Extracto
microARN-210 (miR-210), el maestro hypoxamir, juega papeles pleiotrópicos en ciertos tipos de cáncer ; Sin embargo, su papel en el desarrollo de cáncer colorrectal humano sigue siendo poco clara. Aquí, nos informan que el miR-210 es con frecuencia hasta reguladas en tejidos de cáncer colorrectal, con la expresión de miR-210 alta correlación significativa con el tamaño grande del tumor, metástasis a los ganglios linfáticos, la enfermedad avanzada y de mal pronóstico. Funcionalmente, miR-210 sobreexpresión promueve la migración y la invasión de células de cáncer colorrectal. Además, miR-210 puede ser inducida por la hipoxia y media la metástasis hipoxia inducida de células de cáncer colorrectal. Además, la proteína de membrana vacuola 1 (VMP1) se identifica como el objetivo directo y funcional de miR-210. Por lo tanto, miR-210 es un biomarcador útil para las células tumorales hipóxicas y un factor de pronóstico que juega un papel esencial en la metástasis del cáncer colorrectal
Visto:. Qu A, Du L, Yang Y, Liu H, Li J, Wang L, et al. (2014) inducible por hipoxia miR-210 es un factor pronóstico independiente y contribuye a la metástasis en el cáncer colorrectal. PLoS ONE 9 (3): e90952. doi: 10.1371 /journal.pone.0090952
Editor: Fabio Martelli, IRCCS Policlinico San-Donato, Italia |
Recibido: 19 de septiembre de 2013; Aceptado: 6 Febrero 2014; Publicado: 14 de marzo 2014
Derechos de Autor © 2014 Qu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Nº 81271916, 81301506); Fundación provincia de Shandong Ciencias Naturales de China (Nº ZR2010H004); Fondo de Investigación del Programa de Doctorado de Educación Superior de China (Nº 20120131110055) y la Clave Clínica de Especialidades Médicas Fundación Nacional. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer colorrectal (CRC) sigue siendo el tercer cáncer más común en todo el mundo y representa la quinta causa principal de muerte relacionada con el cáncer en china [1]. A pesar de las recientes mejoras en las técnicas de diagnóstico y manejo clínico han aumentado la detección precoz del CRC y la disminución de la tasa de mortalidad, aproximadamente el 25% de los pacientes con CCR presentan con enfermedad en estadio IV [1]. Además, los pacientes con enfermedad avanzada frecuentemente desarrollan la enfermedad recurrente después de resecciones radicales extendidos, mostrando por consiguiente tasas de supervivencia muy pobre debido a metástasis [2], y la tasa de supervivencia posquirúrgica 5-años cae de 90% a 10% o incluso menos después que ha ocurrido la metástasis . Un creciente número de estudios han demostrado que tanto las células tumorales y factores microambientales orquestan los eventos críticos que conducen a la metástasis [3], enfatizando así la necesidad de entender mejor el microambiente del tumor y de los mecanismos moleculares implicados en la metástasis tumoral.
la hipoxia, o baja tensión de oxígeno, es una característica común de microambiente del tumor sólido. tumores hipóxicos tienden a ser más agresivo, más propensos a metastatizar, más resistentes a las terapias convencionales, y están asociados con un mal pronóstico [4] - [6]. El gen que codifica HIF1 (factor inducible por hipoxia-1), que se compone de las subunidades HIF1α y HIF1β, es quizás la más estudiada gen que juega un papel esencial en la respuesta a la hipoxia [7]. HIF1α es estable bajo condiciones de hipoxia, con su expresión rápidamente decreciente en condiciones de normoxia, mientras que HIF1β se expresa constitutivamente en ambas condiciones [8]. Se está acumulando evidencia acerca de la importancia de la expresión HIF1α en varios tumores sólidos [9] - [11], y el aumento de la expresión HIF1α Recientemente se ha informado de contribuir a la metástasis del cáncer colorrectal [12], [13]
