Extracto
Para la terapia de medicamento contra el cáncer, es crítico para matar las células con mayor potencial tumorigénico, incluso cuando comprenden una fracción relativamente pequeña de la población total de células tumorales. Hemos utilizado el ensayo de inhibición establecida NCI /DTP 60 celular crecimiento de la línea como una plataforma para explorar la relación entre la estructura química y la inhibición del crecimiento en ambas líneas celulares de cáncer oncogénicas y no oncogénicas. El uso de mediciones experimentales de "tomar tasa" en implantes ectópicos como un indicador de potencial tumorigénico, se identificaron ocho agentes químicos que aparecen inhibir fuertemente y selectivamente el crecimiento de las líneas celulares más tumorigénicas. relaciones de los datos de ensayo y de estructura-actividad bioquímicos indican que estos compuestos actúan mediante la inhibición de la polimerización de tubulina. Sin embargo, su actividad contra líneas de células tumorigénicas es más selectivo que el de los otros inhibidores de microtúbulos en el uso clínico. diferencias bioquímicas en las subunidades de tubulina que forman los microtúbulos, o diferencias en la función de los microtúbulos en el ensamblaje del huso mitótico o la división celular pueden estar asociados con la selectividad de estos compuestos
Visto:. Abdullah NM, Rosania GR, Shedden K (2009) de identificación selectiva de cáncer Tumorígeno Líneas celulares de microtúbulos inhibidores. PLoS ONE 4 (2): e4470. doi: 10.1371 /journal.pone.0004470
Editor: Winston Hide, Universidad de Western Cape, Sudáfrica
Recibido: 8 Agosto, 2008; Aceptado: 28 Noviembre 2008; Publicado: 13 Febrero 2009
Derechos de Autor © 2009 Abdullah et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Estados Unidos Institutos nacionales de Salud de subvención P20HG003890. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
La agresividad de los diferentes tipos de células tumorales derivadas de pacientes humanos puede evaluarse en términos de su potencial tumorigénico en modelos de xenoinjertos de ratón. Por ejemplo, el potencial tumorigénico en xenoinjertos de ratón recientemente se ha utilizado para definir los cáncer "células madre", que presumiblemente corresponden a la subpoblación de células malignas que impulsan la formación y el crecimiento del tumor [1]. En consecuencia, se ha postulado que algunos tipos de cáncer se componen de una colección heterogénea de células, sólo una minoría de los cuales son capaces de formar nuevos tumores [2]. Estas células pueden ser enriquecidas a partir de poblaciones de células tumorales heterogéneas sobre la base de su expresión de marcadores de la superficie celular. En los tumores de mama, por ejemplo, las células co-expresan altos niveles de CD44 y antígeno específico epitelial (ESA) y bajos niveles de CD24 son las células iniciadoras de tumores [2]. Del mismo modo, en el colon y el cáncer de cerebro, subpoblaciones de células que expresan altos niveles de CD133 (PROML1) inician los tumores [3], [4]. Lo más importante, en el trasplante en ratones inmunocomprometidos, las células iniciadoras del tumor pueden reconstituir completamente un tumor con la heterogeneidad que recuerda el tumor original [2] - [4]. Aunque el concepto de un cáncer "célula madre" sigue siendo controvertido, desde un punto de vista terapéutico, los agentes anticancerosos dirigidos contra las células cancerosas oncogénicas puede ser el más eficaz en la erradicación de los tumores.
El descubrimiento de fármacos y el desarrollo del sector de la Nacional del Cáncer Institute (NCI), Developmental Therapeutics Program (DTP), se ha utilizado un panel de 60 líneas celulares derivadas de tumores humanos para detectar el potencial quimioterapéutico de más de 75000 compuestos [5], [6]. Este panel de 60 líneas celulares se conoce comúnmente como "NCI60 líneas celulares." Las líneas celulares representan diversas leucemias, melanomas y cánceres de pulmón, colon, cerebro, ovario, mama, próstata y riñón [5]. Aparte de su uso en la detección de drogas, el potencial tumorigénico de estas líneas celulares se ha medido por xenotransplanting estas células en ratones inmunocomprometidos y la evaluación de su capacidad para formar nuevos tumores [6]. Diferentes líneas celulares en el panel NCI60 exhiben una gama de potenciales tumorigénicas después del transplante en ratones inmunodeprimidos. El potencial tumorigénico ha sido registrado como de cada línea celular "tasa de tomar."
