Extracto
La hipoxia es un factor adverso en el cáncer de cuello uterino, y la expresión de genes relacionados con la hipoxia podría ser un biomarcador de gran alcance para la identificación de los tumores agresivos hipóxicas. La transcripción inversa PCR cuantitativa (RT-qPCR) es un método valioso para estudios de expresión de genes, pero los genes de referencia adecuados para la normalización de datos que son independientes del estado de hipoxia y los parámetros clínicos de tumores de cuello uterino se carece. En el presente trabajo, que tuvo como objetivo identificar los genes de referencia para los estudios de RT-qPCR de la hipoxia en el cáncer cervical escamoso. A partir de 422 genes candidatos de referencia seleccionados de la literatura, se utilizó Illumina basadas en matrices perfiles de expresión para identificar 182 genes no afectadas por la hipoxia en el cáncer de cuello de útero, es decir, los genes regulados por la hipoxia en ocho líneas celulares de cáncer de cuello uterino o que correlacionan con el contraste dinámico hipoxia asociada parámetro de resonancia magnética -Mejora a
Brix en 42 pacientes, fueron excluidos. Entre los 182 genes, nueve candidatos (
CHCHD1
,
GNB2L1
,
IPO8
,
LASP1
,
RPL27A
,
RPS12
,
SOD1
,
SRSF9
,
TMBIM6
) que no estaban asociados con el volumen tumoral, estadio, compromiso de los ganglios linfáticos o progresión de la enfermedad en los datos de la matriz de 150 pacientes, se seleccionaron para su análisis por RT-qPCR. geNorm y NormFinder análisis de los datos de RT-qPCR de 74 pacientes identificados
CHCHD1
,
SRSF9
y
TMBIM6
como el conjunto óptimo de genes de referencia, con una expresión estable tanto en general como en todos los subgrupos de pacientes con diferentes estados de hipoxia (A
Brix) y los parámetros clínicos. La idoneidad de los tres genes de referencia fueron validados en estudios de los genes de hipoxia inducida por
DDIT3
,
ERO1A
, y
STC2
. Después de la normalización, los datos de RT-qPCR de estos genes mostraron una correlación significativa con la expresión Illumina (P & lt; 0,001, n = 74) y A
Brix (P & lt; 0,05, n = 32), y el
STC2
datos se asociaron con el resultado clínico, de acuerdo con los datos Illumina. Por lo tanto,
CHCHD1
,
SRSF9
y
TMBIM6
parecen ser los genes de referencia adecuados para el estudio de la expresión de genes relacionados con la hipoxia en escamosas muestras de cáncer de cuello uterino por RT-qPCR. Por otra parte,
STC2
es un biomarcador de pronóstico hipoxia prometedora en el cáncer de cuello de útero
Visto:. Fjeldbo CS, Aarnes EK, MALINEN E, Kristensen GB, Lyng H (2016) Identificación y validación de genes de referencia por RT-qPCR estudios de hipoxia en el cáncer cervical escamosas pacientes. PLoS ONE 11 (5): e0156259. doi: 10.1371 /journal.pone.0156259
Editor: Cristiano Schönbach, Universidad Nazarbayev, KAZAJSTAN
Recibido: 23 Noviembre 2015; Aceptado: 11-may de 2016; Publicado: 31 de mayo de 2016
Derechos de Autor © 2016 Fjeldbo et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. Todo relevante los datos están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y. Todos los archivos de expresión de genes Illumina están disponibles en la base de datos GEO (GSE75034)
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el Consejo de Investigación de Noruega, Grant número 226.120 /O30, (http://www.forskningsradet.no /es /Home_Page /1177315753906). La fuente de financiación no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
la hipoxia tumoral es un factor principal que conduce a la resistencia a la radioterapia, la metástasis y mal pronóstico de muchas enfermedades malignas como el cáncer de cuello uterino [1-5]. Para la medición relacionadas con la hipoxia-genes variaciones de expresión en muestras de pacientes, inversa de la reacción en cadena de polimerasa cuantitativa transcripción (RT-qPCR) es un método valioso debido a su alta sensibilidad, flexibilidad, bajo coste y facilidad de uso [6-8]. En el análisis de RT-qPCR, es importante elegir genes de referencia óptimos para la normalización de datos para eliminar no biológico variación, inducida experimentalmente a partir de los datos. Para la normalización precisa y fiable, se recomiendan múltiples genes de referencia [6,7,9]. Determinación de los genes de referencia para los estudios clínicos es particularmente difícil, debido a que la estabilidad de los genes tiene que ser verificada en los tejidos objeto de investigación ya través de fenotipos tumorales y los parámetros clínicos.
