Extracto
El cáncer de colon es uno de los cánceres malignos más frecuentes en todo el mundo, pero los enfoques terapéuticos actuales para el cáncer avanzado de colon son menos eficientes. Este estudio investigó asociaciones entre la expresión del factor de transcripción nuclear SOX4 y varios parámetros clínico así como la supervivencia de los pacientes. Los niveles de expresión de SOX4 nuclear se analizaron por inmunohistoquímica; los datos comprenden tejidos de colon de 263 pacientes con cáncer de colon. Junto
t
pruebas se utilizaron para analizar las diferencias en la expresión SOX4 nuclear entre los tejidos tumorales y no tumorales de cada paciente. De dos colas Χ
2 se realizaron pruebas para determinar si las diferencias en la expresión SOX4 nuclear y parámetros clínico fueron significativas. criterios de valoración de tiempo hasta el evento de parámetros clínico se representaron usando el método de Kaplan-Meier, y la significación estadística se determinó mediante log-rank pruebas univariantes. Cox modelo de riesgos proporcionales fue utilizado para el análisis multivariado para determinar la independencia de los efectos pronósticos de expresión SOX4 nuclear. La sobreexpresión de SOX4 nuclear se correlacionó significativamente con la profundidad de la invasión (
P = 0,0041
), metástasis a distancia (
P Hotel & lt; 0,0001), y la etapa (
P = 0,0001
). Los pacientes que muestran altos niveles de expresión de SOX4 nuclear lograron una tasa de supervivencia libre de enfermedad significativamente más pobre, en comparación con los pacientes con niveles de expresión bajos SOX4 (
P Hotel & lt; 0,001). El análisis de regresión univariante de Cox mostró que la sobreexpresión de SOX4 nuclear era un marcador de pronóstico claro para el cáncer de colon (
P
= 0,001). La sobreexpresión de SOX4 nuclear puede ser utilizado como un marcador para predecir el resultado de los pacientes con cáncer de colon
Visto:. Lin C-M, Fang C-L, Hseu Y-C, Chen C-L, Wang J-W, Hsu S-L, et al. (2013) Implicaciones clínicas y pronósticas de factor de transcripción SOX4 en pacientes con cáncer de colon. PLoS ONE 8 (6): e67128. doi: 10.1371 /journal.pone.0067128
Editor: Irina V. Lebedeva, Enzo Life Sciences, Inc., Estados Unidos de América
Recibido: 21 Marzo, 2013; Aceptado: 14 de mayo de 2013; Publicado: 27 Junio 2013
Derechos de Autor © 2013 Lin et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por una beca de Chi Mei Medical Center (Grant No. 101 cm-TMU-03) (http://www.chimei.org.tw). La fuente de financiación no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de colon es uno de los cánceres más frecuentes y una causa común de muerte por cáncer [1]. En Taiwán, el cáncer de colon se sitúa como el tumor maligno más frecuentemente diagnosticado y causa más de 4.900 muertes al año (http://www.doh.gov.tw/statistic/index.htm; visitada en septiembre de 2012). A pesar de las técnicas quirúrgicas actuales y la quimioterapia que han hecho mejoras significativas, debido al mal pronóstico y la invasión distante y la migración, la incidencia global de cáncer de colon es de aproximadamente 5% y la tasa de supervivencia a los 5 años de los pacientes con cáncer de colon es muy baja [2]. Por lo tanto, la identificación de nuevas dianas para el desarrollo de tratamientos no convencionales es urgente y se aprovechará de los avances en la comprensión amplia y profunda de la patogénesis molecular del cáncer de colon.
Entre los marcadores de pronóstico ya está disponible para cáncer de colon, el más importante es el Comité Conjunto sobre el cáncer etapa (AJCC) determinada por la profundidad de la invasión, la implicación de los ganglios linfáticos y metástasis a distancia. Sin embargo, el pronóstico varía incluso entre pacientes en la misma etapa. En las últimas décadas, varios estudios han sugerido que las alteraciones genéticas pueden desempeñar un papel en el desarrollo y progresión del cáncer de colon [3], [4]. Los estudios en patología molecular pueden ayudar en la comprensión de la patogénesis de la enfermedad y también podrían revelar marcadores moleculares pronósticos de esta enfermedad. Algunos marcadores de pronóstico biológicos sugeridos incluyen la sobreexpresión de la proteína quinasa CK2, factor de crecimiento vascular endotelial (VEGF), potenciador de zeste homólogo 2 y transglutaminasa 2 [5] - [8].