Como hipótesis, las diferencias de potencial tumorigénico entre las líneas celulares de cáncer del NCI puede reflejar variaciones en la actividad proliferativa y características iniciadoras del tumor del real células de cáncer, tal como existen en los tumores de pacientes con cáncer. Por lo tanto, las líneas celulares que demuestran NCI60 alta tasa de absorción puede ser más representativa de las células iniciadoras del cáncer de tumores encontrados
In situ
. A continuación, se identifican compuestos a partir de la base de datos DTP que son más activos contra líneas celulares con la más alta tasa de absorción, y procede a establecer un supuesto mecanismo de acción de estos compuestos mediante la realización de estudios de relación estructura-actividad, y compararlos con los agentes anticancerígenos estándar cuya mecanismo de acción es desconocido. Además, se muestran las diferencias en potencial tumorigénico y capacidad de respuesta a estos agentes estar relacionada con las diferencias en la expresión génica entre las líneas celulares NCI60 con potenciales tumorigénicas altos y bajos, así como a la expresión de genes marcadores de células de cáncer de tumorigénicas.
resultados
la identificación de compuestos citotóxicos selectivamente
actividad inhibidora del crecimiento de la colección DTP de agentes químicos representados por -logGI50 se puede comparar con las cuatro categorías de toma de tasa utilizando los coeficientes de correlación de Pearson. Usando este enfoque, nueve compuestos que tienen el coeficiente de correlación mayor que 0,5 en magnitud se identificaron de 34,909 compuestos ensayados (Figura 1). Todos los nueve coeficientes de correlación fueron positivos, lo que indica que estos agentes eran más activos en la inhibición de crecimiento celular en las líneas celulares más tumorigénicas (Figura 2). Debido a que el número esperado de los compuestos de cada 34.909 que tiene un coeficiente de correlación superior a 0,5 en magnitud por casualidad es 0,7 con un 95
percentil de dos compuestos, es muy poco probable que dos o más de estos nueve compuestos son falsos positivos.
Ninguno de los agentes anticancerígenos estándar en la base de datos DTP superar estos nueve compuestos en términos de actividad citotóxica selectiva contra las líneas celulares más tumorigénicas. El coeficiente de correlación más grande observada entre los agentes anticancerosos estándar es 0,47 para vinblastina, que es un agente antimitótico. De hecho, los agentes antimitóticos son la única clase mecanicista que muestra correlación positiva no despreciable consistente con toma de tasa. A pesar de sus coeficientes de correlación positivos, ninguno de los agentes contra el cáncer estándar antimitóticos muestran coeficiente de correlación mayor que 0,5, lo que sugiere que los nueve compuestos identificados en nuestro análisis de correlación pueden ser únicamente selectiva contra las líneas celulares más tumorigénicas. Varios de estos nueve compuestos exhiben una ventana de selectividad de ancho, con diferencia en -logGI50 entre las líneas celulares tumorigénicas y no tumorigénicas de dos o más. Los compuestos 384634, 385177, 5468780, 361500 y 379512 son comparables a todos los agentes antimitóticos estándar en lo que respecta a su citotoxicidad; Sin embargo, la ventana de su selectividad es mucho más amplia (Figura 3) guía empresas
La inhibición de la polimerización de tubulina como posible mecanismo de acción
Los compuestos identificados punto a una clase importante relación estructura-actividad.: cuatro de los compuestos identificados comparten una estructura naftiridin núcleo (véase la Figura 1). Tres de estos compuestos (385177, 5468780, 5468781) están estructuralmente relacionados, a través de la presencia de un grupo naphthelene en la posición R
2. Estas estructuras se diferencian entre sí basándose únicamente en el posicionamiento de uno o dos grupos metilo en el anillo A: compuestos 385.177 y 5.468.780 contienen un grupo metilo en las posiciones R
5 y R
2, respectivamente, mientras que el compuesto 5.468.781 contiene dos grupos metilo en las posiciones R
5 y R
2. El otro compuesto (384.634) se diferencia de los tres compuestos mencionados anteriormente debido a que la 3'-metoxi anillo de benceno sustituido con un grupo sustituye el grupo naftaleno en la posición R
2. Este compuesto también contiene un grupo metilo en la posición R
5 en el anillo A. La presencia de la estructura de núcleo común a todos los compuestos en este grupo sugiere que puede jugar un papel fundamental en el mecanismo de acción de este grupo de compuestos .