microARN. (miRNAs, MIR) son una nueva clase de endógenos, pequeños oligonucleótidos de ARN, no codificantes que regulan la expresión de genes por la orientación la región no traducida 3 '(3'-UTR) del correspondiente ARNm [14], [15]. La desregulación de miRNAs es un proceso clave conocida en la patogénesis de muchos tipos de cáncer y puede ocurrir en cualquier momento, desde el inicio hasta la metástasis. Existe una relación funcional entre la hipoxia y la desregulación de microARN en el cáncer. Por ejemplo, Chen H ha informado de que el miR-103/107 se incrementó en presencia de hipoxia y podría contribuir a la metástasis hipoxia estimulada en el CCR [16]. Muchos microARN, como miR-21, 93, 103, 107, 192, 195, 210, y 213, pueden ser inducidas y marcadamente hasta reguladas por HIF1α en las células cancerosas en condiciones de hipoxia [17], [18]. Entre los miRNAs inducidos por HIF1α, miRNA-210 es el más destacado y constantemente hasta reguladas miARN durante la respuesta hipóxica en diferentes tipos de células tumorales y las células normales [19], [20]. Recientemente, Ying et al. mostró que la hipoxia inducida por el miR-210 podría aumentar la migración y la invasión del carcinoma hepatocelular (HCC) [21], y redova y sus colegas encontraron que la regulación a la baja de miR-210 inhibe el potencial migratorio e invasivo del carcinoma de células renales (CCR) [ ,,,0],22], Rothé informó resultados similares en el cáncer de mama [23]. La mayoría de los estudios han demostrado que el miR-210 puede actuar como un miARN oncogénicos y se asocia con un mal pronóstico en algunos cánceres epiteliales humanos [21], [24] - [26]. Sin embargo, algunos estudios han indicado que la expresión de miR-210 se pierde durante la tumorigénesis y que el miARN ejerce un efecto supresor de tumores de carcinoma de ovario humano epitelial y esofágico de células escamosas [27], [28]. Estos datos indican que miR-210 puede desempeñar un papel crucial durante la tumorigénesis y la progresión del cáncer y puede ejercer diversos efectos en diferentes tipos de cáncer. Aunque se ha informado de que miR-210 se expresa y en gran medida hasta reguladas en respuesta a la hipoxia en las líneas celulares de CRC (HCT-116 y HT-29), la función de miR-210 en el cáncer colorrectal no se ha elucidado hasta la fecha, y su papel en la progresión del cáncer colorrectal sigue siendo poco clara.
en el presente estudio, nos centramos en el miR-210, la hipoxia inducida por miARN, y se examinó su expresión en tejidos humanos CRC, analizó su correlación con las características clínico-patológicas y pronóstico y, a continuación, al descubierto el papel de miR-210 en la metástasis hipoxia inducida durante la progresión del cáncer colorrectal.
Materiales y Métodos
Pacientes y muestras de tejidos
las muestras de tejido, incluyendo tejidos tumorales y tejidos no cancerosos adyacentes, se obtuvieron de 193 pacientes con CRC en el momento de la cirugía en el Departamento de cirugía general, Qilu hospital de la Universidad de Shandong, Jinan, china, entre junio de 2003 y febrero de 2008. Ninguno de los pacientes tuvo alguna vez recibido cualquier quimioterapia, radioterapia, o cirugía. Todos los tejidos se colocaron inmediatamente en nitrógeno líquido y se congelaron a -80 ° C hasta la extracción de ARN. Este estudio fue aprobado por el Comité Ético del Hospital Qilu, la Universidad de Shandong, y el consentimiento informado por escrito se obtuvo de cada paciente.
Los datos clínico-patológicos, incluyendo el sexo, edad, localización del tumor, el estadio del tumor, el tamaño del tumor, locales invasión, la diferenciación histológica y la metástasis de los ganglios linfáticos se recogieron de forma retrospectiva. La duración del seguimiento se calculó a partir de la fecha de la cirugía a la muerte o el último seguimiento, y que completó el seguimiento en abril de 2012. Los pacientes fueron excluidos del análisis de las características clínico-patológicos y pronóstico si tenían registros médicos incompletos o seguimiento inadecuado.
cultivo de células
CRC líneas celulares (HT-29, SW480, SW620 y) y HEK (riñón embrionario humano) línea celular 293T se adquirieron de la Colección de Cultivos Tipo la Academia de Ciencias de china (Shanghai, china), y la línea celular HCT116 fue adquirido de Shanghai Instituto de Bioquímica y Biología celular (República Popular china). Todas las líneas celulares se cultivaron en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM; hialina, Logan, UT) que contenía suero bovino fetal al 10% (FBS; Gibco, Carlsbad, CA) a 37 ° C en un CO 5%
2 incubadora. Para inducir la hipoxia, las células fueron expuestas a un flujo constante de una mezcla de gas pobre en oxígeno (1% O
2, 5% de CO
2, y 94% N
2) en una cámara de incubación humidificada (MiniGalaxy, RSBiotech, Irvine, Escocia).