En los seres humanos, la región determinante del sexo Y (SRY) de la familia caja, también conocida como la familia SOX, un total de 20 factores de transcripción altamente conservadas que desempeñan papeles importantes en el desarrollo. Estos factores de transcripción se definen por una secuencia de firma conservada en el dominio de unión a ADN-alta movilidad de grupo (HMG) (DBD) [9], [10]. SOX4 es una proteína de 47 kDa que se codifica por un solo gen exón, que está altamente conservada en vertebrados. En ratones, SOX4 se expresa específicamente en el ovario, testículos, glándula mamaria, y el timo y, en T de ratón y líneas celulares linfocíticas pre-B [11]. Además, SOX4 es esencial para el desarrollo del corazón, linfocitos, y los timocitos, y los ratones SOX4 nulo mueren por defectos cardíacos [12]. La capacidad de proliferación de los progenitores de células B se ve seriamente disminuida en las células de ratones knockout SOX4 [13].
La importancia clínica de SOX4 ha ganado cada vez más atención en los últimos años, con numerosos informes que sugieren que SOX4 puede contribuir a tumor progresión. Tres estudios independientes de detección de oncogenes importantes mostró que SOX4 está frecuentemente alterado a través de inserciones retrovirales [14] - [16]. El virus de la leucemia murina generalmente se dirige SOX4, y se estabilizó el mensaje SOX4 para producir linfomas de células B que muestran una mayor niveles de mensaje SOX4 [16]. El aumento de expresión SOX4 se asocia con tumores de la vejiga, próstata, y con los tumores de pulmón de células no pequeñas [17] - [19]. Sin embargo, el papel de SOX4 en tales tumores no se entiende completamente y los datos reportados han mostrado ciertas contradicciones. Mientras que SOX4 caída dio lugar a la apoptosis de las células de carcinoma de adenoides quísticos Acc3, la sobreexpresión SOX4 promovió la detención del ciclo celular y la apoptosis de las células de carcinoma de colon HCT116 [20], [21]. El microARN (miARN) miR-335 inhibe la invasión de células metastásico y actuó, al menos en parte, a través de la orientación
SOX4 Opiniones y su objetivo putativo
TNC
, que codifica un componente de la matriz extracelular implicado en la celda migración [22]. Por el contrario, cuanto mayor sea el nivel de expresión SOX4, mejor es el pronóstico para los pacientes con meduloblastomas y otros tipos de tumores [23]. Por lo tanto, SOX4 podría ejercer diferentes efectos sobre las células tumorales en función del contexto y el mecanismo de transformación primaria; más estudios para aclarar esta cuestión.
Hasta la fecha, no se ha establecido la importancia pronóstica de SOX4 nuclear de los niveles de expresión en el cáncer de colon humano. Este estudio investigó la asociación entre la expresión SOX4 nuclear y parámetros clínico, y se evalúa la importancia de SOX4 nuclear en predecir el pronóstico de los pacientes con cáncer de colon.
Materiales y Métodos
Ética Declaración
la junta de revisión institucional a Chi Mei Medical Center aprobó el protocolo de adquisición de tejido para el estudio inmunohistoquímico e inmunotransferencia. escrito el consentimiento informado se obtuvo de cada participante antes de la adquisición de tejidos.