con el fin de identificar un posible mecanismo de acción, los nueve compuestos se agruparon junto con los 168 agentes anticancerígenos convencionales utilizando las huellas dactilares 881 CACTVS clave. Cortar el dendrograma en un coeficiente de Tanimoto de 0,7, cinco de los nueve compuestos se agrupan con nueve agentes anticancerosos estándar, incluyendo diversos agentes antitubulina tales como vinblastina y vincristina. El análisis posterior de la literatura científica reveló que muchos de nuestros compuestos en efecto inhibir la polimerización de la tubulina
in vitro
. Compuesto 384 634 se ha sintetizado y ha mostrado para demostrar la actividad antitublin en un ensayo de polimerización de tubulina [11]. Del mismo modo, isósteros de compuesto 385 177, 5.468.780 y 5.468.781 inhiben potentemente la polimerización de tubulina [12]. Es muy posible que el compuesto 379512 es un agente antitubulina, así, debido a que un número de compuestos que contienen la estructura de anillo 2-fenil-quinolona se han sintetizado y exhibir la polimerización de tubulina [13] - [17]. Compuesto 5388755 es casi estructuralmente idéntica a la combretastatina A-4, que es un agente antitubulina muy potente [18].
COMPARAR análisis [19] se realizó para caracterizar mejor el mecanismo de acción de los compuestos. En COMPARE, un coeficiente de correlación de 0,6 se toma generalmente para indicar la evidencia para mecanismos de acción similares entre los compuestos ensayados y de referencia. Cuanto mayor sea el coeficiente de correlación, más probable es que los compuestos comparten la misma diana intracelular [9]. El coeficiente de correlación de los cálculos de comparación para los ocho compuestos más potentes y los antimitóticos agentes anticancerosos estándar revela varios compuestos que muestran altas correlaciones con inhibidores de microtúbulos colchicina, maitansina, vinblastina y vincristina (Tabla 1). Ninguno de estos compuestos muestran similitud con cualquiera de los agentes de otras clases mecanicistas tales como inhibidores de la topoisomerasa, agentes alquilantes y antimetabolitos de ADN /ARN (datos no mostrados). Ninguno de los compuestos tienen una fuerte correlación con el taxol, que es un agente antimicótico que actúa mediante la estabilización de los microtúbulos.
paralela la actividad antitubulina citotoxicidad selectiva
Con el fin de identificar el papel de la actividad antitubulina en la generación de citotoxicidad selectiva, hemos identificado doce compuestos adicionales DTP (Figura 4) que están estructuralmente relacionados con algunos de los nueve compuestos que hemos identificado en nuestro análisis de correlación, sino que la actividad de la falta antitubulínico [11] - [15]. Si la actividad antitubulina confiere citotoxicidad selectiva, estos compuestos sin actividad antitubulina deben demostrar ninguna citotoxicidad selectiva. El diagrama de dispersión que compara la relación entre la citotoxicidad y la tasa tomar para estos doce compuestos indica que ninguno de estos compuestos muestran citotoxicidad selectiva (Figura 5), y que son en gran medida inactivo en el ensayo de inhibición del crecimiento celular.
