Extracto

Antecedentes

circulantes de ADN tumoral (ctDNA) lleva la información sobre el tumor carga. Sin embargo, la mutación del espectro es diferente entre los tumores. Este estudio fue diseñado para examinar la utilidad de ctDNA para el seguimiento de la carga tumoral en base a un perfil de mutación individual.

Metodología

Se extrajo ADN de un total de 176 muestras, incluyendo pre- y post- plasma operativa, tumores primarios, y las células mononucleares de sangre periférica (PBMC), de 44 individuos con tumor colorrectal que se sometieron a resección curativa de los tumores colorrectales, así como nueve individuos sanos. El uso de un panel de 50 genes asociados con el cáncer, las mutaciones de tumor único se identificaron mediante la comparación de las variantes de nucleótido único (SNVS) de los tumores y las PBMCs con un secuenciador Ion PGM. Un grupo de las mutaciones de tumor único de los tumores individuales se designaron como mutaciones marcador individual (MMS) para rastrear la carga tumoral por ctDNA usando gotita PCR digital (ddPCR). A partir de estos experimentos, se evaluaron tres objetivos principales: (a) las mutaciones tumorales-única; (B) espectro de mutación de un tumor; y (c) los cambios en la frecuencia de los alelos del MMS en ctDNA después de la resección curativa del tumor.

Resultados

Un total de 128 mutaciones puntuales de genes fueron identificados en 27 tumores colorrectales. Veintiséis genes fueron mutados en al menos 1 muestra, mientras que se encontraron 14 genes mutado en solamente 1 muestra, respectivamente. Un promedio de 2.7 genes fueron mutados por el tumor. Posteriormente, se seleccionaron 24 MMs de SNVS para la supervisión de la carga tumoral. Entre los MM que han encontrado los ddPCR con & gt; 0,1% de frecuencia alelo variante en el ADN de plasma, 100% (8 de 8) exhibió una disminución en la post-operación ctDNA, mientras que ninguno de los 16 MM encontrados por ddPCR con & lt; 0,1% de frecuencia alelo variante en el ADN de plasma mostró una disminución.

Conclusiones

Este panel de 50 genes asociados al cáncer parecía ser suficiente para identificar, con el tumor único, marcadores individuales ctDNA mutados en el cáncer pacientes. Los MM mostraron la utilidad clínica en el seguimiento de tratamiento de intención curativa-carga tumoral colorrectal si la frecuencia del alelo MM en el ADN de plasma está por encima de 0,1%

Visto:. Sato KA, Hachiya, T, T Iwaya, Kume K, T Matsuo , Kawasaki K, et al. (2016) Individualizada detección de mutaciones en el ADN circulante tumor colorrectal para la Supervisión de la carga tumoral usando un gen Panel de Secuenciación asociada a cáncer. PLoS ONE 11 (1): e0146275. doi: 10.1371 /journal.pone.0146275

Editor: Alvaro Galli, CNR, ITALIA

Recibido: 11 Junio, 2015; Aceptado: 15 de diciembre de 2015; Publicado: 4 Enero 2016

Derechos de Autor © 2016 Sato et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan

Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y

Financiación:. Este trabajo fue apoyado por la Fundación de Investigación Keiryoukai No.125 de la Universidad médica de Iwate [KAS]; y el Ministerio de Educación, Cultura, Deportes, Ciencia y Tecnología, Japón por MIAST (innovación médica por Ciencia y Tecnología Avanzada) del proyecto de la subvención-en-Ayudas a la Fundación de Investigación Estratégica en la Universidad privada [S1001001 al SSN]. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito

Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia

Introducción

evaluación cuantitativa de ADN circulante tumor (ctDNA) ha demostrado ser útil para la carga de monitorización de tumores en respuesta al tratamiento [1, 2]. Sin embargo, los genes mutados en muchos tipos de cáncer representan sólo un pequeño porcentaje del número total de genes presentes, lo que sugiere que sólo un número limitado de genes están asociados con el desarrollo y progresión del cáncer [3, 4]. Por lo tanto, un conjunto de genes selectivos conocidos por estar asociados con el cáncer es fundamentalmente necesario para controlar la carga tumoral. De hecho, el seguimiento de la eficacia del tratamiento por ctDNA se ha realizado utilizando un conjunto de genes diana bien estudiados, incluyendo
KRAS
,
BRAF
,
HER2
, y otros [5 -9]. Por otro lado, la información sobre la carga de monitorización de tumores después de la intervención quirúrgica es limitado debido a que se desconoce que los genes mutados de tumor único deben ser monitorizados para cada paciente [10]. De hecho, los datos han implicado que un número limitado de mutaciones de tumor único puede representar suficientemente el volumen y las características (por ejemplo, resistencia a fármacos) de los tumores individuales [11]. Si se identifican un pequeño número de mutaciones de tumor único de tumores primarios, entonces podrían ser utilizados para detectar las mutaciones en ctDNA. Esto representa un enfoque ventajoso y rentable para el seguimiento de la carga tumoral después de la intervención quirúrgica.