El aislamiento de ARN, síntesis de ADNc, y reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real cuantitativa (QRT-PCR)
El ARN total fue extraído por medio de reactivo TRIzol (Invitrogen , Carlsbad, CA) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Todas las manipulaciones de la RNA se llevaron a cabo bajo condiciones libres de RNasa. La concentración de ARN se midió utilizando un BioPhotometer más (Eppendorf, Hamburgo, Alemania) a 260 nm, y el ARN aislado se almacenó a -80 ° C hasta su uso. Para el análisis de la expresión HIF1α y VMP1mRNA, el ARN total (1 g) se transcribió de forma inversa en ADNc utilizando el kit Superscript (Toyobo, Osaka, Japón), y QRT-PCR análisis se realizaron utilizando SYBR Green (Toyobo, Osaka, Japón) y un sistema ABI PRISM 7500 de detección de secuencias (Applied Biosystems, Foster City, CA). Los cambios veces en HIF1α y expresión VMP1 ARNm se cuantificaron utilizando el
-ΔΔCT método de cuantificación relativa 2 con β-actina como control de limpieza. Los cebadores para la β-actina (cebador directo: 5'-TGGAGTCCTGTGGCATCCACGAAA-3 ', el cebador inverso: 5'-TGTAACGCAACTAAGTCATAGTCCG-3'), HIF-1α (cebador directo: 5'-ATCGCGGGGACCGATT-3 ', cebador inverso: 5' -CGACGTTCAGAACTTATCTTTTTCTT-3 5'-TTGCTCCACTATGTGCTTGC-3 ') fueron adquiridos de BioSune, Shanghai, china:') y VMP1 (cebador directo: 5'-GAGATGCTGGAACATGCAGA-3 ', cebador inverso. Para la expresión de los genes miARN, se sintetizó ADNc utilizando cebadores específicos del gen (Ribobio, Guangzhou, China) y el kit M-MLV RT (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) en un volumen de reacción de 20 l. Los reactivos de la reacción de RT contenían 1 g plantilla de ARN, 1 l de 10 mM dNTP mix, 2 l de DTT 0,1 M, 4 l 5 x tampón de primera cadena, y 1 l 40 inhibidor de RNasa U /l. El volumen se ajustó con libre de ARN H
2O. La reacción de transcripción inversa se realizó por triplicado para eliminar cualquier valor atípico. miARN expresión se evaluó mediante qRT-PCR y un sistema ABI PRISM 7500 de detección de secuencias (Applied Biosystems, Foster City, CA). Los cambios veces en la expresión de los genes miARN se determinaron utilizando el método 2
-ΔΔCT; la expresión se normalizó al pequeño nivel de expresión de ARN U6 nuclear (U6). Además, la expresión relativa de los genes miARN, HIF1α y VMP1 en células HT-29 cortada como calibrador en cada carrera y se fijó en el valor de 1.
La transfección con miARN /plásmido
CRC Las células se sembraron a una densidad de 5 × 10
4 células /pocillo en placas de 24 pocillos o en el 1,5 × 10
5 células /pocillo en placas de 6 pocillos y se cultivaron aproximadamente 24 h antes de la transfección. Después de que las células alcanzaron 50% de confluencia, la transfección transitoria de los genes miARN imita /inhibidor (RiboBio, Guangzhou, China) y /o el plásmido se llevaron a cabo utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) siguiendo las instrucciones del fabricante. Para cada experimento, las eficacias de transfección se evaluaron mediante qRT-PCR a las 24 h después de la transfección.
migración y la invasión ensayos in vitro
cámaras
Transwell (diámetro de 6,5 mm, tamaño de poro de 8 micras ) (Corning, NY, EE.UU.), recubierta con o sin Matrigel (BD Biosciences, Franklin Lakes, Nueva Jersey, EE.UU.) se utilizaron para llevar a cabo los ensayos de migración e invasión. A las 24 h después de la transfección, el HT-29 (5 × 10
4 células) o SW480 (1 × 10
5 células) se volvieron a suspender las células en un medio que contiene 1% de FBS y se colocan en la cámara superior de cada inserto. Se añadió una alícuota de medio que contenía FBS al 10% (500 l) a las cámaras inferiores. Después de la incubación durante 24 horas a 37 ° C, las células que se adhieren a la membrana inferior se tiñeron con 0,1% de cristal violeta, la imagen (200 ×), y se contaron usando un microscopio invertido IX81 (Olympus, Tokio, Japón).
