Extracto
La caracterización de las células madre del cáncer subpoblación (CSC), a través de la comparación de la expresión genética con respecto a la las células cancerosas nativos, es particularmente importante para la identificación de nuevos y más eficaces estrategias contra el cáncer. Sin embargo, CSC tiene características peculiares en términos de adhesión, crecimiento y metabolismo que posiblemente implica una modulación diferente de la expresión de los genes más comúnmente utilizados de limpieza (HKG), como b-actina (ACTB). A pesar de que es crucial para identificar cuáles son los genes HKG más estables para normalizar los datos derivados del análisis en tiempo real PCR cuantitativa para obtener resultados robustos y consistentes, una validación exhaustiva de genes de referencia en el CSC no es una forma. Aquí, hemos aislado esferas CSC de diferentes sarcomas y carcinomas musculoesqueléticas como un modelo para investigar la estabilidad de la expresión de mRNA de 15 comúnmente usado HKG, con respecto a las células nativas. Los genes seleccionados se analizaron para el coeficiente de variación y se compararon mediante la NormFinder algoritmos populares y geNorm para evaluar la clasificación de la estabilidad. Como resultado, se encontró que: 1) Tata proteína de unión (PDD), Tirosina 3-monooxigenasa /triptófano 5-monooxigenasa polipéptido zeta proteína de activación (YWHAZ), Peptidylprolyl isomerasa A (ppia), y hidroximetilbilano sintasa (HMBS) son los más HKG estable para la comparación entre CSC y células nativas; 2) al menos cuatro genes de referencia se deben considerar para obtener resultados robustos; 3) el uso de ACTB no debe ser recomendado, 4) HKG específica debe ser considerada para los estudios que se centran sólo en un tipo específico de tumor, como el sarcoma o carcinoma. Nuestros resultados deben tomarse en consideración para todos los estudios de análisis de la expresión génica de CSC, y contribuirán notablemente para futuras investigaciones orientadas a identificar nuevos terapia contra el cáncer basada en la orientación CSC
Visto:. Lema S, S Avnet, Salerno M, Chano T, N Baldini (2016) identificación y Validación de limpieza genes para análisis de expresión génica de las células madre del cáncer. PLoS ONE 11 (2): e0149481. doi: 10.1371 /journal.pone.0149481
Editor: Javier S. Castresana, Universidad de Navarra, ESPAÑA
Recibido: 20 Octubre, 2015; Aceptado: 1 Febrero de 2016; Publicado: 19 Febrero 2016
Derechos de Autor © 2016 Lema et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. Todo relevante los datos están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el subsidio (RBAP10447J FIRB a NB) del Ministerio de Educación, Universidad e Investigación de Italia, por la Asociación italiana para la Investigación del cáncer ( AIRC IG11426 a NB), y por el Ministerio italiano de la salud y el apoyo financiero para la Investigación Científica "5 por mil 2012" (NB). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Las diferentes poblaciones de células forman tumores malignos. Dentro de los tejidos normales dadas, residir una subpoblación de células madre con capacidad de auto-renovación y diferenciación en células especializadas. Del mismo modo, un tumor se compone de una población heterogénea de células malignas con rango distinto de la diferenciación, la proliferación y el potencial tumorigénico. Entre tales células malignas heterogéneos, las células madre de cáncer (CSC) se denominan como una pequeña pero distinta población de elemento en la masa tumoral que son primarios implicadas en las etapas de iniciación, la transformación y la posterior progresión del tumor [1]. El modelo CSC sostiene que, al igual que las células madre de los tejidos normales, las células tumorales siguen las organizaciones jerárquicas en las que CSC acostado en el vértice mantener la capacidad para la tumorigénesis [2], la promoción de la metástasis [3-5], y la resistencia a la quimioterapia o la radioterapia [6 -8]. Esta población de células iniciadoras de tumor se aisló y se caracterizó por primera vez en la leucemia mieloide humano [9,10], y posteriormente también en otros tumores sólidos [11-13]. El ensayo más ampliamente utilizado para el aislamiento de CSC es el ensayo de formación de esferas y se basa en la capacidad de CSC para crecer en condiciones independientes de anclaje y de formar colonias flotantes [12], los llamados "esferas". Anteriormente, hemos aislado esferas CSC de sarcomas musculoesqueléticos humanos [14-16], y en este estudio también aislamos CSC de carcinoma diferente. Mientras que los carcinomas son tumores malignos de adultos comunes que presentan alto índice metastásica en el momento del diagnóstico y la extensa morbilidad [7, 12], los sarcomas musculoesqueléticos son heterogéneos, relativamente rara, y tumores malignos altamente agresivas de los tejidos óseos y blandos que se producen con frecuencia en niños y adultos jóvenes [17] . La alta tasa de recaída típica de estas neoplasias afecta dramáticamente el resultado clínico y, a pesar de la cirugía puede ser curativa, el pronóstico del tumor sigue siendo pobre. Por lo tanto, los enfoques terapéuticos actuales no son suficientes para mejorar el resultado clínico, y mejoras adicionales pueden derivar sólo de una mejor comprensión de los mecanismos moleculares de estas enfermedades, y de la identificación de marcadores específicos que sin duda distinguir CSC de otras células tumorales. Por lo tanto, bajo este contexto, el
in vitro
aislamiento de las esferas proporciona una herramienta muy valiosa.
