado la reducción de la incidencia metastásico a aproximadamente 20% de los animales implantados sin afectar a la invasión en el sitio primario ya que ambos animales GEO y GEORI transfectadas dieron lugar a una tumor invasivo primario en 100% de los animales implantados. GEO animales trasplantados desarrollaron robusto metástasis de hígado en comparación con GEORI (Figura 5A). Hematoxilina y eosina (H & amp; E) tinción que muestra la metástasis del hígado en las células GEO se muestra en la Figura 5B. La caracterización de los tumores GEO mostraron aumento de la supervivencia celular de señalización como se refleja en las tasas de TUNEL más bajos en relación a los tumores GEORI que indican una represión de la colonización metastásica por TGF señalización supresor de tumores se asocia con la represión de la señalización celular in vivo (Figura 5C-D) la supervivencia. Además, no se observó ningún cambio en la tinción de Ki67 IHC entre GEO altamente metastásico y tumores primarios GEORI mal metastásicos que indican ninguna diferencia en la tasa de proliferación in vivo entre GEO y tumores GEORI (Fig 5E-F). Los resultados in vivo indican que la restauración del receptor TGF suprime competencia metastásica en las células GEO en el nivel de la colonización metastásica en oposición a la prevención de la invasión.
Comparación de imágenes GFP de la progresión metastásica en el hígado en ratones GEO y GEORI ( UN). GEO de colon cáncer de hígado H & amp; E tinción demuestre metástasis hepática (B). La comparación de secciones de tumores primarios de ratones GEO y GEORI por tinción TUNEL ensayo como se ha mencionado en Materiales y Métodos para determinar sus tasas de apoptosis (C). Las tasas de apoptosis se cuantificaron (D). La comparación de secciones de tumores primarios de GEO y ratones GEORI por Ki-67 tinción como se ha mencionado en Materiales y Métodos para determinar sus tasas de proliferación (E). Las tasas de proliferación se cuantificaron (F). la reconstitución del receptor de TGF conduce a un cambio en la actividad de PKA. Comparación de la actividad PKA en células altamente metastásicas GEO vs células GEORI mal metastásicos (G) y células de CBS en altamente metastásicas en comparación con células metastásicas CBSRII mal (H). Comparación de TGF (5 ng /ml) entre la exposición GEO y células GEORI (I) y CBS y células CBSRII (J). PKA inhibidor H89 abrogó la pérdida de XIAP mediada por TGF en las células GEORI y CBSRII (K).
Una clave para la capitalización de la represión de la metástasis por la señalización de TGF es la elucidación del mecanismo molecular por el cual metástasis es inhibida. Sobre la base de la disminución de la incidencia metastásico con la reconstitución del receptor de TGF conduce a rescate de la señalización de TGF, la hipótesis de que TGF /PKA mediada XIAP regulación a la baja requiere una señalización de TGF mecanismo intacto que se pierde en las células GEO altamente metastásicas. Sin embargo, el rescate de señalización TGF por reconstitución del receptor en las células GEORI que reduzca la incidencia de metástasis debe aumentar TGF /PKA de señalización y sus efectos aguas abajo en XIAP. células GEO con la señalización de TGF atenuada no tenían la activación de PKA con la exposición TGF (Figura 5G). Sin embargo, las células GEORI con TGF funcional de señalización debido a la reconstitución receptor tenían un aumento robusto en la activación de PKA por TGF que era aproximadamente 4 veces mayor que el control. Una segunda línea celular de carcinoma de colon (células CBS) con atenuada TGFβRII señalización [34] también demostraron una reducción de la metástasis después del rescate de la deficiencia del receptor (datos no mostrados). Se observó una respuesta similar en la actividad de PKA en células CBS altamente metastásicas en comparación con las células metastásicas CBSRII mal después del tratamiento TGF in vitro (Figura 5H).
A raíz de esta observación, la hipótesis de que el GEO altamente metastásico y células CBS sería resistente a la pérdida de señalización mediada por TGF /PKA de proteína XIAP. Pensamos que la incapacidad de TGF señalización para inducir la activación de PKA en estas células debido a la inactivación del receptor sería también prevenir sus efectos aguas abajo en XIAP haciendo de este modo que estas células más metastásico mediante el aumento de la señalización pro-supervivencia. Mientras tanto GEO y CBS no mostraron respuesta al tratamiento TGF en momentos especificados (Figura 5I-J), las células GEORI y CBSRII mostraron XIAP regulación a la baja de los tratamientos similares (Figura 5I-J).