luciferasa ensayo
ensayo indicador de luciferasa se llevó a cabo utilizando los vectores PMIR-ReportTM (RiboBio, Guangzhou, china) que contiene el tipo salvaje (WT) -VMP1 3'-UTR secuencias o mutante (MUT) -VMP1 3 'secuencias-UTR. HEK293T células se cotransfectaron transitoriamente con miR-210 /imita el control negativo y miR-WT-VMP1 3'-UTR del vector /MUT VMP1 3'-UTR del vector. Las actividades de luciferasa se midieron usando el kit de ensayo de luciferasa Dual-(Promega, Madison, WI) según las instrucciones del fabricante 48 h después de la transfección.
Western blot
La proteína total de las células cultivadas se extrajo por RIPA tampón que contenía PMSF. se utilizó BCA kit de ensayo de proteínas (Beyotime, Haimen, China) para determinar la concentración. Las proteínas se separó a través de SDS-PAGE y se transfirieron a membranas de PVDF. Después del bloqueo, la membrana se incubó con anti-VMP1 anticuerpo de ratón policlonal (Abcam, Southampton, Reino Unido) o anti-β-actina anticuerpo monoclonal de ratón (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EE.UU.), seguido de incubación con conjugado con HRP anticuerpos secundarios (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EE.UU.). Las señales se determinaron mediante un kit de detección de quimioluminiscencia (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ).
El análisis estadístico
El SPSS (Statistical Package for the Social Sciences) paquete de software, versión 18.0 (Chicago, IL, EE.UU.), se utilizó para analizar todos los datos. En primer lugar, se utilizó la prueba de Kolmogorov-Smirnov para determinar la distribución de los datos en cada grupo. Los datos se presentan como la media ± desviación estándar (DE) o mediana (rango intercuartil) cuando los valores se distribuyen normal o anormal, respectivamente. Las diferencias estadísticas entre los grupos fueron evaluados mediante la prueba de Mann-Whitney
T-test
,
t-test
, o una prueba de Kruskal-Wallis de Student, según el caso. La correlación entre miR-210 y HIF1α (o VMP1) se determinó por análisis de correlación de Pearson. El método de Kaplan-Meier se utilizó para estimar la supervivencia, y las diferencias de supervivencia entre los subgrupos se examinaron mediante la prueba de log-rank. Se aplicó un modelo de regresión de Cox (modelo de riesgo proporcional) para el análisis multivariado y análisis univariado de los factores pronósticos. Las diferencias se consideraron estadísticamente significativa sólo cuando
P
. & Lt; 0,05
Resultados
miR-210 es con frecuencia hasta reguladas en tejidos de cáncer colorrectal y participa en el desarrollo CRC
Los niveles de expresión de miR-210 en 193 pares de tejidos humanos y CRC correspondientes tejidos no cancerosos fueron examinadas usando QRT-PCR. Con el fin de asegurar que el U6 gen de referencia no cambia entre los tejidos tumorales y tejidos no cancerosos correspondientes, se calcularon los valores medios de Ct como 2
-CT. El nivel de U6 no mostró diferencias significativas entre el tumor y las correspondientes muestras no cancerosas (2
-CtTumor /2
-CtNon canceroso = 0,93;
P
= 0,34) (Figura S1 ). Los resultados indicaron que el miR-210 expresión en los tejidos CRC fue significativamente hasta reguladas en comparación con la de los tejidos normales adyacentes (
P Hotel & lt; 0,001, Fig. 1A). Además, 58% (111 de 193) de las muestras muestra la regulación positiva de más de 2 veces de miR-210 en comparación con las muestras de tejidos no cancerosos, lo que implica que la sobreexpresión de miR-210 es un acontecimiento común en CRC. En un experimento controlado, también encontramos el miR-21, otro de miR sobreexpresada en el CCR [29], fue significativamente hasta reguladas en los tejidos de CRC en comparación con los tejidos no tumorales adyacentes (
P Hotel & lt; 0,001, Figura S2 ), lo que confirma la viabilidad y fiabilidad de nuestro método. Además, la expresión en los tejidos HIF1α CRC fue hasta reguladas (
P Hotel & lt; 0,001; Figura 1D) y se correlacionó positivamente con el miR-210 expresión en tejidos de CRC (r = 0,402,