La expresión génica análisis
Una serie de estudios de investigación previos han identificado CD44, CD24, CD133 y (PROML1) como marcadores de características potenciales o de células madre en células similares a tumorigénicas, con CD44 y CD133 es relativamente altamente expresa en líneas tumorigénicas, y CD24 se expresa en niveles bajos. Por lo tanto, se realizaron búsquedas de los genes específicos cuya expresión puede estar relacionado con la actividad citotóxica selectiva de los compuestos identificados. Para este propósito, los datos de perfiles de transcripción se extraía de los genes cuya expresión a través de las líneas de células se correlaciona con potencial tumorigénico. En este conjunto de datos, se encontró que la tasa es independiente de toma PROML1, CD44, y la relación de registro de CD44-CD24 en las líneas celulares NCI60. También se analizó la expresión de la veintena de diferentes isotipos de tubulina (alfa, beta y gamma) y no encontramos ninguna correlación con la tasa de absorción.
A pesar de que los genes marcadores candidato tumorigenicidad PROML1, CD44, CD24 y CD44 no se asociaron con la tasa de absorción, se identificaron los genes expresados en niveles sustancialmente más altos en las líneas celulares más tumorigénicas. En la plataforma array U95A, un factor de transcripción (DBP), una integrina (ITGA6, dos conjuntos de sonda), y una proteína de esqueleto de membrana (ADD3, dos conjuntos de sonda) seguido este patrón de expresión. Seis genes con nombre y dos genes identificados se expresan en niveles sustancialmente más altos en el tumorigénico menos en comparación con las líneas de células oncogénicas más en la gama plataforma U95A: PTGIS, JAK1, MGC5560, XPC, NRG1, y SULF1. En la plataforma U133A /B TMEM18, ACACB, y GMCL1 se asociaron positivamente con el potencial tumorigénico, junto con dos probesets unnanotated (229930_at y 230312_at). No hay asociaciones negativas que cumplieran con los criterios de selección se identificaron en la plataforma U133A /B. La importancia funcional de los genes marcadores de células madre putativas en relación con la tumorigenicidad o aumento de la sensibilidad a los inhibidores de microtúbulos no está claro.
Discusión
Por minería de datos del archivo DTP, somos capaces de identificar compuestos que se son preferentemente tóxico contra el más tumorigénico de las líneas celulares NCI60, basado en la tasa de absorción de las líneas celulares en un modelo de xenoinjerto de ratón. También establecimos que la actividad de estos compuestos no se correlacionó con la expresión de marcadores de células madre de la superficie celular en la literatura. Sin embargo, el potencial tumorigénico es la relación funcional más importante entre las células tumorales más agresivas y
in vitro
modelo para la detección de drogas. Por lo tanto, los agentes contra el cáncer identificados en base a su actividad contra líneas celulares altamente oncogénicas pueden ser considerados como agentes anticancerígenos candidato que se dirigen específicamente contra las subpoblaciones de células cancerosas que impulsan el crecimiento de tumores.
Uno de estos agentes ( 384634) se ha encontrado que inhibe la polimerización de microtúbulos. Del mismo modo, isósteros de tres de nuestros agentes (385.177, 5.468.780, 5.468.781) también se han demostrado para inhibir la polimerización de los microtúbulos, lo que sugiere un mecanismo único de acción. Curiosamente, el Compuesto 5388755 está estructuralmente relacionada con el agente antitubulina potente combretastatina A-4. También es posible que el compuesto 379512 actúa inhibiendo la polimerización de tubulina porque varios agentes diferentes que contienen la estructura de anillo de quinolona han demostrado actividad antitubulina. COMPARAR análisis corrobora las similitudes entre los agentes contra el cáncer aquí identificados y varios inhibidores de los microtúbulos diferentes. Con la excepción del compuesto 319 428, todos nuestros compuestos muestran una fuerte similitud con colchicina, maitansina, vinblastina y vincristina. Ninguno de los compuestos muestran una relación significativa con el taxol, que actúa mediante la estabilización de los microtúbulos.