cuantitativa en tiempo real de reacción en cadena de polimerasa (QRT-PCR) es el método más sensible y preciso para cuantificar la expresión del ARNm de un solo gen en diversas condiciones experimentales, y requiere la normalización de los datos en contra de un gen de referencia, que normalmente debe tener una expresión muy estable en los diferentes procedimientos considerados experimentales [18]. La identificación de genes de mantenimiento específicos (HKG) es un requisito previo fundamental para estudiar el cambio relativo en la expresión de ARNm de un gen diana. El HKG seleccionado no debe ser co-regulados por el gen diana o influenciada por el procedimiento experimental. También debe expresarse en abundancia y tienen una variabilidad mínima. El método más común para la normalización de los niveles de expresión génica es comparar los niveles de mRNA del gen de interés para el gen de control endógeno. La normalización de los datos de QRT-PCR contra HKG azar puede resultar en el cálculo erróneo de la factor de normalización utilizado para comparar las condiciones experimentales, y por lo tanto ocultar las diferencias biológicas entre las muestras [19]. Entre los diferentes genes de referencia, beta-actina, gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa, o beta-tubulina son los más comúnmente utilizados, ya que son altamente expresado, necesario para la supervivencia, no regulada por las vías de señalización, y se sintetiza en todos los tipos de células nucleadas . Sin embargo, los recientes hallazgos demostraron que incluso la beta-actina, uno de los más comúnmente utilizados HKG, podría ser un control interno inadecuados [20,21].
análisis de QRT-PCR de la CSC ya se han realizado, pero, por nuestro conocimiento, ninguna justificación para la selección de la HKG todavía está disponible. En este estudio, se seleccionaron 15 de los más utilizados HKG para evaluar su estabilidad tanto en CSC y células nativas adherentes aisladas de rabdomiosarcoma humano (RS), osteosarcoma (OS), el sarcoma de Ewing (SE), carcinoma de mama (CM) y el carcinoma renal (RC). A través de la comparación de la variación del coeficiente y el uso de geNorm [22] y NormFinder [23] softwares Se realizó un análisis válido, reproducible y comparativo de la estabilidad de la HKG seleccionado.
Materiales y Métodos
líneas de células tumorales y las culturas nativas CSC
RS línea celular (RD), las líneas celulares del sistema operativo (MG-63, HOS, SAOS-2), línea de células ES (A-673), células BC línea línea celular (MDA-MB-231) y RC (ACHN), fueron adquiridos de la American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, EE.UU.), y se cultivaron en medio de Dulbecco modificado por Iscove (IMDM, Gibco), además de 20 U /ml de penicilina, 100 mg ml de estreptomicina, y suero bovino /10% inactivado por calor fetal (FBS) (IMDM completo) a 37 ° C en una atmósfera humidificada 5% de CO
2 atmósfera. También se utilizó un cultivo de ES primaria humana (ES4540), y se obtuvo a partir de una biopsia fresco de ES humanos, y se caracteriza, como se describe anteriormente [16]. La muestra ES4540 se recogió después de un consentimiento informado firmado y después de la aprobación del comité de ética Istituto Ortopedico Rizzoli (0033626 9 Nov 2011), de acuerdo con la Declaración de Helsinki. Brevemente, las muestras de tejido se sometieron a picado mecánico, seguido por la digestión enzimática, para obtener células individuales que fueron sembradas en IMDM completo hasta la formación de una monocapa.