La idea de utilizar ctDNA de pacientes con cáncer para controlar la carga tumoral nos ha llevado a diseñar el actual estudio se centró en pacientes con cáncer colorrectal que habían recibido curativa la extirpación del tumor. Nuestra estrategia era recoger muestras de tumor colorrectal individuales a través de la resección curativa del tumor colorrectal endoscópica o laparoscópica, así como muestras de sangre. En contraste con estudios anteriores utilizando tumores muy avanzados, incluyendo casos con resección incompleta [1, 2, 7], nuestros resultados demuestran que las mutaciones marcadores individuales (MMS) en ctDNA pueden ser útiles para el seguimiento post-operatorio, la carga tumoral colorrectal resecable en el base de la disminución de la frecuencia de los alelos ctDNA en el plasma después de la operación.

pacientes y métodos

las muestras humanas y el diseño del estudio

Este estudio fue aprobado por el Consejo de Revisión Institucional de Iwate médico de la Universidad de conformidad con la Declaración de Helsinki (HG H24-22). Un individuo consentimiento por escrito se obtuvo de todos los participantes y todos los análisis se llevaron a cabo de forma anónima. En principio, los pacientes eran elegibles si su resección quirúrgica o endoscópica fue indicada por 0 a III tumores colorrectales benignas o de etapas, y no tenían historia previa de cualquier tratamiento en el momento del consentimiento informado. Se requiere que todos los casos analizables para proporcionar los siguientes cuatro tipos de materiales: plasma pre y post-operativa (por lo menos 24 horas después de la resección del tumor), tumor primario, y las células mononucleares de sangre periférica (CMSP). Las muestras de sangre fueron extraídas de pre rutina y exámenes de laboratorio de post-operativas. O bien se recogieron ocho o 16 ml de sangre en un tubo de recogida de sangre BD Vacutainer CPT (Becton, Dickinson and Company, East Rutherford, NJ). Al cabo de dos horas después de la recolección, los tubos se centrifugaron a 1800
g
durante 20 min a temperatura ambiente se separe en plasma y las capas de PBMC. Después, la fase superior de ocho ml de sangre se transfirió a un tubo de cinco ml marcado con el número de identificación del paciente-único. Los tubos se almacenaron inmediatamente a -80 ° C hasta que el aislamiento de ADN. El ADN genómico total se extrajo usando el QIAamp circulante Nucleic Acid Kit para el plasma y el kit QIAamp DNA Mini para tumores primarios y PBMCs (Qiagen, Venlo, Países Bajos). La cantidad de ADN extraído se midió usando el ensayo de alta sensibilidad dsDNA Qubit® 2,0 (Life Technologies, Carlsbad, CA). En el presente estudio, nuestro experimento preliminar confirmó que dejando 5-7 mm de la capa de "buffering" de la capa leucocitaria después de la centrífuga suficientemente evita que la capa de plasma de la contaminación de la sangre y los residuos celulares, y los rendimientos de la calidad del ADN aceptable [12, 13]. el número de copias relativo del genoma en el ADN de plasma también se estimó mediante PCR cuantitativa (qPCR) para el gen LINE-1 usando el cebador conjuntos se describe anteriormente [14].

extracción de ADN de línea celular de cáncer de colon humano

la línea celular de cáncer de colon humano, HCT116, se obtuvo en 2008 de la División de Tratamiento y Diagnóstico del cáncer Repositorio tumor, Instituto Nacional del cáncer (NCI MTA#1-2093-08). La línea celular se cultivó en medio RPMI-1640 suplementado con FBS 10% y el ADN genómico fue extraído utilizando un Kit QIAamp DNA Mini (Qiagen, Venlo, Países Bajos) dentro de los tres pasajes después de la descongelación.

