Extracto
La deprivación androgénica (EA) es un método eficaz para suprimir inicialmente progresión del cáncer de próstata (PC). Sin embargo, las células PC andrógenos refractario surgen inevitablemente del tumor andrógeno-sensible, conduciendo a la enfermedad incurable. Estudios recientes han demostrado AD induce senescencia celular, un fenómeno que es células de manera autónoma tumor supresor pero que confiere adaptaciones promotores de tumores que pueden facilitar la aparición de poblaciones de células malignas de senescencia resistente. Debido a que las células PC refractario a los andrógenos emergen por clonación del tumor inicialmente sensibles a andrógenos, hemos tratado de investigar si la senescencia inducida AD-(ADIS) afecta a la adquisición del comportamiento refractario a los andrógenos en células LNCaP de cáncer de próstata y LAPC4 sensibles a andrógenos. Encontramos que la exposición repetida de estas células sensibles a andrógenos a los estímulos inductores de la senescencia a través de AD cíclico conduce a la rápida aparición de células resistentes a ADIS, andrógenos refractario de la población de células senescentes a granel. Nuestros resultados muestran que el fenotipo ADIS se asocia con rasgos promotores de tumores, en particular la quimiorresistencia y mecanismos pro-supervivencia mejoradas, tales como la inhibición de la muerte celular mediada por p53, que fomentan la persistencia de las células senescentes. Encontramos también que la aplicación farmacológica de la activación de p53 /Bax través Nutlin-3 antes de la creación de ADIS se requiere para superar la respuesta pro-supervivencia asociada y preferentemente desencadenar la muerte celular generalizada en lugar de la senescencia durante el año. Así, nuestro estudio demuestra que ADIS promueve la derivación de células PC-andrógenos refractario y, en consecuencia, una respuesta subóptima supresor de tumores a AD
Visto:. Burton DGA, Giribaldi MG, Munoz A, K Halvorsen, Patel A, Jorda M, et al. (2013) inducida por privación de andrógenos senescencia promueve la derivación de células andrógeno-cáncer de próstata refractario. PLoS ONE 8 (6): e68003. doi: 10.1371 /journal.pone.0068003
Editor: Irina U. Agoulnik, Universidad Internacional de la Florida, Estados Unidos de América
Recibido: 8 de noviembre de 2012; Aceptado: 28-may de 2013; Publicado: 28 Junio 2013
Derechos de Autor © 2013 Burton et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue financiado por un nuevo premio Investigador Biomed Florida Bankhead Coley, de la Universidad de Miami /Centro de cáncer Sylvester Integral del Desarrollo de Papanicolaou Cuerpo de Investigación del cáncer Grant y la Universidad de Miami /Stanley premio de la Fundación Glaser (a PR). MGG fue parcialmente apoyado por un Premio de Investigación de Pregrado Centro de Cáncer Integral Sylvester verano. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de próstata (PC) es una de las neoplasias más frecuentes en los hombres y una causa principal de muertes relacionadas con el cáncer. Para la enfermedad avanzada, la terapia de privación de andrógenos es el régimen de tratamiento principal debido a la dependencia crítica de tejido prostático de los andrógenos para la proliferación y la supervivencia [1]. Sin embargo, la eventual aparición de tumores andrógeno-refractario, que ya no responden favorablemente a la retirada de andrógenos, reduce la esperanza de vida del paciente a menos de dos años ya que estos tumores son poco sensibles a tratamientos adicionales [2], [3]. Los mecanismos moleculares que dan lugar a estos tumores andrógeno-refractario no se conocen bien. investigación sustancial se ha centrado en los receptores de andrógenos (AR) de señalización e implica aberraciones relacionadas AR-incluyendo la amplificación de genes, independiente de ligando o la activación basada en ligando promiscuo y expresión co-regulador alterado [2], [4] - [7]. vías no AR se cree que participan en la proliferación andrógeno-refractario incluyen derivación de control de la proliferación basado en la AR a través de activación de oncogenes o regulación a la baja supresor de tumor, alterado regulación de la cromatina de la transcripción génica, la alteración de la maquinaria de control del ciclo celular y la expresión elevada de enzimas esteroidogénicas [8 ] - [14]