Se obtuvieron células CSC como se describe anteriormente [16]. En pocas palabras, todos los cultivos de células tumorales nativo se mantuvieron en condiciones independientes de anclaje en DMEM: medio F12 con progesterona (20 nM), putrescina (10 mg /ml), selenito de sodio (30 nM), apo-transferrina (100 mg /ml) , y la insulina (25 mg /ml) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) en matraces de baja fijación (Nunc, Penfield, NY) (ensayo de formación de esferas). Obtuvimos la cultura CSC manteniendo el esferoide en condiciones independientes de anclaje en los medios de comunicación celular específica, la adición de los factores de crecimiento EGF y bFGF cada 3-4 días (dos veces a la semana). EGF humano fresco (20 ng /ml) y bFGF (10 ng /ml) (PeproTech, Rocky Hill, NJ) se añadieron dos veces a la semana hasta que las células comenzaron a crecer como agregados flotantes (esferas). culturas esferoides fueron amplificados mediante el tratamiento del cultivo primario CSC con tripsina, seguido por disociación mecánica suave, y por la re-plating suspensión de una sola célula para obtener el segundo cultivo de esferoides. La viabilidad se verificó mediante tinción con eritrosina. El porcentaje de células muertas fue baja (10-15% de células muertas). Sólo aquellas culturas que fueron capaces de formar esferas y que expresan marcadores se consideraron relacionados con las células madre.
Illumina secuenciación del genoma analizador de datos y el análisis
Un análisis de secuenciación profunda de la MG-63, HOS, y Saos-2 OS modelos celulares se realizó para comparar la expresión transcripcional global del CSC a las respectivas células nativas, con el fin de seleccionar un panel de HKG estable para el análisis de QRT-PCR. Brevemente, el ARN total se recogió a partir del lisado celular en tiocianato de guanidinio-fenol-cloroformo ácido [24]. El ARN total se cuantificó mediante Bioanalyzer (Agilent, Santa Clara, CA) siguiendo las instrucciones del fabricante. RIN (ARN Número Integridad) y la relación /A280 A260 del ARN total preparado eran 10, y más de 1,8, respectivamente. La biblioteca de moléculas de molde para la secuenciación de ADN de alto rendimiento fue convertido a partir del ARN total usando RNA TruSeq Sample Prep Kit v2 (Illumina, San Diego, CA), siguiendo el protocolo del fabricante. La biblioteca también se cuantificó con Bioanalyzer (Agilent), siguiendo las instrucciones del fabricante. La biblioteca (19:00) se sometió a agruparse amplificación en una sola celda v4 Lee flujo con un instrumento de generación de clúster (iluminación). La secuenciación se realizó en un Analizador de Genoma GAIIx para 70 ciclos usando regentes Ciclo de Secuenciación v4 (iluminación). genoma humano Build 19 (hg19) fueron descargados de la Universidad de California, Santa Cruz genoma navegador (http://genome.ucsc.edu/). Análisis de imágenes y llamadas de base se realizaron utilizando Off-Line Basecaller Software 1.6 (iluminación). Las lecturas fueron alineados utilizando ELAND v2 del Software 1.7 Casava con los conjuntos de datos de secuencias. Transcripción cobertura para cada locus del gen se calculó a partir del filtro de número total que pasa lee que asigna, por ELAND-ARN, a los exones. Estos análisis se realizaron utilizando parámetros por defecto. Los datos fueron vistos usando Genoma Studio Software (iluminación). El análisis avanzado para la cuantificación con el algoritmo de normalización cuantil se realizó utilizando el software Avadis NGS (Versión 1.5, Strand Científico Intelligence Inc., San Francisco, CA).