Multiplex PCR y la biblioteca construcción que usa el CHPv2

El CHPv2 es un grupo de cebadores de PCR que se dirigen a 207 amplicones de 2885 mutaciones en 50 genes asociados con el cáncer [15] (Life Technologies, Carlsbad, CA). La lista completa de los genes está disponible en el sitio web del proveedor (http://tools.invitrogen.com/downloads/cms_106003.csv). Aproximadamente 10 ng de ADN por muestra se utilizó para la producción de amplicón por PCR multiplex utilizando el Ion AmpliSeq CHPv2 y Ion AmpliSeq Library Kit 2.0 (Life Technologies, Carlsbad, CA). El múltiplex piscina reacción de PCR resultante se utilizó para la preparación de biblioteca de secuencia diana. Las secuencias de cebadores para la PCR multiplex se digirió parcialmente para ligar adaptadores de código de barras (P1 Ion Adaptador e Ion Xpress Bacode X, Life Technologies, Carlsbad, CA), seguido de un sistema de purificación de ácidos nucleicos basada en perlas (AMPure® XP reactivos, Life Technologies, Carlsbad , CA). Después de la confirmación de que el tamaño final fragmento biblioteca alcanzó un máximo de 130 pb, los fragmentos de la biblioteca se clonalmente amplificado por PCR en emulsión (Ion PGM Plantilla OT2, Life Technologies, Carlsbad, CA). Las partículas de la emulsión que contienen fragmentos de PCR amplificados por clonación se aplicaron luego en un chip de secuenciación de semiconductores (Ion 316 Chip, Life Technologies, Carlsbad, CA) para la secuenciación masiva en paralelo en un secuenciador Ion PGM (Life Technologies, Carlsbad, CA).

Objetivo secuenciación profunda

Los datos de secuenciación se guarda en formato BAM para el análisis de aguas abajo. La alineación de la secuencia se evaluó con Torrent Suite de Software V.3.6.2 (Life Technologies, Carlsbad, CA) para analizar código de barras lee y alinear las operaciones de lectura a la referencia del genoma (genoma humano build19; hg19). Para la detección de variaciones en la secuencia diana, el grado de cobertura de cada amplicón se estableció para obtener al menos la profundidad media de 1400 x de tumores primarios y 700 x para el ADN de plasma, donde se estableció la v3.6 Ion Torrent Variant Caller a una frecuencia de alelo por encima de 0,1% para una variante. Un Integrativa Genómica Visor (IGV, https://www.broadinstitute.org/igv/) también se utiliza para visualizar la alineación, lo que permitió por nosotros para inspeccionar las variaciones falsamente definidos por el capítulo sesgo y los errores de secuenciación.

identificación y detección de genes para MMS potenciales

MMS de los tumores primarios fueron designados para dar prioridad a las variantes de nucleótido único (SNVS) que eran susceptibles de ser detectado en ctDNA. La secuenciación dirigida desde el panel de cáncer identificado SNVS-tumorales único (es decir, mutaciones somáticas) mediante la comparación de resultados de la secuenciación del tumor primario y PBMCs (es decir, los polimorfismos de la línea germinal) correspondiente. En pocas palabras, el algoritmo para la identificación de mutaciones de tumor único es como sigue: (a) del filtro de corto lee (& lt; 50 nt) usando el archivo fastaq para el ADN del tumor, PBMCs, y plasma; (B) Mapa filtrada fragmentos en hg19 utilizando Burrows-Wheeler alineador para el ADN del tumor, PBMC y plasma; (C) detectar SNVS usando GATK Unificado Genotyper para el ADN del tumor o CMSP; (D) Lista SNVS-tumorales único mediante la comparación de SNVS del tumor y PBMCs; y (e) identificar mutaciones de tumor único de los SNVS-tumorales único que fueron mapeados en la secuencia diana de CHPv2. Todo el proceso de ejecución del algoritmo tarda seis horas utilizando una computadora de escritorio ordinario (procesadores Intel Core 2 Duo con 3 memoria que accede al azar GB) de 1,5 GB de datos de secuenciación. Las mutaciones de tumor único resultantes pueden ser utilizados como marcadores ctDNA. Nuestro algoritmo de casa en SNV identifica fragmentos de tumor primario que se detectan diferencialmente a partir de ADN de PBMC. Se permite la selección de los fragmentos con alta frecuencia de los alelos, que tiene una alta probabilidad de detección en ctDNA [11]. De las mutaciones que resulta tumorales-única en cualquier frecuencia de la variante SNVS, MMS para cada tumor se priorizan en función de los siguientes criterios: (a) la cobertura de más del 10 variante; (B) la cobertura de más de 5 variante, si no hay mutaciones tenían más de 10 Cobertura de la variante; y (c) la disponibilidad de QX200 validado
TM gotita Digital
TM PCR System (ddPCR, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) secuencias de cebadores y sondas (S1 tabla). La frecuencia de los alelos de MMS en el plasma fue supervisado por ddPCR utilizando los conjuntos de cebadores y sondas específicas.