P & lt
; 0.01; Fig. 1E)
(a) miR-210 expresión se ensayó usando QRT-PCR en 193 pares de tejidos humanos de CRC (CRC) y los tejidos no tumorales adyacentes (NT), y su expresión. se normalizó al nivel de expresión U6 ARN pequeño nuclear (U6) en cada muestra. (B) Doblar cambios en la expresión de miR-210 en cada muestra pareada. Los datos se representan como un registro
2 veces el cambio (cáncer /normal), que se definió como & gt; 1 (sobreexpresión) y & lt; -1 (subexpresión); los restantes cambios veces se definieron como sin cambios. (C) La sobreexpresión de miR-210 se encontró en 58% (111 de 193) de los tejidos de CRC en comparación con los tejidos no tumorales adyacentes. la expresión (D) HIF1α mRNA se detectó en los tejidos de CRC (CRC) y los tejidos no tumorales adyacentes (NT), y su expresión se normalizó al nivel de expresión de β-actina en cada muestra. (E) La correlación entre la expresión de miR-210 y los niveles de mRNA en tejidos HIF1α CRC se analizaron mediante análisis de correlación de Pearson. (F) de Kaplan-Meier de supervivencia global de acuerdo con el nivel de expresión de miR-210. Los pacientes con alta expresión de miR-210 tuvieron una tasa significativamente más pobre global a 5 años de supervivencia que aquellos con baja expresión de miR-210 (
P Hotel & lt; 0,001). La mediana de miR-210 nivel de expresión en las muestras tumorales fue elegido como el punto de corte.
resumen aún más la asociación de miR-210 niveles de expresión con diferentes características clínico-patológicas en tejidos de CRC y encontraron que la expresión de miR-210 se correlacionó significativamente con el tamaño grande del tumor (
P = 0,014
), invasión local (
P = 0,047
), metástasis a los ganglios linfáticos regionales positivos (
P
= 0,001), y el estadio TNM (
P
= 0,005). Sin embargo, no hubo asociaciones significativas entre el miR-210 expresión y el sexo del paciente, edad, localización del tumor, o el grado histológico (todo el
P Hotel & gt; 0,05). Los resultados detallados de las pruebas estadísticas entre la expresión de miR-210 y las características clinicopatológicas se enumeran en la Tabla 1.
miR-210 es un marcador pronóstico independiente de la supervivencia global de los pacientes con CCR
Un total de 50 pacientes murieron durante el período de seguimiento, y la tasa de supervivencia global a los 5 años acumulada fue de 56,9%. El uso de la mediana de los miR-210 niveles de expresión como un punto de corte, se dividió a los 116 pacientes con CCR en dos grupos: un grupo de alta expresión de miR-210 y un grupo de baja expresión de miR-210. A continuación, utiliza el análisis de la curva de supervivencia de Kaplan-Meier para evaluar el valor pronóstico de miR-210 en el cáncer colorrectal. Los resultados mostraron que los pacientes con alta expresión de miR-210 tenían un pronóstico significativamente peor que aquellos con baja expresión de miR-210 (
P Hotel & lt; 0,001, figura 1F.). Para evaluar si la expresión de miR-210 era un indicador independiente de la supervivencia global de pacientes con CRC, se aplicó por primera vez un modelo de regresión de riesgos proporcionales de Cox univariante para estimar el índice de riesgo individual para todos los parámetros clínico. Los resultados mostraron que la supervivencia global fue significativamente relacionados con el nivel de expresión de miR-210 (RR = 2,621; IC del 95%, 1,457-4,712;
P
= 0,001) y otros cuatro parámetros (tamaño tumoral, invasión local, metástasis en ganglios linfáticos regionales, y el estadio TNM, todos
P Hotel & lt; 0,05). En el análisis multivariado, el modelo de riesgos proporcionales de Cox que involucra los cinco factores pronósticos significativos identificados expresión de miR-210 como un factor pronóstico independiente para pacientes con CCR (
P
= 0,008). Los valores estadísticos de la expresión de miR-210 y los otros parámetros clínico-patológicos derivados del modelo de regresión de riesgos proporcionales de Cox se enumeran en la Tabla 2.