El aislamiento de ARN y síntesis de ADNc
Total se extrajo ARN de CSC y las células nativas de todos los diferentes histotypes incluidos en el estudio utilizando el NucleoSpin RNA II (Macherey-Nagel, Düren, Alemania). En la columna de la digestión con DNasa se llevó a cabo siguiendo las instrucciones del fabricante. La pureza del ARN total se cuantificó usando un espectrofotómetro Nanodrop (NanoDrop Technologies). El ARN total (0,5 g) se inverso-transcrito en cDNA en 20 l de volumen final, utilizando la transcriptasa inversa MuLV y el inhibidor de RNasa (Applied Biosystems, Foster City, Ca, EE.UU.). Primera línea de cDNA se sintetizó usando hexámeros aleatorios. Para cada muestra, se procesaron 3 réplicas biológicas.
QRT-PCR
QRT-PCR se realizó mediante el uso de un instrumento Light Cycler y el sistema de la biblioteca universal de la sonda (Roche Applied Science, Monza, Italia ). Sonda y cebadores fueron seleccionados mediante el uso de un software de diseño de ensayo basado en la web (ProbeFinder https://www.roche-applied-science.com), y se controlaron más utilizando Oligo Primer Software de Análisis. Sólo cebadores que abarca una unión exón-exón y la producción de un amplificado PCR con una longitud de entre fueron seleccionadas 70 y 150 pares de bases. Todos los cebadores diseñados fueron analizados por BLAST para verificar su especificidad (Centro Nacional de Información Biotecnológica). Todos los cDNA se diluyeron 1:10, y 10 l se utilizó como molde y se incluye en un 20 l de volumen total de reacción de QRT-PCR. El protocolo de amplificación fue: 95 ° C durante 10 min; 95 ° C durante 10 s, 60ºC durante 30 s, y 72 ° C durante 1 s durante 45 ciclos; 40 ° C durante 30 s. Cada ensayo incluye un espacio en blanco. La Tabla 1 presenta un resumen de todos los HKG, secuencias de cebadores y sondas incluidas en este estudio. Para la evaluación de la expresión de c-Myc (NM_002467.4), KLF4 (NM_004235.4), Nanog (NM_0248695.2) y OCT3 /4 (NM_002701.4), se utilizaron los siguientes cebadores: c-Myc-F 5'-gctgcttagacgctggattt-3 ', c-Myc-R-5' taacgttgaggggcatcg-3 ', la sonda 66; KLF4-F-5 'ccatctttctccacgttcg-3', KLF4 R-5'-agtcgcttcatgtgggagag-3 ', la sonda 7 ;. Nanog-F 5'-ATGCCTCACACGGAGACTGT-3 ', Nanog-R 5'-AGGGCTGTCCTGAATAAGCA-3, la sonda 69; OCT3 /4-F 5'-CTTCGCAAGCCCTCATTTC-3 ', OCT3 /4-R 5'-GAGAAGGCGAAATCCGAAG-3', la sonda 60. Para el propósito de la normalización, la expresión relativa de KLF4, c-Myc, Nanog y OCT3 /4 se normalizaron por la ACTB gen de referencia o de la media geométrica de YWHAZ y GAPDH para CSC y las células nativas de MG-63, o para la media geométrica de PPIA y HMBS para CSC y las células nativas de ACHN y MDA-MB-231. La expresión relativa de los marcadores de células madre se calculó utilizando el modelo ΔΔCt [25].
NormFinder análisis
NormFinder programa es un applet de VBA [23] basado en un enfoque de estimación de la varianza , que ocupa la HKG candidato basado en su evaluación de la estabilidad, y asigna un valor a cada una estabilidad de genes candidatos usando un enfoque basado en modelos. De acuerdo con los requisitos NormFinder, los valores de Ct se transformaron en cantidad relativa, utilizando el valor de Ct más bajo como calibrador. De acuerdo con el análisis, el valor más bajo de estabilidad se ocupa el primer lugar. Se agruparon todos los datos en 3 grupos diferentes: 1) todos los datos del CSC de diferentes tumores; 2) todos los datos de las células nativas de diferentes tumores; 3) todos los datos de diferentes tumores con CSC y células nativas agruparon juntos. Para el tercer grupo de datos, además de CSC y células nativas obtenidos a partir de todos los tumores agrupados juntos, también consideramos CSC y células nativas obtenidas del tipo de tumor individual, de sarcoma o de carcinoma. Todos los resultados se obtuvieron a partir de 3 series de repeticiones
GeNorm análisis
GeNorm v 3.0 [22] disponible en qbase + [26] (Biogazelle, Universidad de Gante, Bélgica, http:. //Www. .qbaseplus.com) se utilizó para evaluar la estabilidad de candidato HKG. GeNorm calcula toda la posible variación pairwise promedio entre los genes candidatos y proporciona una medida de la estabilidad de la expresión (M) de cada gen. Un M-valor por debajo de 1,5 indica HKG estable. La referencia de genes candidato con el menor valor M se considera que tiene la expresión más estable. GeNorm ocupa genes candidatos de referencia sobre la base de su estabilidad de expresión, y la realización de exclusión por etapas del gen con la más alta M-valor (el gen expresado menos estable), y vuelve a calcular M-valores para los restantes genes. Utilizamos también GeNorm para verificar si una sola HKG es suficiente para una normalización adecuada. De hecho, GeNorm proporciona el número óptimo de genes de referencia necesarios para la normalización precisa. los valores de V por debajo del valor de corte de 0,15 indican el número óptimo de los genes necesarios para la normalización de datos. Al igual que en el análisis realizado con NormFinder, agrupamos todos los datos y los resultados en 3 grupos diferentes. Todos los resultados se obtuvieron de 3 series de repeticiones.