ddPCR

Cada mezcla se prepara con 20 l de tampón de reacción, 2 x ddPCP Supermix para las sondas (Bio -Rad Laboratories, Hercules, CA), y el ADN plantilla 10 ng. Las mezclas de reacción de PCR se separaron en gotitas de emulsión de tamaño uniforme. Las gotas se distribuyeron en una microplaca de 96 pocillos para su uso con un termociclador convencional. Una reacción PCR estándar se utilizó de la siguiente manera: 40 ciclos de 94 ° C durante 30 s y 55 ° C durante 60 s; y una extensión final a 98 ° C durante 10 min, de los cuales la temperatura de recocido estaba sujeta a cambios dependiendo de los cebadores. El producto se almacenó a 4 ° C. El producto de PCR fue colocada en el lector QX200 gotita (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) y los resultados se analizaron mediante QuantaSoft v1.6 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA).

El análisis estadístico

de cualquier JMP 10.0 (SAS Institute, Cary, NC) o Prisma 6 (GraphPad Software Inc, La Jolla, CA) se utilizó para el análisis estadístico. valores y frecuencias clínico-patológicos y de secuenciación se analizaron mediante el χ
2 prueba, la prueba exacta de Fisher, y el estudiante
t-test
, en función de los grupos de sujetos.

Resultados

los pacientes

Entre mayo de 2013 y agosto de 2014, 37 pacientes con cáncer colorrectal avanzado y 22 tumores colorrectales resecables endoscópicamente fueron consentidos para el estudio antes de un diagnóstico histopatológico final. La inscripción de pacientes /individuos y visión general del estudio se presentan sanos (Figura 1). En el grupo de cirugía, seis pacientes eran elegibles: Se han encontrado cinco pacientes que tienen la enfermedad en estadio IV durante la cirugía y un paciente tenía múltiples lesiones de cáncer primario. Entre los pacientes elegibles, el proceso de adquisición de muestras falló en tres casos. Por lo tanto, 28 conjuntos de muestras total se obtuvieron de 31 pacientes elegibles. En el grupo de endoscopia, un paciente se negó a participar en el estudio, y un paciente tenía insuficiencia renal después de la admisión. Entre los pacientes elegibles, cuatro pacientes tenían tumores que eran demasiado pequeñas para el muestreo. Por lo tanto, 16 conjuntos de muestras total se obtuvieron de 20 pacientes elegibles. La sangre de 10 individuos sanos (es decir, los pacientes entre las edades de 22 y 68 años, tres hembras y siete machos) también se recolectaron utilizando el mismo consentimiento informado por escrito. Se encontró un voluntario que está embarazada después de tomar una muestra de sangre y por lo tanto descartado. En general, al menos un tipo de muestra se obtiene a partir de 60 individuos y se obtuvieron un total de 176 muestras de la serie de cuatro materiales de 44 pacientes (Fig 1). características clínico-patológicas de los pacientes (Tabla 1) y los niveles de marcadores tumorales (antígeno carcinoembrionario; CEA) se resumen (S1 figura). En el grupo de cirugía, 30 de 31 (96,8%) pacientes elegibles fueron observados durante al menos un año. Cuatro de los 30 (13,3%) pacientes con recaída y ninguno de los pacientes murieron durante el período de observación (mediana: 14,3 meses). Ninguno de los pacientes en el grupo de endoscopia aún no habían visitado nuestro hospital después de la resección del tumor a partir de febrero de 2015.

Todas las muestras se recogieron de forma prospectiva. Se recogieron muestras de los siguientes tres grupos; La cirugía, endoscopia voluntarios, y saludable. grupos de cirugía y endoscopia contienen Pre (plasma antes de la operación), CMSP, tumor, y Post muestras (plasma post-operatorio). Las muestras de pacientes que muestran enfermedad en estadio IV, tamaño de la muestra insuficiente, o la cantidad de ADN extraído insuficiente fueron excluidos del estudio (información detallada en el texto). El color de cada cuadro indica qué procedimientos se utilizaron para el análisis de cada tipo de muestra.