El trabajo previo sobre los genes de referencia en el cuello uterino tiene centrado en diferentes etapas de la carcinogénesis cervical mediante la evaluación de los genes candidatos a través de virus del papiloma humano (VPH) negativos y positivos lesiones [10], ya través de las muestras normales, precancerosas y cancerosas [11-13]. Para nuestro conocimiento, no se ha informado de genes de referencia adecuados para el estudio de la expresión génica por hipoxia asociada en biopsias de cáncer de cuello uterino. Muchos candidatos se han sugerido para este fin a partir de estudios experimentales en líneas de células se cultivan en concentraciones bajas de oxígeno [9,14-17], pero sólo un estudio sobre el cáncer de cabeza y cuello han utilizado el estado de hipoxia de muestras clínicas en la validación de tales candidatos [18]. Se requiere del lugar del tumor evaluación específica [9,15] y debe incluir a las asociaciones a las características clínicas y los resultados, además de estado de hipoxia.
La mayoría de los estudios en busca de genes de referencia comienzan con un panel limitado de aproximadamente 8-25 candidatos seleccionado sobre la base de genes comúnmente usados en la literatura, que no son necesariamente los genes más expresados de forma estable. Utilizando los datos de expresión de todo el genoma para una evaluación inicial de los candidatos puede ser útil para identificar el panel más prometedor de los genes para probar en un ensayo de RT-qPCR [19-24]. En el presente estudio, se utilizó este enfoque para identificar los genes de referencia adecuados para los estudios de hipoxia en biopsias de cáncer de cuello uterino. Una revisión exhaustiva de la literatura identificó 422 genes de referencia potenciales, de los cuales 410 candidatos estaban presentes en nuestros conjuntos de datos y se sometieron a una evaluación inicial, el uso de perfiles de expresión génica de 150 pacientes con cáncer de cuello uterino y ocho líneas celulares de cáncer de cuello uterino. Nueve genes, no asociadas a los parámetros clínicos o hipoxia, fueron evaluados con RT-qPCR, y tres de ellos fueron seleccionados como el conjunto óptimo de genes de referencia. La idoneidad de los genes de referencia para la normalización de datos se confirmó en estudios de tres genes de hipoxia inducida conocidos en relación con el estado de la hipoxia tumoral y el resultado clínico.
Materiales y Métodos
Ética declaración
El estudio fue aprobado por el Comité regional de Medicina y Salud Ética de la Investigación en el sudeste de Noruega (REC S-01129), y el consentimiento informado por escrito se obtuvo de todos los pacientes.
cohortes de pacientes y muestras de tumor
Totally 160 pacientes con carcinomas localmente avanzados de células escamosas del cuello uterino, de forma prospectiva reclutados en nuestro protocolo de quimiorradioterapia en el Norwegian Radium hospital 2001-2012, se incluyeron (Tabla 1). Illumina perfiles de expresión génica existían para 150 pacientes (Illumina cohortes, Tabla 1) y se utilizaron para seleccionar los genes candidatos de referencia para las pruebas con RT-qPCR (Figura 1). Para 42 de estos pacientes, el contraste dinámico hipoxia asociada mejorado (DCE) de resonancia magnetico (MR) de parámetros de imagen A
Brix [25] estaba disponible y se utiliza como medida del estado de la hipoxia tumoral. Diez pacientes independientes (RT-qPCR cohorte 1) se utilizaron para la evaluación previa de los nueve genes candidatos. Por otra parte, 74 de los 150 pacientes de la cohorte Illumina (RT-qPCR cohorte 2) se utilizaron para su posterior evaluación y validación de los candidatos. Además, las biopsias de 22 pacientes ocho independientes (2-4 biopsias de cada paciente) se utilizaron para evaluar la heterogeneidad intra-tumoral (heterogeneidad de cohortes).