De nuestro análisis, la actividad antitubulina es probable que sea responsable de la citotoxicidad selectiva contra las líneas celulares tumorigénicas. Se analizaron un número selecto de compuestos estructuralmente relacionados con ninguna actividad antitubulina por su patrón de citotoxicidad hacia las líneas celulares NCI60. Ninguno de estos compuestos demostró citotoxicidad selectiva. De hecho, la mayoría de estos compuestos eran inactivos. Junto con su actividad antitubulina, la selectividad de nuestros compuestos hacia las líneas de células altamente tumorigénicas sugiere que los microtúbulos de las líneas de células tumorigénicas y no tumorigénicas pueden ser diferentes. Curiosamente, no se observó diferencia en el nivel de expresión del gen de la tubulina entre las líneas celulares altamente tumorigénicas y no tumorigénicas. Es plausible que la citotoxicidad selectiva observada no se debe a la diferencia en la expresión del gen de la tubulina, sino más bien un resultado de diferencias en las modificaciones post-traduccionales (PTMs) [20]. Recientemente, varios resultados experimentales han apoyado la idea de que la PTM de tubulina dan lugar a la diversidad funcional de los microtúbulos. Muchos PTMs de tubulina se han identificado incluyendo detrysosination, glutamylation, glycylation, fosforilación y acetilación palmitoylation [20] - [22]. Las diferencias en la expresión isotipo tubulina y PTM se han asociado con la diferenciación celular y las transiciones de desarrollo [23] - [25]. Debido a los microtúbulos son clave para mitótico conjunto de husillo y la división celular, las diferencias en la estructura del huso mitótico y la función entre las líneas celulares tumorigénicas y nontumorigenic pueden estar asociados con la selectividad de estos compuestos.
En conclusión, se ha identificado una familia de inhibidores de microtúbulos que son en su mayoría tóxicos contra las líneas celulares tumorigénicas. líneas celulares de cáncer establecidas que demuestran alta tumorigenicidad en modelos de xenoinjertos pueden capturar algunas propiedades de las subpoblaciones de células de cáncer que son responsables de la iniciación y propagación de los tumores. Por lo tanto, proponemos que esta familia de inhibidores de microtúbulos, o compuestos relacionados con características de selectividad similares, debe ser considerado como los principales candidatos para una evaluación adicional como agentes anticancerígenos.
Materiales y Métodos
los datos de inhibición de crecimiento compuesto se obtuvo de la pantalla antitumoral NCI 60 línea celular. La actividad inhibidora del crecimiento de cada compuesto corresponde a la concentración molar de fármaco requerida para causar la inhibición del crecimiento del 50% (GI50). La mayoría de los ensayos utilizan una concentración máxima de 0,0001 M (la pantalla de línea celular y el parámetro GI50 se describen en [7]). Para el análisis de microarrays de expresión génica, se utilizó cinco conjuntos de datos públicamente disponibles para las líneas celulares NCI60: tres experimentos que utilizan la plataforma U95A Affymetrix proporcionada por Novartis, un único conjunto de datos U95A proporcionada por GeneLogic, y un único conjunto de datos /B Affymetrix U133A siempre por GeneLogic. Los datos de GI50 se obtuvieron de http://dtp.nci.nih.gov/docs/cancer/cancer_data.html y todos los datos de expresión de genes se obtuvieron de http://dtp.nci.nih.gov/mtargets/download.html . Todos los datos de expresión génica y de ensayo IC50 se analizan en la escala logarítmica.