Evaluación de la calidad del ADN extraído

La mediana (rango) cantidad total de ADN a partir de tumores primarios, el ADN de plasma, y ​​PBMCs fue 9,4 g (1,4 a 12,0), 58,1 ng (15,4 a 915), y 4,7 g (03/02 a 10/03), respectivamente. El rendimiento de ADN en plasma fue suficiente para llevar a cabo ensayos de aguas abajo, incluyendo la construcción de la biblioteca de secuencias y ddPCR. La cantidad de ADN en plasma (rango; 83-5,435 ng /ml por plasma) exhibió correlación positiva muy alta (r = 0,9651, p & lt; 0,0001) con el número de copias de
LINE-1
(rango; 3,050,985 -232,689,225 copias /ml por plasma) (Fig S2). En general, nuestros resultados muestran que 22,9 ng de ADN, en promedio, se puede obtener de 1 ml de plasma.

Evaluación de la calidad de la Ion PGM secuenciador

Antes de material del paciente secuenciación, la calidad de secuenciación de Ion PGM se aseguró mediante el uso de ADN genómico diluido en serie a partir de la línea celular de cáncer de colon humano HCT116 claveteado en la solución de ADN genómico a partir de PBMCs de un voluntario sano (Fig 2). En primer lugar confirmó que las células HCT116 tienen 10 mutaciones de genes de los 50 genes de CHPv2 (S2 Tabla), mientras que el ADN voluntario humano sano no poseía mutaciones significativas. Con base en la información disponible al público, se ha informado de 1177 mutaciones en HCT116 (https://cansar.icr.ac.uk/cansar/cell-lines/HCT-116/mutations/#). Entre los 10 genes mutados que se encuentran en el presente estudio, 4 han sido registrados en la base de datos cósmico de HCT116, mientras que los 6 restantes eran novela. En particular, no hay mutaciones conocidas se perdieron en los 50 genes regulados por los conjuntos de cebadores en la CHPv2. Para hacer frente a la sensibilidad, el ADN genómico obtenido de un voluntario sano, se añadieron con el ADN genómico de la línea celular de cáncer de colon HCT116 en cuatro concentraciones diferentes (100, 1, 0,1, 0,01 y 0,001% en v /v) (Fig 2). La cobertura de secuencia media de todos los amplicones para las concentraciones enumeradas era 1287,7 (100%), 1456,7 (1%), 1412,5 (0,1%), 1708,2 (0,01%) y 1464,3 (0,001%), respectivamente. Además, los coeficientes de variación (CV) de las frecuencias de las variantes de los fragmentos mutados fueron 33,4% (100%), 49,9% (1,0%), 125,6% (0,1%), 84,7% (0,01%) y 115,6% (0,001 %), respectivamente. En general, el intervalo lineal razonable entre las concentraciones indicadas y se detecta la frecuencia de alelos con el secuenciador Ion PGM parecía ser entre 0,1 a 100%. Por lo tanto, la sensibilidad del proceso de secuenciación para las frecuencias de variación utilizando el Ion PGM es mayor que 0,1% con la secuencia de suficiente lee.

El eje horizontal indica la concentración de ADN de punta de la línea celular de cáncer de colon HCT116 en el solución de ADN de un donante no cáncer saludable. HCT116 es conocida por poseer varias mutaciones de genes y de este modo se diluyó en serie la concentración del fragmento de mutación. El eje vertical es la frecuencia del alelo que es detectada con el ion PGM. Cada punto de color indica la frecuencia del alelo detectado de mutaciones asociadas al cáncer en la concentración de ADN correspondiente derivado de HCT116 que van desde 0,001 hasta 100%. Los nombres de los genes mutados se indican en la leyenda a la derecha.