El volumen del tumor y la presencia de la linfa patológica se evaluaron los nodos de pre-tratamiento de las imágenes de RM. Uno a cuatro biopsias de tumores (aproximadamente 5 x 5 x 5 mm) fueron tomados al momento del diagnóstico, inmediatamente se congelaron rápidamente y se almacenaron a -80 ° C. Todos los pacientes recibieron radiación externa de 50 Gy en el tumor primario y áreas electivas, 45 Gy a la pelvis restantes, y adicional 14 Gy a los ganglios linfáticos patológicos. Esto fue seguido por la braquiterapia de 25 Gy. simultánea de cisplatino (40 mg /m
2) se administró semanalmente en un máximo de 6 cursos de acuerdo a la tolerancia. Los pacientes fueron seguidos de acuerdo con el procedimiento estándar, como se describe [25].
Cultivo de células
Ocho líneas celulares de cáncer cervical humano de la American Type Culture Collection se utilizaron para evaluar los genes sensibles a la hipoxia ; HeLa, SW756, C-33 A, C-4I, ME-180, HT-3, SiHa y CaSki. Las líneas celulares fueron autenticadas por un perfil de STR /ADN usando PowerPlex 21 (Promega, Madison, WI) por Eurofins Genómica (Ebersberg, Alemania). Las células se cultivaron a 37 ° C en una atmósfera humidificada 5% de CO
2 incubadora en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) con GlutaMAX (Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA) suplementado con 100 U /ml de penicilina /estreptomicina (Sigma , St. Louis, MO) y suero bovino fetal al 10% (FBS, Gibco). Las células fueron probados rutinariamente para
Mycoplasma
infección. Las células se cultivaron durante 24 horas en placas de 10 cm de plástico (1-1,8 x 10
6 células para obtener ~ 4 x 10
6 células después de 48 horas de incubación) antes de la exposición a hipoxia (0,2% de O
2, 5% de CO
2) o de normoxia (95% de aire, las condiciones de 24 horas a 37 ° C 5% de CO
2). Se utilizó una cámara de Invivo2200 (Ruskinn Technology Ltd., Bridgend, Reino Unido) para el tratamiento de la hipoxia.
análisis
La expresión génica
aislamiento de ARN.
El ARN total se aisló a partir de células líneas utilizando RNeasy MiniKit (Qiagen, Germantown, MD) y a partir de muestras congeladas usando reactivo Trizol (Life Technologies) (cohorte Illumina, RT-qPCR cohorte 2) o miRNeasy MiniKit (Qiagen) (RT-qPCR cohorte 1, cohorte heterogeneidad). Todos los especímenes clínicos tenían células tumorales más de 50% en hematoxilina y eosina secciones manchadas, derivado de la parte central de la biopsia. Aparte de la cohorte de la heterogeneidad, ARN de diferentes biopsias del mismo tumor se reunió y la concentración de ARN se midió utilizando un espectrofotómetro NanoDrop 2000 (Thermo Scientific, Waltham, MA). La integridad del ARN se confirmó por Bioanalyzer (Agilent Technologies, Palo Alto, CA). Todas las muestras tenían un número de integridad del ARN (RIN) en el rango de 3,6 a 9,0 con una mediana de 7,1 RIN.
expresión génica mediante matrices de perlas Illumina.
En todo el genoma de perfiles de expresión génica, Illumina se usaron matrices de perlas 48K con aproximadamente 48.000 transcripciones; HumanWG-6 v3 (pacientes, las líneas celulares) y V4 (líneas celulares) HumanHT-12 (Illumina Inc., San Diego, CA). Los datos de los pacientes forman parte de los conjuntos de datos utilizados en trabajos anteriores [25]. se sintetizó cRNA, etiquetado, y se hibridó con los arrays. Extracción de señales y la normalización cuantil se realizaron utilizando el software proporcionado por el fabricante (iluminación Inc), y se utilizaron los datos de log2-transformado en los análisis. Los datos fueron depositados en el ómnibus de la expresión génica (GEO) de bases de datos (GSE75034).
expresión génica mediante RT-qPCR.