Coeficiente de análisis de la variación
estabilidad de la expresión de genes evaluadas por el coeficiente de variación (CV) se calculó dividiendo la desviación estándar (SD) de umbral ciclos (Ct) por el valor medio de CT. Al igual que en el análisis realizado con NormFinder y GeNorm, agrupamos todos los datos en 3 grupos diferentes, y los resultados se obtuvieron a partir de 3 series de repeticiones.
Rango de agregación
Los análisis realizados por la tres métodos descritos mostraron algunas diferencias en el grado de estabilidad de la HKG. Por lo tanto, hemos identificado los genes más estables teniendo en cuenta el valor más bajo de la media matemática del método NormFinder, geNorm y CV filas para cada gen.
El análisis estadístico
El análisis estadístico se realizó con Statview ™ software 5.0.1 (SAS Institute Inc., Cary, NC). Para la caracterización de la CSC y las células nativas de MG-63, MDA-MB-231 y ACHN, se consideraron los datos que no se distribuye normalmente, y se utilizaron test no paramétrico de Mann-Whitney. Los resultados se presentan como media ± error estándar de la media (SEM). desviación estándar (DE) de los valores de umbral de ciclo delta (Ct) se calculó como la desviación estándar combinada (SDpooled). HKG expresión variación en CSC y células nativas se evaluó con la prueba de rangos con signo de Wilcoxon pareada. Para todos los análisis, las diferencias se consideraron significativas con un
p-
valores ≤ 0,05.
Resultados
control de la calidad del ARN y caracterización de CSC
establecieron cultivos esfera de las líneas celulares disponibles en el mercado a partir de 3 histotypes diferentes sarcoma y 2 de carcinoma (MG-63 para el sistema operativo, RD para RS, a-673 para ES, MDA-MB-23 de C., y ACHN para RC), y de una biopsia ES fresco (ES4540). El análisis espectrofotométrico confirmó la pureza de las muestras, con un A
260 /
relación 280 de 2,08 ± 0,06, lo que indica RNA puro libre de proteínas, y una relación de A
260/230 de 1,98 ± 0,21, lo que indica que el ARN total fue de fenol y libre de etanol.
las características stemness similar para todas las culturas CSC incluidos en este estudio se caracterizaron anteriormente [16,27], con la excepción de cscMG-63, cscMDA- MB-231, y cscACHN para los que la capacidad de crecimiento en forma de agregados (figura 1) flotante, y la expresión de ARNm de KLF4, c-Myc, Nanog, y /4 marcadores stemness Oct3 [28] se confirmaron aquí.