miR-210 se expresa en líneas celulares de CRC y es inducida por la hipoxia CRC en células
Hemos examinado el nivel de expresión de miR-210 en un panel de líneas celulares de CRC, incluyendo HCT-116, HT-29, SW620 y SW480. Los resultados mostraron que el nivel de miR-210 fue más alta en las células HT-29 en comparación con las otras tres líneas celulares, y su nivel fue más bajo en las células SW480 (Fig. 2A). Sobre la base de este patrón de expresión, por lo tanto elegimos HT-29 y SW480 para los siguientes estudios. Tal como se presenta en la Figura 2D y 2E, se encontró que los niveles de miR-210 aumentó en respuesta a la hipoxia en estas células. Por otra parte, la expresión de miR-210 aumentó en gran medida con la exposición prolongada a la hipoxia, lo que indica que el miR-210 fue de hecho inducido por la hipoxia en las líneas celulares de CRC.
(A) miR-210 expresión en líneas celulares de CRC. las células (B, C) la expresión de mRNA en HIF1α HT-29 (B) y SW480 (C) en condiciones de hipoxia. (D, E) miR-210 expresión en HT-29 (D) y SW480 (E) células en condiciones hipóxicas. Los datos se presentan como la media de tres medidas, y las barras de error representan la desviación estándar de la media. *
P
. & Lt; 0,05
miR-210 promueve la migración celular y la invasión CRC y media la migración inducida por hipoxia y la invasión de las células CRC
Para medir las propiedades biológicas de miR-210 en células CRC, transitoriamente modulan el nivel de expresión de miR-210 por transfección con el miR-210 imita o inhibidor. Como se muestra en la Figura 3, la eficacia de transfección fue muy alto en las líneas celulares HT-29 y SW480. Se llevaron a cabo experimentos Transwell con o sin Matrigel para probar el efecto de miR-210 en la migración celular CRC y la invasión, y nos pareció que la regulación al alza de miR-210 por los miR-210 imita mejoró la capacidad de migración e invasión de células CRC (Fig . 4A, 4C). De acuerdo con estos resultados, la transfección con el inhibidor de miR-210 dio lugar a una disminución significativa en la capacidad de migración y la invasión de las células de CRC en comparación con las células transfectadas con el control negativo de miR (Fig. 4B, 4D). Tomados en conjunto, nuestras observaciones indican que el miR-210 podría promover la capacidad de migración e invasión de células CRC.
(, C a) miR-210 en expresión HT-29 (A) y células SW480
(C) se aumentó significativamente después de la transfección con los miR-210 imita. expresión (B, D) miR-210 en células SW480 (C) HT-29 (A) y se disminuyó considerablemente después de la transfección con el inhibidor de miR-210. Los datos se presentan como la media de tres medidas, y las barras de error representan la desviación estándar de la media. *
P
. & Lt; 0,05 en comparación con el control negativo correspondiente
(A, B) los ensayos de migración Transwell de células HT-29 y SW480 se llevaron a cabo después de la transfección con el miR 210 imita (A) o un inhibidor de (B). ensayos de invasión (C, D) Transwell de células HT-29 y SW480 se realizaron después de la transfección con los miR-210 imita (C) o inhibidor (D). En todos los paneles, los resultados son representativos de al menos tres experimentos independientes. Carolina del Norte, control negativo.
Debido a que hemos demostrado miR-210 podría aumentar el potencial de la migración y la invasión de las células de CRC, la hipótesis de que el miR-210 también podría mediar la migración inducida por hipoxia y la invasión de las células CRC . Para confirmar esta hipótesis, se realizó transwell ensayos para examinar el potencial de la migración y la invasión de las células CRC en condiciones hipóxicas y encontramos que la capacidad de migración y la invasión de estas células CRC se incrementaron significativamente en comparación con las células bajo condiciones de normoxia. Por otra parte, la transfección con el inhibidor de miR-210 disminuye drásticamente la capacidad de migración y la invasión de las células hipóxicas CRC, mientras que la transfección con los miR-210 imita mejora aún más la capacidad de migración y la invasión de las células de CRC (Fig. 5). Los resultados anteriores demuestran que el miR-210 juega un papel importante en la migración inducida por hipoxia y la invasión de células de CRC.
ensayos (A, B) de migración Transwell y la invasión de células HT-29 y SW480 se realizaron después de transfección con los miR-210 imita o el control negativo (CN) en condiciones de normoxia o hipoxia. migración (C, D) Transwell y ensayos de invasión de células HT-29 y SW480 se realizaron después de la transfección con el inhibidor de miR-210 o el control negativo en condiciones de normoxia o condiciones de hipoxia. En todos los paneles, los resultados son representativos de al menos tres experimentos independientes.