Para los análisis de RT-qPCR, el Fast Real-Time PCR System 7900HT (Applied Biosystems, Foster City, CA) se aplicó, y las curvas de amplificación se analizaron utilizando el Software v2.3 SDS (Applied Biosystems). El (# AM1906, Ambion, Austin, TX)
™ Kit libre de ADN se utilizó para eliminar el ADN genómico, de acuerdo con la descripción del fabricante. La transcripción inversa se realizó por el de alta capacidad de cDNA de transcripción inversa kit (Applied Biosystems), que incluye cebadores aleatorios, utilizando 2000 ng de ARN tratado con DNasa en una reacción de 20 microlitros. 1 cDNA l se amplificó utilizando el TaqMan Fast PCR Universal Master Mix (2x) y Custom matriz TaqMan placas de 96 pocillos Fast con ensayos secos-down TaqMan Gene Expression (Applied Biosystems), o ensayos TaqMan un solo tubo y placas de 96 pocillos Fast . parámetros de termociclado fueron como se describe en el protocolo de matriz personalizada, o para los ensayos de un solo tubo: 20 s a 95 ° C (activación de la enzima), 40 ciclos térmicos de 1 s a 95 ° C (desnaturalización) y 20 s a 60 ° C ( hibridación y extensión). ensayos TaqMan para referencia genes candidatos y los tres genes de hipoxia inducida por evaluados en este estudio se proporcionan en la Tabla 2. Se seleccionaron ensayos TaqMan inventariados Sólo pre-desarrollados. Para la evaluación de los ensayos TaqMan, los tamaños de los productos de PCR se determinaron mediante electroforesis en gel, utilizando un ScreenTape D1000
® Station (Agilent Technologies). Para los tres genes seleccionados de referencia (véase más adelante) y los tres genes de hipoxia inducida, las eficiencias de PCR se determinaron a partir de curvas de dilución de cDNA y mostraron eficacias de reacción lineales (S1) Fig.
Todas las muestras fueron por duplicado, y la media del ciclo cuantificación (C
q) para cada muestra se utilizó en los análisis. Las muestras con una media de C
q & gt; 37 o la desviación estándar & gt; 0,4 fueron excluidos. Minus inversa de la transcriptasa controles se probaron para el ADN genómico residual para todos los ensayos TaqMan, y la contaminación se evaluó por los controles sin plantilla y sin ARN en la síntesis de ADNc. Todos los controles negativos tenían indeterminada C
q. El nivel de expresión de un gen diana se analizó utilizando el comparativo C
q-método [26], la normalización de los C
q-valores del gen diana a un factor de normalización calculado como el promedio de C
q- valores de los genes de referencia; ? C
q, gen = C
q, gene- (C
q,
CHCHD1
+ C
q,
SRSF9
+ C
q ,
TMBIM6
) /3 para los genes de referencia identificados en este estudio (ver más abajo).
Estadísticas
El geNorm [6] y [7] se utilizaron algoritmos NormFinder para evaluar la estabilidad de los genes candidatos de referencia. El algoritmo geNorm se basa en el principio de que la relación de expresión de dos genes de referencia ideales es idéntico en todas las muestras. Para cada candidato, una medida de la estabilidad M se calcula como la variación media pairwise del gen con todos los otros candidatos; es decir, la desviación estándar de la media de los coeficientes de expresión log2-transformado entre los genes. Los genes con bajos valores M se considera que son más estables. Los genes se clasifican por la exclusión progresiva de este candidato menos estable y nuevo cálculo de M-valores para el resto de genes se lleva a cabo hasta que los dos genes más estables se dejan. Para determinar el número de genes de referencia para incluir la normalización fiable, la variación de pares entre dos factores de normalización secuenciales (V
n /n + 1) se calculó para todas las muestras, y el valor de corte para la inserción de un gen adicional fue ajustado a 0,15 [6]. NormFinder es un enfoque basado en el modelo de ANOVA, y se utilizó para la estimación de la variación global de cada gen candidato y su variación a través de los subgrupos de pacientes, teniendo en cuenta tanto la variación intra e intergrupales. Las variaciones estimadas se combinan en un valor de estabilidad para cada gen, donde un valor bajo indica la expresión más estable [7].