imágenes representativas de las células nativas adherentes y esferas flotantes CSC observadas por microscopio óptico invertido para las diferentes líneas celulares (barra de escala 100 micras, panel izquierdo), y la expresión de genes de marcadores de células madre de QRT-PCR (panel derecho). La normalización de ACTB. Para cscMG-63, c-Myc ** p = 0,0019, p = ns KLF4, Nanog ** p = 0,0010, OCT3 /4 * p = 0,0265. Para cscMDA-MB-231, c-Myc ** p = 0,0011, KLF4 * p = 0,0130, Nanog ** p = 0,0011, OCT3 /4 * p = 0,0325. Para cscACHN, c-Myc p = ns, KLF4 * p = 0,0130, Nanog * p = 0,0130. Para adherente ACHN, OCT3 /4 * p = 0,0130. (N = 6-12) guía empresas
En particular, en cscMG-63 encontramos una tendencia de aumento de la expresión de KLF4. (Figura 1, n = 12; p = ns), y una significativamente mayor expresión de c-Myc (** p = 0,0019), Nanog (** p = 0,0010), y OCT3 /4 (* p = 0,0265). CSC de MDA-MB-231 altamente exprese todos los marcadores stamness que el cultivo adherente (Fig 1; n = 6; KLF4 * p = 0,0130; c-Myc ** p = 0,0011; Nanog ** p = 0,0011; OCT3 /4 * p = 0,0325), mientras que los cultivos de la esfera de ACHN expresaron niveles consistentes de mRNA para KLF4 y Nanog (Fig 1; n = 6; KLF4 * p = 0,0130; Nanog * p = 0,0130), y ninguna expresión diferente para c-Myc . En cscACHN, la expresión de la OCT3 /4 marcador es más baja que la cultura nativa adherente (Fig 1; * p = 0,0130). Los genes se normalizaron por stemness ACTB, uno de los HKG más comúnmente utilizado.
perfil de expresión de genes candidato HKG
Se seleccionaron quince genes candidatos de referencia (Tabla 1) a través del análisis de la literatura encuesta sobre los estudios en normal células madre y las células tumorales con el análisis de QRT-PCR.
se seleccionaron aquellos genes que pertenecen a diferentes clases funcionales o caminos con el fin de reducir la probabilidad de incluir en los genes co-regulados de análisis. La transcripción de perfiles de los genes seleccionados se analizó mediante secuenciación preliminar Illumina Genome Analyzer. El análisis de secuenciación profunda mostró que los genes de referencia putativos se expresaron de forma estable, con la excepción de G6PD (Tabla 2, Figura 2A).
(A) Mapa de calor que muestra la expresión relativa de los genes seleccionados en células nativas y CSC de MG-63, HOS, y SAOS-2. (SEGUNDO). el perfil transcripcional de los valores de ciclo umbral (Ct) de genes candidatos HKG en CSC y líneas de células nativas. Las cajas representan los cuartiles inferior y superior del rango del umbral ciclo con la mediana indicado, las barras verticales representan el 10
º y 90
º percentiles. En ambas líneas celulares adherentes CSC y, 18S rRNA fue el gen más altamente expresado (menor valor de Ct), mientras que el gen G6PD era menos expresada (Ct valor más alto).
utiliza sólo MG-63 como representante de la histotype OS para el siguiente análisis de QRT-PCR para confirmar los datos obtenidos por secuenciación profunda. Para comparar los diferentes niveles de ARNm de transcripción se utilizaron los valores de umbral de los ciclos (Ct). valor Ct es la intersección entre una curva de amplificación y una línea de umbral, y está inversamente correlacionado con la cantidad de gen diana presente en la reacción de PCR [29]. Los 15 genes candidatos de referencia exhiben una amplia gama de nivel de expresión. La distribución de los valores de la mediana y el percentil Ct para cada gen se muestra en el gráfico de los bloques de la figura 2B. genes de referencia se expresan en menos CSC comparación con las células nativas. Las menores diferencias en la expresión génica entre CSC y líneas de células nativas, expresan como Ct, se detectaron para B2M, TBP y SDHA, mientras que el más alto? Ct se calcularon para ACTB, TUBB y PGK1 (Tabla 3). Mediante la realización de la prueba de rangos con signo de Wilcoxon pareada para cada gen para evaluar la diferencia entre CSC y células naturales obtenidos a partir de las mismas células de origen, se encontró una diferencia significativa en la expresión HKG entre el CSC y células nativas alrededor de la mitad de la HKG examinada ( Tabla 3).