espectro mutacional de los tumores colorrectales identificados por CHPv2

Un total de 15.354.178 lee y se obtuvieron datos de la secuencia base de 1,636,525,575 de 27 tumores primarios y PBMCs correspondientes utilizando un secuenciador Ion PGM. Los genes mutados-tumorales únicos fueron identificados usando nuestro algoritmo desarrollado en la casa (ver pacientes y métodos). En primer lugar nos fijamos la frecuencia & gt alelo variante; 0,1% y se encontró que 440 de 885 alteraciones de genes eran mutaciones tumorales únicos basados ​​en la comparación entre PBMCs y tumores primarios. Secuenciación resultados de los tumores primarios obtenidos de la IonPGM fueron confirmados por ddPCR para las muestras que podrían ser evaluadas (S3 FIG). Para un análisis riguroso, la cobertura variante es uno de los factores importantes para la fiabilidad de datos (S4 FIG). Por lo tanto, el análisis se realizó con genes cuya cobertura variante fue & gt; 10, lo que resulta en un total de 128 mutaciones puntuales del gen (Fig 3A). Desde algunos casos poseían múltiples alteraciones en un solo gen, el número total de genes alterados en este estudio para el análisis fue de 73. Por lo tanto, la mutación promedio por tumor era 2,7 de los 50 genes (media ± 2 desviaciones estándar: 2,7 ± 2,9) . Veintiséis genes fueron mutados en al menos 1 de la muestra (26/50, 52%), mientras que 14 genes (14/50, 28%) se mutaron en solamente 1 muestra, respectivamente. genes mutados con frecuencia incluyen
TP53 gratis (19/27, 70%),
KRAS gratis (10/27, 37%), y
APC gratis (6/27, 22 %). Tres muestras de cáncer incluyen todas estas mutaciones, lo que sugiere que las alteraciones de la acumulación genética típicos para una secuencia adenoma-carcinoma pueden haber ocurrido en estas muestras [16, 17] (Fig 3B). Estas observaciones parecen apoyar los informes anteriores de la secuenciación del exoma de los tumores colorrectales en términos de captura de características mutacionales de los tumores de colon [18], lo que sugiere que el gen 50 asociada al cáncer establecer razonablemente recapitula el espectro mutacional de los tumores. La tasa de mutación basado en la longitud de PCR multiplex obtenido de CHPv2 y el número de mutaciones con cobertura & gt; 10 (73 genes mutados) fue de aproximadamente 2246 por 10
6 nucleótidos (es decir, 207 pares de cebadores de media PCR longitud del producto 157bp) , lo que sugiere que la CHPv2 se enriqueció en comparación con la tasa de detección de mutaciones de un exoma-secuencia, en la que una mayoría de los tumores colorrectales mostró 1-100 mutaciones por 10
6 nucleótidos [18].

a, tipos de mutación. Se detectaron seis tipos de mutaciones con CHPv2. b, el perfil de mutación tumoral-único de acuerdo a la frecuencia de los alelos. Cada columna indica una mutación tumor único de un tumor individual. Cada fila indica los genes asociados con el cáncer en CHPv2. El color indica la frecuencia de alelo variante se indica en la barra de colores.

Detección de MMS en el ADN de plasma

Los mediana (rango) los niveles de ADN en plasma de individuos sanos, tumores resecables endoscópicamente , y cánceres avanzados fueron 4.2 (02/06 a 10/04), 6,8 (2,1 a 100,6), y 9,2 (3,8 a 228,8) ng /ml en plasma, respectivamente (figura S5). Para la detección de mutaciones en el ADN de plasma, se seleccionaron 66 MMS desde los 320 SNVS-tumor único de acuerdo con los criterios descritos en Pacientes y Métodos. Las siguientes mutaciones, que se han reportado en muchos tipos diferentes de cáncer, aparecieron más de una vez en los tumores múltiples:
KRAS gratis (G12C) x2;
KRAS gratis (G12D) x4;
KRAS gratis (G12V) x3;
TP53 gratis (R273C) x2; y
BRAF gratis (V600E) x3, lo que resulta en un total de 57 MM únicos (S3 Tabla). MMs se investigaron primero usando el Ion PGM para los casos 1, 2 y 3, pero ninguno de los ocho MMs en el ADN en plasma mostraron una cobertura lo suficientemente alto como variante (Fig 4A y Tabla S4). Aunque algunos genes demostrado disminución de la frecuencia de alelos de una manera dependiente de la carga tumoral, el grado de cobertura no era lo suficientemente alto de forma fiable en el presente caso (Fig S6A).

a, MMS monitorizados con la frecuencia de mutación usando un alelo Ion PGM. Tres, uno y tres MMs se utilizaron para el seguimiento de los casos 1, 2 y 3, respectivamente. Se muestran los correspondientes niveles séricos de CEA. b, MMS monitorizados con la frecuencia de mutación del alelo por ddPCR. Uno o dos MM se utilizaron para el seguimiento en los casos representados. La línea de puntos horizontal muestra el límite superior del rango normal de los niveles séricos de CEA (3,4 ng /ml). Cada número junto a cada punto de datos es la frecuencia de los alelos de los genes; y los valores séricos de CEA.
ASTOP codón,
bSplice sitio.