correlación de rangos de Spearman se utilizó para estimar las asociaciones entre las variables continuas, se utilizó U de Mann-Whitney U test para comparar las diferencias en los niveles de expresión génica entre los grupos, y la COX riesgo proporcional (PH) se realizó un análisis univariante para evaluar la relación de los genes candidatos de referencia para el resultado clínico. El criterio de valoración clínica fue la supervivencia libre de progresión (SLP) para el seguimiento de hasta 5 años. SLP se define como el tiempo desde el diagnóstico hasta la muerte relacionada con la enfermedad o el primer caso de recaída. Muertes dentro de 2 años después de la inclusión se consideraron como relacionada con la enfermedad a menos que otra de las causas fue documentada. Los pacientes fueron censurados en su última cita o a los 5 años, y el estado se evaluó en el 3 de octubre de 2014. Un modelo de riesgo competitivo se utilizó para calcular la incidencia acumulada de progresión de la enfermedad, con la muerte por otras causas que el cáncer de cuello del útero como una competencia evento. Once de los 160 pacientes incluidos murió por otras causas sin experimentar recurrencia durante el seguimiento. Dado que alrededor de un tercio de los pacientes experimentaron recurrencia, las curvas de incidencia acumulada se compararon entre los 1/3 de la cohorte con la más alta expresión de genes y 2/3 con la expresión más bajo. Se utilizó la prueba de Gray para evaluar las diferencias entre las curvas. El nivel de significancia fue del 5% a menos que se indique otra cosa, y todos los valores de p son dos caras.
Se realizaron todos los análisis con R [27] la versión 3.1.1. Para los análisis de geNorm, las funciones de los paquetes ReadqPCR y NormqPCR read.qPCR () y selectHKs () [28] se aplicaron. Para el NormFinder analiza la función NormFinder () proporcionada por el Laboratorio de Diagnóstico Molecular, Departamento de Medicina Molecular de la Universidad de Aarhus Hospital de Skejby, se utilizó Dinamarca, y los análisis de riesgo de la competencia se lleva a cabo con la función cuminc () en el paquete cmprsk [29].
resultados y Discusión
la selección de genes candidatos de referencia a partir de los perfiles de expresión basadas en matrices
para identificar los genes expresados de forma estable en muestras de cáncer de cuello uterino, la selección de los candidatos se limita a los genes que han sido reportados previamente como genes de referencia en la literatura [10,11,13,18,30-35], como nuevos candidatos de referencia basado en meta-análisis de conjuntos de microarrays o secuenciación de ARN de datos a gran escala [19-23], o presentes en la placa de control endógeno humano TaqMan Express (Applied Biosystems). Esto resultó en una lista de 422 genes diferentes, para los cuales 410 estaban presentes en la matriz Illumina utilizado en el presente estudio (Fig 1, S1 Tabla), representada por 631 sondas diferentes.
Los candidatos más probables entre la 410 genes fueron identificados mediante la utilización de Illumina basadas en matrices perfiles de expresión de 150 pacientes con cáncer de cuello uterino y ocho líneas celulares de cáncer de cuello uterino cultivadas en normoxia e hipoxia. En primer lugar, se excluyeron los candidatos en base a su asociación con una respuesta a la hipoxia en el cáncer cervical o con los parámetros clínicos en la cohorte de pacientes. Los genes para los que la expresión de al menos una sonda en el conjunto de datos clínicos en correlación con el parámetro de DCE-MRI hipoxia asociada A
Brix (n = 42) fueron retirados, así como los genes que son más de 1,5 veces la altura o downregulated en condiciones de hipoxia en al menos una de las líneas celulares (S1 tabla). Además, se excluyeron los candidatos que muestran una asociación entre los niveles de expresión y el volumen del tumor, estadio, estado de los ganglios linfáticos, o el resultado clínico en 150 pacientes (S1 Tabla). Los genes extraídos incluyeron
GAPDH
,
HMBS
,
EEF1A1
,
ACTB
,
PGK1
,
RPLP0
y
TBP
, que han sido identificados como genes de referencia adecuados en los estudios anteriores de la carcinogénesis cervical [10-13,36,37], y
B2M
,
HPRT1
,
Rpl11
,
RPL37A
,
ACTR3
, y
NDFIP1
, que se han encontrado que son adecuados para estudios de hipoxia en el cáncer de cabeza y cuello [18,30]. En total, 99 genes diferentes representadas por 117 sondas permanecieron como candidatos de referencia en esta etapa. Para asegurar la detección de los genes de referencia en los ensayos de RT-qPCR, una exclusión adicional de los genes sobre la base de un nivel de expresión muy bajo (media de expresión log2 de 150 pacientes y lt; 7) se llevó a cabo, lo que reduce este número a 89 candidatos representados por 101 sondas.