Participantes y especímenes
Se recogieron 263 casos de cáncer de colon consecutiva de los archivos médicos de Chi Mei Medical Center en Taiwán. Todos los pacientes incluidos en nuestro grupo de estudio fueron tratados entre 1998 y 2005, y habían recibido la colectomía con disección de ganglios linfáticos. Todos los casos de prueba conseguida tejido de adenocarcinoma mediante biopsia endoscópica antes de la operación. Integral de la resección quirúrgica se logró en todos los casos, y el examen patológico no reveló ninguna afectación tumoral de los márgenes de resección en especímenes quirúrgicos. Ninguno de los pacientes del estudio habían recibido quimioterapia y /o radioterapia preoperatoria. La parte no tumoral se obtuvo de la mucosa del colon macroscópicamente normal, separado del tumor, en la muestra de colon resecado. parámetros clínico de cáncer de colon se determinaron de acuerdo con la clasificación de la AJCC. La duración del seguimiento para la supervivencia libre de enfermedad se define como el período comprendido entre la fecha de la operación y el día de la recaída, según la historia clínica del paciente. Para cada paciente, se analizaron un par de tejidos tumorales de colon y no tumoral para determinar la expresión SOX4 nuclear.
Análisis inmunohistoquímico
expresión SOX4 nuclear se analizó mediante técnicas de inmunohistoquímica. bloques de tejido incluidas en parafina se seccionaron a 5 micras y se transfirieron a portaobjetos de microscopio (Muto Pure Chemicals Co. Ltd., Tokio, Japón). El tejido mamario se utilizó como control positivo para SOX4. El control negativo implicaba omisión del anticuerpo primario y la incubación con solución salina tampón de fosfato. Las secciones se desparafinaron con xileno, seguido de rehidratación en alcoholes graduados. Deparaffinized secciones se incubaron en tampón de pH 6,0 de citrato durante 40 min a 95 ° C sobre una placa caliente para recuperar antígenos. Además de bloqueo de antígenos se realizó utilizando la solución Dako VERDADERO peroxidasa-bloqueo (Dako North America Inc., Carpinteria, CA) durante 5 min. Los portaobjetos se incubaron a continuación con anticuerpo primario: policlonal anti-SOX4 (Life-Span, Victoria, Canadá) durante 1 hora a temperatura ambiente, a una dilución de 1:3200. La detección de la tinción inmunorreactivas se realizó utilizando el método del complejo avidina-biotina-peroxidasa de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se utilizó un sistema sensible Dako EnVision VERDADERO detección (Dako North America Inc., Carpinteria, CA). Después de la incubación con diaminobenzidina durante 5 minutos, las secciones se contratiñeron con hematoxilina y se montaron en Faramount Dako acuosa medio de montaje (Dako North America Inc., Carpinteria, CA) para la interpretación microscópica. La inmunorreactividad se anotó semi-cuantitativamente basándose en la intensidad de la inmunotinción: 0, sin manchas; 1, tinción débil; 2, tinción moderada; 3, la tinción fuerte. Las secciones con una puntuación de 0 ó 1 muestran una baja expresión de SOX4, mientras que los que marcó 2 o 3 se define como tener una alta expresión o sobreexpresión de SOX4. recopilación de datos clínicos y análisis de inmunohistoquímica se realizaron de forma independiente el uno del otro, en un estudio investigador ciego.
líneas celulares
Cell Cultura y
humano normal (FHC) y el cáncer de colon (DLD-1 y WiDr ) se obtuvieron de la American Type Culture Collection (ATCC; Manassas, VA, EE.UU.). Las líneas celulares fueron autenticadas por el programa de biología celular ATCC, y se hicieron pasar por no más de 6 meses antes de la interposición de nuevas células fuera del estado congelado o una nueva alícuota de células se adquirió de ATCC. Las células se cultivaron en DMEM /F-12 (FHC), RPMI-1640 (DLD-1), o MEM (WiDr) suplementado con 10% de suero bovino fetal, 100 unidades /ml de penicilina G, 100 mg /ml de sulfato de estreptomicina, y 250 ng /ml de anfotericina B.
proteína nuclear Preparación
proteínas nucleares se extrajeron mediante NE-PER reactivo Nuclear extracción (Pierce Biotechnology, Rockford, IL), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las muestras se almacenaron a -80 ° C hasta su uso. La concentración de proteína se determinó usando un Kit de ensayo de proteínas BCA (Pierce Biotechnology) con albúmina de suero bovino como estándar.