sin embargo, muchos estudios de investigación de estos mecanismos que examinen en el contexto de los modelos avanzados de cáncer de próstata y no se ocupan de los primeros cambios que se requieren para la evasión de la supresión de tumores inducidos por AD.. Este es un tema importante porque, a pesar de su alto efecto inicial inhibidor de tumores [15], AD no mata todas las células de cáncer de próstata sensibles a andrógenos, sino más bien induce una detención proliferativa en una subpoblación significativa [16]. Teniendo en cuenta que las poblaciones de células andrógeno-refractario se caracterizan por la adquisición o mejora de las vías pro-tumorigénicos con el estrés de protección [8], [10], [17], las propiedades de estas células con la proliferación arrestado es probable que sean importantes para comprender cómo surgen subpoblaciones andrógenos refractario. De hecho, es posible que un subconjunto de estas células detenidas salir estasis proliferativa y dejara de responder a AD. En apoyo de esta idea, se ha informado de que los tumores de próstata se componen de mezclas de células heterogéneas en términos de respuesta de andrógenos [18], y surgen que las células de andrógenos refractario como una población variante seleccionada de las células sensibles a andrógenos parentales [18], [19]. Además, en consonancia con el fenotipo clínico, prolongada (& gt; 6 meses)
in vitro Francia culture andrógenos ablación de líneas celulares de cáncer de próstata sensibles a andrógenos conduce a la eventual consecuencia de clones de abstinencia resistente a andrógenos de la inicialmente crecimiento población -arrested [8], [20]. Por lo tanto, dilucidar los mecanismos moleculares que subyacen a la detención del crecimiento inducido por AD-es fundamental para definir la etiología de la PC refractario a los andrógenos.
Las características moleculares de la detención del crecimiento inducido AD-incluyen un bloque G1 /S, la reducción actividad quinasa dependiente de ciclina, hypophosphorylated Rb, y abrogación del fenotipo detenido a través de la introducción de la oncoproteína, SV40 antígeno T grande [21]. Estos rasgos son consistentes con la detención inducida AD-ser una forma de senescencia celular [22], y dos estudios recientes han informado de que las células de andrógenos privados de desarrollar marcadores moleculares consistentes con la senescencia [23], [24]. Modelos de la tumorigénesis de oncogenes impulsada han demostrado que la senescencia inducida por oncogenes conduce a presiones selectivas que promueven la excrecencia de las subpoblaciones de células tumorales agresivas senescencia resistente [25] - [27]. Sin embargo, este aspecto promotora de tumores de la senescencia no ha, a nuestro conocimiento, ha explorado previamente para la hormona de la senescencia retirada asociada. Por lo tanto, diseñamos nuestro estudio para determinar si un paradigma similar, a saber, la evasión de la senescencia inducida AD-(ADIS), opera en la generación de células de cáncer de próstata refractario a los andrógenos de la población parental andrógeno-sensible. De acuerdo con ello, en este estudio, hemos utilizado las líneas celulares LNCaP y LAPC4 de PC, se sabe que poseen las principales características sobresalientes de las células tumorales prostáticas sensibles a andrógenos incluyendo robusto receptor de andrógenos y expresión del antígeno específico de la próstata, una mayor proliferación en respuesta a los andrógenos y el cese de proliferación en la privación de andrógenos, y la incapacidad para formar tumores en ratones castrados. Hemos cultivado estas células en el suero tratado con carbón vegetal (CSS) que contienen los medios de comunicación para recapitular AD en la cultura. Nuestro objetivo fue caracterizar las vías moleculares asociadas con ADIS y para determinar si se podría aislar variantes resistentes a la senescencia capaces de proliferar bajo AD.
Nuestros resultados demuestran que ADIS conduce a la adquisición de rasgos promotores de tumores, tales como una mayor mecanismos favor de la supervivencia y la quimio-resistencia. De manera significativa, la presencia sostenida de los estímulos que inducen la senescencia a través de AD cíclica facilita la expansión de LNCaP refractario a los andrógenos ADIS-resistente y LAPC4 variantes dentro de un período de semanas. Estas variantes se imprimen parcialmente con características pro-supervivencia asociados con la senescencia a pesar de ser ADIS-resistente. Por lo tanto, nuestros resultados apoyan colectivamente un papel para el fenotipo senescente para engendrar cambios que promueven la aparición de células tumorales andrógeno-refractario.
Materiales y Métodos
Ética Declaración
Todas las investigaciones en seres humanos ha sido aprobado por la Universidad de Miami Junta de Revisión Institucional. El aprobados por el IRB dispensa del consentimiento para este protocolo.