Desde el Ion PGM no parecía ser lo suficientemente sensible para detectar alelos raros, hemos decidido utilizar para detectar ddPCR MM en pre y post ADN en plasma-operatorio. Aunque PCR digital requiere un cebador /sonda específicos fijados para cada mutación seguido de validación de la calidad por qPCR [10], la PCR digital es al menos 3 veces más sensible que la de secuenciadores profundas [19]. En el presente estudio, hemos sido capaces de validar los 19 conjuntos de cebadores /sondas únicas por qPCR para su uso en la cuantificación de las mutaciones en el plasma por ddPCR (S1 Tabla). Desde algunos casos tenían múltiples MM, el 19 de imprimación validado ddPCR /sonda fija representó un total de 24 MM de 19 casos (S5 Tabla). Once mutaciones (en 9 pacientes) que emparejados tumores primarios eran aparentemente presentes (frecuencia mínima alelo 0,032%) en el plasma preoperacional (figura 4B, el cuadro S5, y S6B figura). En el ADN de plasma post-operatorio, 8 de 24 (33,3%) MM mostró una tendencia decreciente que correspondió a 6 de los 19 pacientes (31,6%), incluyendo dos pacientes con múltiples MMS (Figura 4B y S6B FIG). Es importante destacar que el 100% (8 de 8) de MMS con & gt; 0,1% frecuencia de los alelos en el ADN de plasma previa a las operaciones exhibió una disminución en las muestras después de la operación (figura 4B), mientras que ninguno de los 16 MMs con menos de 0,1% frecuencia de los alelos en el ADN de plasma previa a las operaciones exhibió una disminución en plasma post-operatorio DNA (Fig 4B y Fig S6B). La tendencia disminuida obtenida mediante MMS con & gt; 0,1% frecuencia de los alelos correlaciona bien con los niveles séricos de CEA. Hubo 2 pacientes que habían recaído dentro del periodo de observación de un año (Caso 5 y 6). Ambos casos mostraron una clara disminución de MM en ctDNA postoperatorio (Figura 4B), pero no existe un perfil mutacional notable fue identificado en cualquiera de los casos.