Immunoblotting
muestras de proteína desnaturalizadas se sometieron a 12% SDS-PAGE. Las proteínas se transfirieron a membranas de nitrocelulosa, y se bloquearon las transferencias se incubaron a 4 ° C durante la noche con anticuerpo policlonal anti-SOX4 (1:1000 dilución). proteína de unión a TATA se utilizó como un control interno para la igualdad de la carga de proteínas. Las transferencias se incubaron adicionalmente con anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa (Sigma, St. Louis, MO) durante 1 h a temperatura ambiente. Posteriormente fueron incubadas con SuperSignal West Femto Maximun Sensibilidad Sustrato (Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL), y se expusieron a una película de rayos X médicos Fuji (Fuji Photo Film Co., Tokio, Japón). El procesamiento de imágenes se realizó utilizando el software Image Gauge Fuji.
Análisis estadístico
pareja de
t
pruebas se utilizaron para evaluar la diferencia en la expresión SOX4 nuclear entre los tejidos tumorales y no tumorales para cada paciente. Hemos examinado varios parámetros clínico: la edad, el género, la profundidad de la invasión, el estado ganglionar, metástasis a distancia, etapa, grado de diferenciación, la permeabilidad vascular y la invasión perineural. La asociación entre la expresión SOX4 nuclear y cada parámetro clínico patológica fue examinada usando χ
2 test. Los criterios de valoración de tiempo hasta el evento para todos los parámetros clínico se representaron mediante el método de Kaplan-Meier, y el grado de significación se calculó mediante la prueba de log-rank univariado. Los parámetros que surgieron como significativa (
P
≤0.05) en el análisis univariado se introdujeron como variables en el modelo de regresión de Cox, y razón de riesgo (HR) y la independencia de impacto pronóstico se pudo determinar de un modo por pasos hacia atrás. Todos los datos fueron analizados utilizando el software SPSS versión 17.0 (SPSS, Chicago, IL). Un
P valor Red de & lt; 0,05 se consideró significativo
Resultados
Demografía
Este estudio incluyó a 263 pacientes con cáncer de colon, 154 de los cuales eran. hombres y 109 eran mujeres (Tabla 1). La edad de los pacientes osciló entre 21 y 92 años en el primer diagnóstico (media ± desviación standarad (S. D.): 68,0 ± 12,9 años). Basado en la clasificación de la AJCC, 25 pacientes se encontraban en estadio I, 91 estaban en fase II, 108 estaban en fase III, y 39 estaban en fase IV. El período de seguimiento para todos los pacientes osciló entre 0 y 146 meses (media ± S.D. .: 58,6 ± 40,2 meses). Durante el seguimiento, 116 pacientes murieron de cáncer de colon.
Expresión SOX4 nuclear se reguló y se asocia con parámetros clínico en cáncer de colon
Se utilizó el análisis inmunohistoquímico para investigar la expresión de la energía nuclear SOX4 en los tejidos obtenidos de nuestro estudio los pacientes (Figuras 1A a C). expresión SOX4 Nuclear fue significativamente mayor en los tejidos tumorales que en los tejidos no tumorales (
P
& lt; 0,001). La sobreexpresión de SOX4 nuclear (puntuaciones de 2 o 3) se observó en 119 de los 263 pacientes (45,2%). El análisis de transferencia Western demostró también que la expresión de SOX4 se incrementó sustancialmente en las células de cáncer de colon y los tejidos en comparación con las células y tejidos (Figura 1D) normales. Además, en tiempo real el análisis cuantitativo de PCR demostró que la expresión de mRNA SOX4 se incrementó sustancialmente en los tejidos tumorales en comparación con tejidos no tumorales (Tabla 2). Como se muestra en la Tabla 3, la sobreexpresión de SOX4 nuclear correlacionó significativamente con los siguientes parámetros: profundidad de la invasión (
P = 0,0041
), metástasis a distancia (
P Hotel & lt; 0,0001), y la etapa (
P
= 0,0001). No se encontró asociación significativa entre la sobreexpresión surgió de SOX4 nuclear y la edad, el género, el estado ganglionar, grado de diferenciación, invasión vascular, o invasión perineural