Determinación de la estabilidad de la expresión de genes housekeeping
estabilidad de la expresión HKG se evaluó mediante el uso de NormFinder VBA applet, el software GeNorm, y calculando y comparando el coeficiente de variación ( CV) en tres grupos diferentes: en (1) CSC o (2) células nativas, con el objetivo de identificar los genes más estables dentro de los subtipos específicos de células, y (3) en las células CSC y nativos agrupados, con el objetivo de identificar los genes más estables para ser considerado como genes de referencia para la comparación de la expresión de genes entre CSC y células nativas.
los valores de estabilidad para los valores NormFinder y M para GeNorm son parámetros de estabilidad que se correlacionan inversamente con la expresión la estabilidad de la HKG. Todos los 15 genes candidatos de referencia tenían un valor M menor que el valor umbral de 1,5 (Tabla 4), lo que indicaba que todos pueden ser considerados como aceptables en términos de estabilidad [22].
1) el HKG más estable de CSC. Utilizando el NormFinder VBA applet, el 3 más estable HKG resultó GAPDH, PGK1 y HMBS (de la primera a la tercera estable), mientras que el menos estable eran Rpl13a, B2M y GUSB. El uso de software GeNorm, identificamos YWHAZ, GAPDH y PDD como el HKG más estable, mientras que los genes eran menos estables ACTB, B2M y GUSB. CV método también subrayó que el uso de ACTB debe evitarse, mientras que, al igual que para GeNorm y analiza NormFinder, se recomienda el uso de PGK1 y YWHAZ. Una comparación de la clasificación producida por los tres enfoques reveló diferencia según el tipo de algoritmo aplicado. El número mínimo de genes de referencia necesarios para la normalización se determinó por cálculo GeNorm de variación pairwise (coeficiente de variación, V) entre un determinado número de genes y la inclusión de un gen adicional, y el número óptimo de genes de referencia se calculó como 3 (V3 /4 0,114, Fig 3A). En conclusión, para el análisis de la expresión génica de ARNm aislado de CSC, el factor de normalización óptima debe ser calculado como la media geométrica de los objetivos de referencia YWHAZ, GAPDH y PGK1.
El número mínimo de genes necesarios para la normalización de datos se evaluó por la variación de pares (Vn /n 1) en (a) CSC, (B) células nativas, (C) en las líneas celulares nativas CSC y de todos los tumores, (D) de sarcoma y (C) a partir de carcinomas. Un coeficiente de variación (V) por debajo de 0,15 indica el número óptimo de genes necesarios para la normalización de datos. V2 /3 & lt; 0,15 indica que se requieren 2 genes para la normalización de datos
2) El HKG más estable de células adherentes nativas.. NormFinder análisis reveló que el 18S rRNA, TBP, y ppia eran los tres mejores HKG, mientras que Rpl13a, G6PD, y ACTB eran peores en la estabilidad de la expresión. Del mismo modo, GeNorm identificó PPIA y 18S rRNA como los dos HKG más estable, seguido de GAPDH, mientras que los genes menos estables, en orden desde el último clasificado, eran G6PD, RPL13A y ACTB. El método CV sugirió HMBS, PDD y YWHAZ como los tres genes más estables. El cálculo GeNorm del coeficiente de variación V sugirió que el número óptimo de genes de referencia fue de 2 (V2 /3 0,146; Figura 3B), y la adición de un tercer gen de referencia dio como resultado un pequeño efecto sobre la normalización (por debajo del valor de corte de 0,15). En conclusión, para la célula nativa, de acuerdo con los análisis, el factor de normalización óptimo debe calcularse como la media geométrica de PPIA y TBP.
3) Finalmente se realizó el análisis de CSC y células agrupadas nativas en toda tumores (a), en el sarcoma (B) y el carcinoma de (C).
(3A) en CSC y las células nativas de todos los tumores, NormFinder identificó GAPDH, TBP, y PPIA como los tres HKG más estable, mientras ACTB, RPL13A y GUSB fueron los menos estables. PPIA y GAPDH también fueron confirmados por análisis GeNorm, junto con 18S rRNA. Una vez más, ACTB fue el último gen en la estabilidad para el análisis GeNorm, junto con B2M y G6PD. La evaluación CV sugirió TBP, B2M y SDHA (Tabla 4), mientras que ACTB, TUBB y 18S rRNA fueron los menos estables. GeNorm recomienda el uso de 4 HKG para el análisis de la expresión génica precisa (V & lt; 0,15 cuando se compara un factor de normalización sobre la base de los 4 o 5 objetivos más estables; figura 3C). En consecuencia, el factor de normalización debe ser calculado como la media geométrica de TBP, ppia, HMBS, y YWHAZ o GAPDH.