Discusión

El conjunto de mutaciones de genes en un tumor es muy diversa. Por lo tanto, un conjunto individualizado de los genes mutados derivados del tumor debe ser biomarcadores adecuados para los sujetos individuales. el análisis del genoma entero y la secuencia exoma pueden no ser rentable para este propósito, ya que más del 99,99% de la secuencia del genoma o exoma en tumores primarios no presenta mutaciones [4, 18]. Aquí, se identificaron mutaciones de tumor único con una CHPv2 en Ion PGM y posteriormente supervisó la carga tumoral mediante MMS con ddPCR a partir de una cantidad extremadamente pequeña de ADN de plasma. Dado que nuestro enfoque parece ser suficiente para obtener una buena información mutacional calidad en comparación con el genoma entero o exoma tecnologías de secuencia, puede ser de inmediata aplicación en la práctica clínica
.
La utilidad de la detección de mutaciones en ctDNA se ha informado en altamente los pacientes con cáncer colorrectal avanzado, la mayoría de los cuales experimentaron recurrencia, progresión o muerte dentro de un año después del tratamiento inicial [1, 2, 5, 9, 20, 21]. Estos tumores muy avanzados (es decir, la fase IV) se considera que tienen un alto riesgo de recurrencia o progresión [22], por lo que el papel de los marcadores adicionales pueden ser limitado en la práctica actual. De hecho, la mayoría de los pacientes con cáncer colorrectal se puede tratar con intención curativa (es decir, la fase II-III), cuya 5 años las tasas libres de la enfermedad se han notificado a ser más o menos el 70% [23, 24], lo que sugiere que aproximadamente el 30 % de los pacientes aún requieren un cuidadoso seguimiento de la recaída. En la actualidad, el CEA es uno de los únicos marcadores moleculares para el uso rutinario en el seguimiento post-operatorio de seguimiento [25]. Sin embargo, se ha informado de que la ventaja de supervivencia mediante la monitorización de CEA y el tratamiento quirúrgico posterior es probable que sea pequeña [26]. Esta observación es probablemente debido al hecho de que el aumento de los niveles de CEA son: (i) un predictor pobre para la recurrencia local; y (ii) un evento relativamente tardía [27]. En contraste con CEA, ctDNA responde con prontitud, es específico de la carga tumoral, y es detectable independientemente del tipo histológico [2]. Sin embargo, hay que señalar que una de las cuestiones importantes de la utilización ctDNA en pacientes en estadio II-III es la sensibilidad de detección. La prevalencia de mutaciones primarias impulsada tumorales en ctDNA sólo tiene una frecuencia de alelo variante 0,1-10,0%, incluso en tumores altamente avanzada [10, 11, 28]. Por lo tanto, para ctDNA para ser utilizado como un marcador biológico, incluso para los pacientes con cáncer colorrectal Etapa I Etapa II-III o, idealmente, la sensibilidad es inferior a 0,1% [19]. Los recientes avances en las tecnologías digitales de secuenciación genómica, incluyendo cuentas, emulsión, amplificación, y el magnetismo (radiante) [29], amplicones marcados secuenciación profunda (Tam-Sec) [10], el sistema de seguridad-secuenciación (Safe-SEQs) [30] , errores suprimido secuenciación profunda multiplexado [31], y Duplex secuenciación [32] se han acercado a esta demanda sensibilidad. Estos métodos son de hecho muy precisa, pero no han sido plenamente aplicable para buscar mutaciones con múltiples amplicones a partir de un número de copias limitado de plantillas como ctDNA [30]. En el presente estudio, se identificó por primera vez mutaciones tumorales única por Ion PGM, y posteriormente se analizaron estas mutaciones usando ddPCR. El ddPCR requiere imprimación diseño /sonda y validación para la identificación anterior de cada mutación en el tumor primario, sino que no requiere de la piscina o secuenciación de profundidad. Se confirmó que ddPCR era adecuado para la medición cuantitativa de variantes raras a una fracción alelo mutante de 0,1% o más (una molécula mutante en un fondo de 1000 moléculas de tipo salvaje) [1, 33, 34]. Para el uso práctico de ctDNA como un marcador de vigilancia de la carga tumoral, sólo un pequeño número de mutaciones sin duda identificados a partir de tumores primarios podría ser marcadores fiables. Por lo tanto, nuestra estrategia actual es razonable para el seguimiento de la carga tumoral clínica particular para los pacientes recién operados con intención curativa.

alteraciones de los genes implicados en las primeras etapas de la tumorigénesis son aparentemente ventajosa como MMS, ya que deben participar en el establecimiento de clones tumorigénicos [4]. En principio, la heterogeneidad genética de un tumor ha sido considerado para ser el resultado de la acumulación heterogéneo de alteraciones genéticas en la parte superior de lesiones de cáncer precancerosas o temprana [35, 36]. De hecho, las mutaciones de
TP53
,
KRAS
,
KIT
, y
CDKN2A
fueron detectados en los tumores del grupo endoscopio así como cánceres avanzados, lo que sugiere que estas mutaciones son arrastradas en el proceso de desarrollo del cáncer y se extienden en toda la masa tumoral. Si una mutación dada se asocia con el desarrollo del cáncer temprano del tumor, entonces el sesgo de la detección de mutaciones en ctDNA debido a la heterogeneidad del tumor debe ser minimizado. Sin embargo, la identificación de genes que están involucrados específicamente en el desarrollo temprano de los tumores individuales puede ser un reto. En el presente estudio, puede ser difícil de abordar la heterogeneidad clonal de un tumor en el perfilado mutación con el pequeño panel de secuenciación de genes asociados con el cáncer de una sola biopsia por tumor primario. Idealmente, todas las mutaciones, incluyendo aquellos con bajas frecuencias de los alelos en el tumor primario de una sola biopsia, deben ser examinados en ctDNA. Sin embargo, la detección de extremadamente baja frecuencia de los alelos puede no ser factible todavía debido a la falta de ddPCR conjuntos de cebador /sonda para cada cambio de un solo nucleótido de todas las regiones de codificación. mutacional de perfiles con múltiples biopsias de un tumor puede ser una opción para compensar la heterogeneidad clonal, pero este enfoque no es aún posible que los pequeños tumores, como los pólipos y tumores resecables. Por lo tanto, la evaluación de la heterogeneidad clonal de un tumor no puede ser totalmente factible en cánceres tempranos. Mientras tanto, las mutaciones con alta prevalencia en primarias tumores de los MMS de un panel de secuenciación de genes asociados con el cáncer en el presente estudio, puede ser uno de los mejores sustitutos de este enfoque [11].

En resumen,