Los paneles A a C:. Especímenes de cáncer de colon analizados mediante técnicas de inmunohistoquímica con un anticuerpo contra SOX4 . El panel A muestra una muestra sin expresión SOX4; El panel B muestra una muestra con un bajo nivel de expresión de SOX4; El panel C muestra una muestra con alto nivel de expresión de SOX4. Grupo D: expresión de la proteína nuclear SOX4 se examinó en las células del colon y 3 pares 3 no tumoral /tumor de tejidos de colon. Ampliación:. 200 ×
La sobreexpresión de SOX4 nuclear como un marcador pronóstico de cáncer de colon
Asociaciones de resultados clínicos con la expresión SOX4 nuclear se muestran en la Figura 2 . la sobreexpresión de SOX4 nuclear se asoció significativamente con la supervivencia libre de enfermedad (
P Hotel & lt; 0,001). Los pacientes con altos niveles de expresión de SOX4 nuclear lograron una tasa de supervivencia libre de enfermedad a los 5 años del 58,3% frente al 76,6% para los pacientes con bajos niveles de expresión. Por otra parte, GC estadio alto (estadio III y IV) fue utilizado para determinar el efecto de la sobreexpresión SOX4 nuclear en el pronóstico. La sobreexpresión de SOX4 nuclear se asoció significativamente con menor supervivencia libre de enfermedad (
P = 0,016
, Figura 3). Los pacientes con altos niveles de expresión de SOX4 nuclear lograron una tasa de supervivencia libre de enfermedad a los 5 años del 44,8% en comparación con el 63,8% de los pacientes con bajos niveles de expresión
.
Todas las pruebas estadísticas fueron de dos colas y el nivel de significación fue
P
. & lt; 0,05
Todas las pruebas estadísticas fueron de dos colas y el nivel de significación fue
P
. & lt; 0,05
los resultados del análisis univariado de los marcadores de pronóstico de cáncer de colon se muestran en la Tabla 4. supervivencia libre de enfermedad se correlacionó significativamente con cada uno de los siguientes: profundidad de la invasión (
P = 0,029
), el estado ganglionar (
P Hotel & lt; 0,001), metástasis a distancia (
P Hotel & lt; 0,001), etapa (
P Hotel & lt; 0,001), la invasión vascular (
P
& lt; 0,001), la invasión perineural (
P Hotel & lt; 0,001), y la sobreexpresión de SOX4 nuclear (
P
= 0,001). Sin embargo, la asociación entre la sobreexpresión de SOX4 nucleares y la supervivencia no fue significativa después de controlar otros marcadores de pronóstico conocidos en el análisis multivariante (
P = 0,425
, Tabla 5). En el análisis multivariado, metástasis a distancia (HR = 0,052; IC del 95% = 0,024-0,111,
P
= & lt; 0,001). Pronóstico era independiente
Discusión
el cáncer de colon sigue siendo un importante problema de salud pública en todo el mundo [1]. A pesar de las técnicas quirúrgicas actuales y la quimioterapia que han hecho mejoras significativas, la tasa de curación para el cáncer de colon avanzado sigue siendo baja y la morbilidad sigue siendo elevada [2]. Un mayor conocimiento de los mecanismos moleculares que subyacen al desarrollo de esta neoplasia mortal si se requiere nuevas estrategias para prevenir y tratar el cáncer de colon se van a desarrollar. En particular, la identificación de moléculas que son alterados durante la iniciación y progresión del cáncer puede proporcionar valiosas herramientas como marcadores de pronóstico o dianas terapéuticas.
La expresión de SOX4 en los cánceres humanos varía según el tipo de cáncer. El nivel SOX4 es elevada en numerosos cánceres humanos, incluyendo de la vejiga, próstata, endometrio, y el hígado, mientras que se reduce en el melanoma y el cáncer de la vesícula biliar [17], [18], [24] - [27]. En el presente estudio, se evaluaron los niveles de expresión de SOX4 nuclear en tejidos de colon obtenidos de 263 pacientes con cáncer de colon. Nuestros resultados fueron consistentes con los de la vejiga y de próstata, y mostraron que la expresión SOX4 nuclear fue elevado en los tejidos tumorales de colon en relación con tejidos de colon no tumorales. Los resultados de inmunotransferencia confirmaron que la expresión SOX4 nuclear fue mayor en las células de cáncer de colon que en las células de colon normales.