Además de la expresión estable, el gen de referencia debe tener idealmente la abundancia de transcripción similar a los genes bajo investigación para aumentar la sensibilidad para detectar pequeños cambios en la expresión de genes [24]. Se encontró que los candidatos con el menor coeficiente de variación (CV) se expresan generalmente en niveles altos, una observación también visto por otros [24], mientras que la mayoría de los genes regulado por la hipoxia de nuestro trabajo previo [25] tenían un nivel de expresión relativamente baja ( datos no mostrados). Un panel final de genes a ser evaluada por RT-qPCR fue por lo tanto, seleccionado para representar diferentes niveles de expresión, además de mantener el CV lo más bajo posible. Los candidatos también se eligieron de tal manera que representaban diferentes vías o clases funcionales con el fin de minimizar el riesgo de la selección de genes co-regulados [6]. Por último, se utilizó la disponibilidad de un TaqMan-ensayo pre-diseñado y validado adecuado como un criterio de selección. El panel de nueve candidatos a ser probado en ensayos de RT-qPCR se enumeran en la Tabla 1, y tenía CV en el rango de 0,01-0,09 y la media de los niveles de expresión log2 en el rango de 7,4 a 14,0 en el conjunto de datos clínicos. Entre estos genes,
GNB2L1
ha sido utilizado anteriormente como gen de referencia en estudios de hipoxia de cáncer de cabeza y cuello [18].
Pre-evaluación de los 9 genes candidatos de referencia por RT-qPCR
Para garantizar que los candidatos pudieron detectarse correctamente en un ensayo TaqMan y posiblemente limitar aún más el panel, una pre-evaluación de los nueve genes se realizó en 10 pacientes (RT-qPCR cohorte 1, Tabla 1, figura 1) . Los ensayos TaqMan se evaluaron primero por electroforesis en gel de los productos de PCR a partir de un paciente (Fig 2A). Para todos los ensayos, se observó una fuerte banda del tamaño esperado. Sin embargo, para
SOD1
una banda más débil adicional de tamaño más pequeño que podría representar dímeros de cebadores también apareció, lo que indica que el ensayo no estaba funcionando de manera óptima.
SOD1, por lo tanto
fue excluido de los análisis adicionales.
electroforesis (A) Gel de los productos de PCR para los genes de referencia de nueve candidatos en un paciente. Inferior (25 pb) y superior (1500 pb) marcadores se muestran en cada carril. Gene símbolos se indican. La figura es una imagen compuesta, donde
CHCHD1
es de una imagen separada y la escala de cada imagen se muestra. Las líneas verticales indican el recorte de la imagen o imágenes diferentes. parcelas (B) de la caja de la media aritmética de C
q-valores duplicados de genes de referencia de ocho candidatos en 10 pacientes. Las cajas indican el rango intercuartílico (RIC) con mediana como la barra central negro. Extended barras verticales representa 1,5 x IQR por debajo del primer cuartil y 1,5 x IQR por encima del tercer cuartil, y los círculos marcan presuntos valores atípicos. (C) geNorm análisis de ocho genes candidatos de referencia. se muestra la estabilidad media de expresión (M) de los candidatos que quedan después de la eliminación por etapas del gen menos estable. El gen menos estable en cada paso se indica a continuación. (D) Estabilidad valor de cada uno de los ocho genes candidatos de referencia del análisis NormFinder, donde un valor bajo indica la expresión más estable.
Los ocho candidatos restantes fueron detectados con C
q-valores que van desde 19.1 a la 31.1, donde
GNB2L1
y
TMBIM6
fueron las más abundantes y
RPL27A
la transcripción menos abundantes (figura 2B). geNorm y análisis NormFinder se realizaron para clasificar los genes de acuerdo con la estabilidad general a través de los diez pacientes (Figura 2C y 2D). El promedio estabilidad de la expresión M a partir del análisis geNorm varió de 0,72 usando los ocho genes de 0.4 para los dos candidatos más estables (Figura 2C). El ranking de los genes en el análisis NormFinder era casi idéntica a la clasificación de geNorm (figura 2D). Para un análisis más a fondo de estabilidad, incluida la evaluación de la estabilidad en todos los subgrupos de pacientes, y la determinación del número óptimo de los genes de referencia para incluir la normalización, los cinco genes expresados más estable según lo determinado por los dos métodos, es decir,
CHCHD1
,
GNB2L1
,
IPO8
,
SRSF9
y
TMBIM6
, fueron examinados.
la determinación de una RT-qPCR factor de normalización
Los cinco candidatos restantes se evaluaron mediante análisis de RT-qPCR en 74 pacientes (RT-qPCR cohorte 2, Tabla 1, figura 1), lo que resulta en C
q-valores entre 17,9 y 25,4 ( Fig 3A). geNorm y analiza NormFinder mostraron clasificación similar de los genes en función de la estabilidad entre los pacientes (Figura 3B y 3C). A partir del análisis geNorm, la estabilidad de la expresión media de 0,57 M varió con los cinco genes a 0,45 usando los dos candidatos más estables.