VMP1 es un objetivo directo de miR-210
TargetScan identifica que 3'-UTR de VMP1 contiene predijo sitio de unión para el miR-210 (Fig. 6A). ensayo de actividad luciferasa mostró que miR-210 inhibió significativamente la actividad de luciferasa de la WT 3'-UTR, pero no el Mut 3'-UTR de VMP1 en células HEK293T (Fig. 6B). Por otra parte, la sobreexpresión de miR-210 inhibió significativamente VMP1 mRNA y los niveles de proteína en las células HT-29 y SW480 (Fig. 6C, 6D) y el nivel VMP1 fue inversamente correlacionados con el miR-210 expresión en tejidos CRC primarios (r = -0,318,
P
& lt; 0.01; Fig. 6E). Estos datos sugieren fuertemente que el miR-210 regula negativamente la expresión VMP1 atacando directamente a sus secuencias 3'-UTR.
(A) El putativo de miR-210 secuencias de unión en VMP1 3'-UTR. ensayo (B) La actividad de luciferasa se realizó para las células HEK293T cotransfectadas con vectores PMIR-Report ™ contienen WT-VMP1 3'-UTR o MUT-VMP1 3'-UTR secuencias y miR-210 imita. Los datos se presentan como cambio veces normalizada en la actividad de luciferasa. (C, D) ARNm y proteínas VMP1 se determinaron en células HT-29 y células SW480 transfectadas con el miR-210 imita o control de miR-negativo por QRT-PCR y Western blot, respectivamente. (E) Correlación inversa entre la expresión de miR-210 y los niveles de mRNA en tejidos VMP1 CRC se analizaron mediante análisis de correlación de Pearson.
La sobreexpresión de VMP1 invierte parcialmente la migración y la invasión de las células CRC inducidos por el miR-210
Para determinar si VMP1 está implicada en la metástasis inducida por el miR-210 de células CRC, hemos realizado ensayos de rescate. Como se muestra en la Figura 7, miR-210 imita podrían aumentar la capacidad metastásica de las células de CRC y la disminución de potencial metastásico se observó en células VMP1 sobreexpresan en comparación con las células de control. Por otra parte, la sobreexpresión concomitante de miR-210 y VMP1 podría derogar parcialmente el potencial metastásico inducida por el miR-210 en células CRC. Estos resultados demuestran que el miR-210 puede promover la migración celular y la invasión CRC apuntando VMP1.
(A, B) migración y la invasión Transwell ensayos se realizaron en VMP1 sobreexpresan las células HT-29 cotransfectadas con miR-210 imita o un control negativo. ensayos de migración e invasión (C, D) Transwell se realizaron en VMP1 sobreexpresan SW480 células cotransfectadas con miR-210 imita o control negativo. En todos los paneles, los resultados son representativos de al menos tres experimentos independientes.
Discusión
La hipoxia es una característica predominante de la mayoría de los tumores sólidos, y el robusto miARN inducida por hipoxia, miR-210 es considerado actualmente como el "maestro" de miRNA de la respuesta a la hipoxia [15]. En consecuencia, es importante explorar las posibles funciones de miR-210 en la progresión del tumor sólido, ya que este miARN se ha demostrado jugar un papel clave en el desarrollo del cáncer en condiciones de hipoxia [21], [30]. Nuestros resultados proporcionan la primera evidencia de que el miR-210 se sobreexpresa en los tejidos de CRC y funciona como un factor clave en la progresión del CRC.