Nuestro hallazgo también mostró que la sobreexpresión de SOX4 nuclear en los tejidos de cáncer de colon estaba estrechamente correlacionada con la invasión tumoral y la metástasis. El mecanismo por el cual SOX4 ejerce su actividad invasiva y metastásica sigue siendo poco clara. En la primera línea de evidencia, miRNAs (ARNs no codificantes pequeño con funciones de regulación) se demostró que se asocia con la invasión tumoral y la metástasis [28], [29]. El trabajo previo de Tavazoie et al. mostró que el miR-335 suprime la metástasis a través de la baja regulación de SOX4 [22]. Este resultado sugiere que SOX4 está vinculada a la agresividad del tumor.
La segunda línea de evidencia ha sido proporcionada por los estudios sobre la transición epitelio-mesenquimal (EMT), que es un paso clave durante la embriogénesis [30]. La acumulación de pruebas sugiere que la utilización inadecuada de EMT podría ser un componente de la invasión de muchos tumores de los tejidos epiteliales. características de las células se ven fuertemente afectados durante EMT, resultando en alteraciones de célula-célula y las interacciones célula-matriz, la motilidad celular, y la invasividad [31], [32]. Un estudio reciente de Zhang et al. mostró que la sobreexpresión de SOX4 en las células epiteliales mamarias humanas condujo a la adquisición de rasgos mesenquimales, y la migración celular y la invasión mejorada. Además, SOX4 regula positivamente la expresión de inductores EMT conocidos y se activa la ruta de TGF-β para contribuir a EMT. La expresión de SOX4 fue inducida por el TGF-β y era necesario para EMT TGF-β-inducida. Estos hallazgos muestran que SOX4 juega un papel importante en la progresión del cáncer de mama, por la orquestación de EMT [33]. Estos estudios pueden explicar en parte la asociación de la sobreexpresión de SOX4 nuclear con la invasión tumoral y la metástasis.
predicción precisa del riesgo de recurrencia que contribuiría a reducir al mínimo los efectos adversos del cáncer de colon y maximizar el efecto terapéutico del tratamiento . De los marcadores de pronóstico para el cáncer de colon, la etapa AJCC es más importante. Sin embargo, el pronóstico varía incluso entre los pacientes en la fase misma enfermedad; por lo tanto, se buscan marcadores pronósticos alternativos. Pocos estudios han investigado el valor pronóstico de las proteínas SOX4. Aaboe et al. mostró que existía una fuerte asociación entre el aumento de expresión SOX4 y el aumento de la supervivencia del paciente en los casos de cáncer de vejiga [17]. De manera similar, Kim et al. mostró que la sobreexpresión de la proteína SOX4 en pacientes con carcinoma hepatocelular se asoció con mejores resultados en los pacientes [25]. Además, Jafarnejad et al. demostró que en pacientes con melanoma, existía una fuerte asociación entre la expresión SOX4 reducida y pobre supervivencia de los pacientes [26]. No se encontraron informes publicados en discusiones sobre el significado pronóstico de SOX4 en el cáncer de colon humano. Los resultados de este estudio mostraron que la sobreexpresión SOX4 nuclear se correlacionó inversamente con la supervivencia del paciente; Este hallazgo contradice las asociaciones positivas se informó anteriormente. Nuestro estudio fue el primero en demostrar que la sobreexpresión de SOX4 nuclear puede predecir los resultados más pobres para los pacientes con cáncer de colon. La sobreexpresión de SOX4 nuclear parece ser un marcador útil para predecir los resultados en pacientes con cáncer de colon que han recibido la resección quirúrgica del tumor. Por lo tanto, los pacientes con cáncer de colon que muestran sobreexpresión de SOX4 nuclear deben ser seguidos cuidadosamente. Debido a que nuestro grupo de pacientes fue pequeño, los estudios futuros deben incluir un grupo más grande de pacientes de cáncer de colon para dilucidar el significado pronóstico de SOX4 nuclear en esta enfermedad.
En resumen, este estudio proporciona evidencia de la importancia clínica de SOX4 sobreexpresa en pacientes con cáncer de colon. Nuestros resultados indican que la orientación SOX4 podría proporcionar una nueva modalidad terapéutica para el tratamiento de cáncer de colon.