Valoración del potencial tumorigénico
Las líneas celulares NCI60 han sido evaluadas experimentalmente para potencial tumorigénico por el trasplante de las líneas celulares en inmunoterapia ratones comprometida. Los experimentos y resultados se proporcionan en la Guía de desarrollo de fármacos contra el cáncer [6]. Para diferentes líneas celulares, estos datos se les da forma cuantitativa o cualitativa, o, a veces como intervalos, como la "tasa de tomar", o la proporción de intentos de implantes que arrojaron un tumor. Se convirtieron los datos de tasa de toma en cuatro categorías ordenadas para el análisis: 0 para ningún crecimiento, 1 de 1-60% tasa de absorción, 2 de 60-80% tasa de absorción y 3 para el 80-100% tasa de absorción. Las líneas celulares que se superponen dos categorías son clasificados en la categoría inferior. Por ejemplo, una línea celular con un 70-90% tasa de absorción está clasificado como categoría 3. Estos valores de potencial tumorigénico se denotan "TP".
selección Compuesto
Los compuestos activos contra alta take líneas celulares de tipos se identificaron mediante la comparación de la medición de la inhibición del crecimiento (IC50-log) a la calificación de cuatro grado de asunción de tasa, el coeficiente de Pearson. Umbrales de 0,4 y 0,5 se utilizaron para definir correlaciones moderadas y fuertes. La significación estadística se evaluó mediante el cálculo del número esperado de compuestos fuera de todos los compuestos ensayados que se espera que tengan una correlación superior a un umbral determinado por el azar (basado en la aplicación de la Z-transformación de Fisher y el uso de una distribución normal de referencia estándar).
La expresión génica análisis
Los compuestos activos contra líneas celulares que expresan niveles relativamente altos de PROML1 o CD44-CD24 se identificaron utilizando los coeficientes de correlación de Pearson entre -log
10GI50 y, o bien conectarse expresión escala de PROML1, o la diferencia entre la escala logarítmica niveles de expresión de CD44 y CD24. PROML1 está representado por una única probeset en ambas plataformas, CD44 está representado por dos probesets U95A y por seis probesets B U133A /, y CD24 está representado por un probeset U95A y por probesets seis U133A /B. Cuando múltiples probesets están disponibles, todos se analizan por separado, y las diferencias entre todos los pares de probesets CD44 /CD24 se analizan por separado. Para todos los análisis, compuestos para los que menos de 50 líneas celulares tenían un valor IC50, o que no tenían variabilidad en sus valores de GI50, fueron excluidos de nuestro análisis.
agentes anticancerígenos estándar
Un conjunto de 168 compuestos con actividad contra el cáncer fue compilado, y fue anotado un subconjunto de 121 de ellos de acuerdo con su presunta mecanismo de acción [8] - [10]. Los datos que usamos se obtuvieron de http://dtp.nci.nih.gov/docs/cancer/searches/standard_mechanism_list.html, e incluir el siguiente mecanismo de acción de las clases y el número de estructuras únicas: agentes alquilantes (35), antimitótico agentes (13), de la topoisomerasa 1 inhibidores de (24), inhibidores de topoisomerasa II (15), de ADN anti-metabolitos (16), y ARN /ADN anti-metabolitos (18).
comparaciones estructura química
todos los compuestos descritos aquí son parte de PubChem, y todas las comparaciones estructurales reportados se basan en coeficientes de Tanimoto utilizando las huellas dactilares 881 CACTVS clave. Los cálculos de los coeficientes de Tanimoto y la agrupación jerárquica de estructuras químicas en base a coeficientes de Tanimoto se hizo utilizando el portal de NCBI para PubChem (http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov). Convertimos todos los identificadores compuestos a partir de identificador NSC del DTP de identificador CID de PubChem para el análisis estructural.
COMPARAR análisis
COMPARAR cálculos para todos los compuestos potentes contra los agentes anticancerígenos estándar de varias clases mecanicistas se llevan a cabo . los coeficientes de correlación de Pearson correspondientes a la alta concentración de 0,0001 M son reportados para la mayoría de los compuestos. Para los compuestos que se prueban con una alta concentración alternativa, los coeficientes de correlación de Pearson se obtienen a partir de pares con la alta concentración más cercano.
ventana de Selectividad
La ventana de selectividad se calculó tomando la diferencia entre el -logGI50 promedio de las líneas más tumorigénicas celulares (categoría de tasa tomar 3) y las líneas celulares menos tumorigénicas (categoría 0 grado de utilización).