(A) Los diagramas de caja de la media aritmética de C
q-valores duplicados durante cinco genes candidatos de referencia en 74 pacientes. Las cajas indican el rango intercuartílico (RIC) con mediana como la barra central negro. barras verticales extendidas representan 1,5 x IQR por debajo del primer cuartil y 1,5 x IQR por encima del tercer cuartil, y los círculos marcan presuntos valores atípicos. (B) Análisis geNorm de cinco genes candidatos de referencia. se muestra la estabilidad media de expresión (M) de los candidatos que quedan después de la eliminación por etapas del gen menos estable. El gen menos estable en cada paso se indica a continuación. valor (C) Estabilidad de cada uno de los cinco genes candidatos de referencia del análisis NormFinder, donde un valor bajo indica la expresión más estable. análisis (D) geNorm pairwise variación (V) para determinar el número suficiente de genes de referencia en el factor de normalización. pairwise variación de dos factores de normalización secuenciales (V
n /n + 1) de los dos genes más estables a los cinco genes. La línea horizontal indica el valor de corte (V = 0,15), para los que la inclusión de más genes no tiene ningún efecto significativo sobre el factor de normalización.
Para evaluar el número suficiente de genes necesarios para la normalización fiable , un procedimiento por etapas se utilizó incluyendo genes secuencialmente en el factor de normalización de acuerdo con sus crecientes valores M hasta que se consiguió ninguna contribución significativa. La variación de pares entre los factores de normalización con tres y cuatro genes estaban por debajo del valor de corte (V
3/4 & lt; 0,15), lo que indica que los tres candidatos con más bajo valor M,
CHCHD1
,
SRSF9
y
TMBIM6
, son suficientes para la normalización (figura 3D). También se encontró que estos candidatos a ser los tres genes más estables en el análisis NormFinder (Figura 3C). Por otra parte, su promedio M-valor fue de 0,49 (Fig 3B), y por debajo de la gama de 0,5 a 1 que debe ser necesaria en la evaluación de genes de referencia en biopsias de cáncer [38].
Además, evaluó la estabilidad de la cinco candidatos entre los subgrupos de pacientes utilizando el algoritmo NormFinder (figura 4). En este análisis,
CHCHD1
,
SRSF9
y
TMBIM6
también apareció como los genes de referencia óptimos. Ellos fueron los candidatos más estables a través de los pacientes con la etapa baja y alta del tumor o volumen y con y sin repetición, y para los pacientes con y sin afectación de los ganglios linfáticos en el diagnóstico de los tres candidatos se encontraban entre los cuatro genes más estables. Por otra parte, en el análisis del estado de la hipoxia tumoral,
CHCHD1
,
SRSF9
y
TMBIM6
eran los candidatos más estables a través de los pacientes con alto y bajo A
Brix ( Fig 4). Para validar adicionalmente la estabilidad de estos tres genes, el análisis geNorm en los datos de RT-qPCR a partir de muestras de normoxia e hipóxicas de ocho líneas celulares de cáncer de cuello uterino se realizó. El M-valor medio para los tres genes fueron 0,79, lo que indica la expresión estable a lo largo de normoxia e hipoxia condiciones de cultivo [38]. Por lo tanto,
CHCHD1
,
SRSF9
y
TMBIM6
parecía ser muy adecuado para el cálculo de un factor de normalización y fueron seleccionados para la validación en los estudios de expresión génica inducida por hipoxia (Fig 1).