(3B) En CSC y células nativas de sarcoma, el software de GAPDH NormFinder identificado, YWHAZ y 18S rRNA como los genes más estables, en lugar de G6PD, RPL13A y B2M fueron los menos estables. GAPDH y YWHAZ fueron identificados como el mejor HKG también por el análisis GeNorm, mientras que ACTB y Rpl13a estaban entre los últimos clasificados genes. El método CV mostró que HMBS, TBP, y SDHA tenían la mejor posición de categoría (Tabla 5). El número óptimo de blancos de referencia es 2 (V2 /3 0,143, figura 3D). En conclusión, el factor de normalización óptima puede ser calculado como la media geométrica de los objetivos de referencia YWHAZ y GAPDH.
(3C) El análisis de la estabilidad en el carcinoma HKG reveló que PPIA, HMBS y Rpl13a fueron el HKG más estable para NormFinder. GeNorm también confirmó PPIA y RPL13A objetivos como más estables por GeNorm, seguido de 18S rRNA, mientras que el método CV sugirió B2M, TBP y G6PD (Tabla 5). El cálculo del coeficiente de GeNorm V sugirió que 2 HKG son suficientes para la normalización (V2 /3 0,084, Fig 3E). En conclusión, el factor de normalización óptima en este caso debe ser calculado como la media geométrica de dos de los siguientes genes, ppia, HMBS o Rpl13a, que tienen el mismo valor de la clasificación global.
Validación de la HKG identificado en el CSC modelo
en la evaluación de la expresión génica, el uso de subóptima HKG puede generar resultados erróneos o puede ocultar una diferencia en la expresión génica. Esto es particularmente importante para los genes que cambian ligeramente entre dos poblaciones de células, como CSC y las células nativas.
Se analizó la expresión de los genes stemness c-Myc, Klf4, Nanog, y Oct3 /4 que eran previamente normalizado a ACTB (figura 1), con las células de alto rango HKG para el CSC y nativas identificadas, en el sarcoma y carcinoma, respectivamente (GAPDH y YWHAZ para el sarcoma, y ppia y HMBS para el carcinoma). Algunos de los genes relacionados con STEM considerados mostraron una robustez mejorada del análisis estadístico realizado con la normalización con el HKG más estable, en relación con ACTB. En particular, como se muestra en la figura 4, se encontró que la normalización de Nanog a la media geométrica de la HKG más estable resultó en *** p = 0,0007 para cscMG-63 y ** p = 0,0043 para cscACHN, mientras que con la normalización ACTB obtuvimos ** p = 0,0011 y 0,0130 * p =, respectivamente. En cscMG-63, por cMyc obtuvimos *** p = 0,0003 con el nuevo análisis, en lugar de ** p = 0,0019 con la normalización de ACTB.
El efecto de la normalización de la expresión génica con óptima era HKG investigado en CSC y células nativas de MG-63 y ACHN. (A) Para la línea celular de osteosarcoma, la expresión de los marcadores de células madre Nanog y CMYC se evaluaron y se normalizaron a la media geométrica de GAPDH y YWHAZ. *** P = 0,0007 para Nanog, *** p = 0,0003 para el c-Myc. (B) Para la línea celular de carcinoma Ranal, la expresión de Nanog y cMyc se normalizó a la media geométrica de ppia y HMBS. ** P = 0,0043 para Nanog. (N = 6).
Discusión
La evolución del concepto de CSC ha llamado mucho la atención, y la caracterización de CSC ha abierto el camino a nuevos derivados de prospectiva para las terapias contra el cáncer. CSC son un subconjunto minoría de las células iniciadoras de tumores que participan en diversas fases del proceso de pro-tumorigénico, desde la iniciación del tumor [30], a la quimiorresistencia [31] y la recaída [32]. CSC puede ser aislado de las líneas celulares y muestras de tejido con el método de sistema de esfera [12], en base a la capacidad de los CSC a crecer como colonias flotantes esféricas en condiciones independientes de anclaje. Hasta la fecha, esto se considera un método muy valiosa para obtener cultivos enriquecidos con CSC. Recientemente, hemos aislado CSC de los sarcomas músculo-esquelético, tanto de la línea celular y la biopsia fresca [16,27].