La expresión desregulada de miR-210 se ha demostrado fehacientemente en diferentes tumores malignos humanos. Cai et al. mostró que la expresión de miR-210 fue significativamente mayor en los pacientes pediátricos de osteosarcoma y se asoció significativamente con las características clínico-agresivas y un mal pronóstico [31]. Sin embargo, Tsuchiya [32] informó de que el miR-210 expresión se downregulated notablemente en los pacientes con carcinoma de células escamosas de esófago pobremente diferenciado. Por el contrario, Greither et al. [33] informó de que no hubo correlaciones estadísticamente significativas entre la expresión de miR-210 y las características clínico agresivo en el sarcoma de tejidos blandos. Estos resultados discordantes pueden explicarse por las diferentes funciones que el miR-210 podría desempeñar en la patogénesis de diferentes tipos de cáncer. Aquí, hemos detectado una regulación positiva marcada de la expresión de miR-210 en los tejidos de CRC, y miR-210 sobreexpresión se correlacionó significativamente con las características clínico-agresivos, como un gran tamaño tumoral, metástasis a los ganglios linfáticos regionales positivos, invasión local del tumor, y un avanzado clínica escenario. También se encontró que el nivel de miR-210 se correlacionó positivamente con la expresión HIF1α que estaba relacionado con la metástasis y el pronóstico desfavorable de CRC [12], [13]. Estos hallazgos indican que el miR-210 puede desempeñar un papel importante en el desarrollo del fenotipo progresiva de CRC.
En lo que respecta a la supervivencia, se realizaron análisis univariados y multivariados para explorar el potencial valor pronóstico de miR-210 en el CCR . Los resultados del análisis univariado demostró que los pacientes con altos niveles de miR-210 tenían un peor pronóstico que aquellos con un nivel de miR-210 inferior. Por otra parte, los resultados del análisis multivariado del modelo de regresión de riesgos proporcionales de Cox mostraron que el miR-210 fue un factor pronóstico independiente de supervivencia general de los pacientes después de la cirugía. Estos resultados están de acuerdo con los estudios reportados por campamentos y otros. en cáncer de mama [34] y Gee et al. en cáncer de cabeza y cuello [35]. Junto con nuestros resultados, estos resultados indican que el miR-210 podría ser un marcador pronóstico prometedor para identificar a los pacientes con un mal pronóstico.
La exploración funcional de miR-210 se indica que el miR-210 juega un papel clave en muchas celular procesos involucrados en condiciones fisiológicas y malignos. MiR-210 puede estar implicado en la eritropoyesis y también puede promover la adipogénesis [36], [37]. Como el más consistente y robusta hasta reguladas miARN en condiciones de hipoxia, miR-210 regula muchos aspectos de las vías de hipoxia, tales como la respuesta angiogénica de las células endoteliales a la hipoxia [38]. Resultados consistentes han demostrado que la expresión arriba regulada de miR-210 está implicado en la vía en el cáncer de mama [34] de señalización hipoxia /VEGF. En el cáncer de ovario epitelial, sin embargo, el miR-210 a menudo se elimina y puede inhibir la progresión del ciclo celular [27].
En el presente estudio, encontramos que la sobreexpresión de miR-210 marcadamente promovió la migración y la invasión de células CRC. Nuestros datos implican que el miR-210 actúa como un miARN oncogénicos en el cáncer colorrectal humano para promover la metástasis, lo cual es consistente con los hallazgos de estudios anteriores [21] - [23]. También confirmó los hallazgos previos que mostraron que el miR-210 fue hasta reguladas en las células de CRC en respuesta a la hipoxia y que el miR-210 fue inducida en una forma dependiente del tiempo. Estos resultados indican que miR-210 también es un marcador de hipoxia en pacientes con CRC, como lo es en otros tipos de cáncer, tales como cáncer de cabeza y cuello [35]. Además, hemos encontrado que el miR-210 mediada la migración inducida por hipoxia y la invasión de las células CRC. Por lo tanto, además de sus papeles en la adaptación de las células tumorales a la tensión baja de oxígeno y como un marcador de hipoxia tumoral, que sugieren que los niveles elevados de miR-210 pueden tener funciones biológicas asociadas con la malignidad y metástasis de tumores, que podría explicar ¿por qué el miR-210 se asocia con un mal pronóstico en pacientes con cáncer. Investigaciones posteriores revelaron que VMP1 era el objetivo funcional de aguas abajo de miR-210 en el CCR. VMP1 es una proteína transmembrana localizado en vacuolas intracelulares que fue descrito originalmente como una proteína asociada a la pancreatitis aguda [39]. En metástasis de cáncer de riñón y líneas de células de cáncer de mama metastásico, VMP1 se reduce [40]. Y en HCC, VMP1 es identificado como un objetivo corriente abajo de miR-210 y la menor VMP1 se correlaciona con la metástasis de tumores [21]. De acuerdo con estos estudios, se encontró que VMP1 también se reduce en las muestras de CRC y actúa para suprimir el potencial metastásico del tumor.