NormFinder análisis de la estabilidad de los cinco genes candidatos de referencia a través de los subgrupos de pacientes. Los subgrupos evaluados fueron: bajo (n = 49) y alta (n = 25) el estadio del tumor (FIGO 1B-2B vs. 3A-4A), con (n = 32) y sin (n = 42) de los ganglios linfáticos (LN) participación en el diagnóstico, a continuación (n = 36) y superior (n = 36) un volumen tumoral medio de 44,6 cm
3, con (n = 32) o sin (n = 42) recurrencia tratamiento en cinco años, y diferente estado de hipoxia representada por debajo (n = 16) y superior (n = 16) de un medio a
Brix.
Validación de
CHCHD1
,
SRSF9
y
TMBIM6
como genes de referencia en estudios de hipoxia
RT-qPCR se realizaron análisis de tres genes que hemos informado anteriormente de ser inducida por hipoxia en líneas celulares de cáncer de cuello uterino y se asocia con un
Brix en el cáncer de cuello de útero [25], es decir,
DDIT3
,
ERO1A
y
STC2
. La cohorte de RT-qPCR 2 de 74 pacientes, de los que teníamos los datos de expresión de Illumina, se utilizó. La electroforesis en gel de los productos de PCR demostró que los ensayos TaqMan funcionaba correctamente, la generación de un solo producto específico del tamaño esperado para cada uno de los tres genes (Fig 5A). Los niveles de expresión de
DDIT3
,
ERO1A
y
STC2
se calcularon mediante la normalización de los
q-C los valores de la media C
q-valor de
CHCHD1
,
SRSF9
y
TMBIM página 6. Se demostró la -ΔC
q-valor que está altamente correlacionado con los datos de Illumina para los tres genes (P & lt; 0,001; ρ a partir 0,78 a 0,83). Además, significativas correlaciones negativas entre -ΔC
Q y A
Brix se encontraron, de acuerdo con las correlaciones obtenidas con los datos de Illumina (Tabla 3). Por tanto, los genes de referencia identificados parecen adecuado para la medición de los cambios de la hipoxia inducida en el cáncer cervical
.
(A) Gel de electroforesis de los productos de PCR para los tres genes de hipoxia inducida por
DDIT3
,
ERO1A
, y
STC2
. Inferior (25 pb) y superior (1500 pb) marcadores se muestran en cada carril. La figura se deriva de una imagen, y las líneas verticales indican el recorte de la imagen. La incidencia acumulada de progresión de la enfermedad durante 74 pacientes divididos en bajo (& lt; 67% percentil) y alta (≥ percentil 67%)
STC2
expresión basa en (B) Illumina datos de expresión y (C) los datos de RT-qPCR normalizaron con
CHCHD1
,
SRSF9
TMBIM página 6 (-ΔC
q) y
. 60 meses de probabilidad de recurrencia, se indican los valores de p de la prueba y el número de pacientes en riesgo de Gray. La muerte por causas distintas al cáncer de cuello uterino se incluyó como un evento competitivo (n = 5). (D) La variabilidad intra-tumoral en
STC2
niveles de expresión mide por RT-qPCR en ocho tumores independientes con 2-4 biopsias por tumor, es decir, un total de 22 biopsias. La medición de
STC2
no tuvo éxito para una de las biopsias de tumores 4.
STC2
datos se normalizaron con
CHCHD1
,
SRSF9
y
TMBIM página 6. Las muestras se clasificaron en un grupo de alta y baja expresión utilizando el mismo corte como en la figura 5C (es decir -ΔC
q = -4,46). Diferentes biopsias de un mismo tumor han sido trazadas con el mismo color para facilitar la interpretación de la figura.
Desde la hipoxia se sabe están asociados con la agresividad en el cáncer cervical [3-5] , se evaluó el valor pronóstico de
DDIT3
,
ERO1A
y
STC2
expresión en los conjuntos de datos Illumina y RT-qPCR. Sobre la base de los datos de Illumina de 150 pacientes, se encontró un aumento del riesgo estadísticamente significativo de la progresión de la enfermedad en los pacientes con la más alta expresión de
DDIT3
o
STC2
en comparación con los otros (p = 0,047 y P = 0,015, respectivamente, la prueba de Gray; datos no mostrados), mientras que
ERO1A
expresión no se asoció con el resultado (datos no mostrados). En la cohorte de RT-qPCR 2 de 74 pacientes, se encontró la asociación más fuerte con el resultado de
STC2 Hoteles en ambos conjuntos de datos, y para los datos de RT-qPCR la relación fue estadísticamente significativa (Figura 5B y 5C).