Cell Cultura y
LNCaP y LAPC4 células (ATCC) se cultivaron en medio RPMI-1640 (Gibco, Invitrogen) suplementado con suero bovino fetal al 5% (FBS; Gibco, Invitrogen) o 5% de suero bovino fetal tratado con carbón vegetal (CSS; Gibco, Invitrogen) y 100 unidades /ml de penicilina /estreptomicina (Gibco, Invitrogen) a 37 ° C en 21% de oxígeno /5% de CO
2. Para los cultivos quiescentes, las células se cultivaron como anteriormente, pero en ausencia de cualquier suero.
Switchback (SB) método para generar andrógenos refractario ADIS resistente LNCaP Variantes
células LNCaP fueron sembradas en cualquiera 10 cm platos (3 × 10
5 células) o 15 platos cm (1 x 10
6 células) en RPMI 5% de FBS durante 36-48 horas antes de ser cambiados a RPMI 5% CSS. Se reemplazó el medio cada 3-4 días durante 14 días, para inducir ADIS, después de lo cual los cultivos fueron restaurados a 5% FBS RPMI. A consecuencia de las colonias de células visibles, las células se trataron con tripsina y se expandieron por uno o dos pasajes antes se repitió el procedimiento.
Creación y transducción estable de shRNA y construcciones de proteína fluorescente que expresan
El retroviral pWZL GFP construir -blast fue un regalo del laboratorio del Dr. Robert Weinberg. Los vectores shRNA se generaron como se describe anteriormente [28], [29]. secuencias candidatas validados o muy marcados de la biblioteca TRC amplio consorcio shRNA (http://www.broadinstitute.org/genome_bio/trc/publicSearchForHairpinsForm.php) se seleccionaron y se subclonaron en el vector lentiviral pLKO.1 con un cassette de resistencia a la puromicina. Los oligonucleótidos se compraron a Integrated DNA Technologies, Inc. Las construcciones se secuenciaron para asegurar la presencia del inserto. El control shRNA fue atacado frente a GFP: 5'-GCAAGCTGACCCTGAAGTTCA-3 '. Se utilizaron las siguientes secuencias diana:
shp53: 5'GACTCCAGTGGTAATCTACTT 3 ', España
shp16: 5'GCATGGAGCCTTCGGCTGACT 3'
El Shar construir [30] fue un regalo de el Dr. Kerry Burnstein en la Universidad de Miami y fue dirigido contra la secuencia siguiente:. 5 'GAAAGCACTGCTACTCTTCAGCATTATTC 3'
Lentiviral o producción retroviral se llevó a cabo en las células HEK 293T y la infección de las células diana se realizaron como se ha descrito previamente [29]. Se seleccionaron las células transducidas en 2 mg /ml que contiene puromicina o 10 mg /ml blastocidin que contiene los medios de comunicación (para células SB5 GFP) para un período mínimo de 5-7 días (que corresponden al tiempo empleado para que las células no transducidas a morir completamente en la selección medios de comunicación). Para shRNAs, desmontables proteína se verificó a través de Western Blot. expresión de GFP en las células SB5 se verificó mediante formación de imágenes de epifluorescencia y análisis de citometría de flujo.
Western Blotting y anticuerpos utilizados
Las células se recogieron por raspado mecánico en hielo y se lisaron en un fluoruro de sodio (NAF ) tampón que contiene vanadato de sodio, PMSF, DTT y el inhibidor de proteinasa. Las concentraciones de proteínas se midieron usando el reactivo de Bradford (Biorad). 30 a 50 g de proteína total se ejecuta en un Bis-Tris gel NuPage pre-cast 4-12% (Invitrogen) en el sistema de gel Novex prefabricado y posteriormente transferidos a una sección de la membrana de PVDF (Immobilon, Millipore EMD) a 30 V a 4 ° C. Las transferencias se tiñeron en el reactivo Ponceau para determinar incluso la carga y transferencia, se lavaron en 0,1% TBST y luego probaron con anticuerpos contra las proteínas siguientes: AR (sc-816, Santa Cruz Biotech), p53 (sc-126, Santa Cruz Biotech), p21 (sc-817, Santa Cruz Biotech) p16
INK4 (554079, BD Biosciences), ciclina A (sc-751, Santa Cruz Biotech), GAPDH (AB9485, Abcam) Bcl-2 (sc-492, Santa Cruz Biotech), Bax (sc-493, Santa Cruz Biotech) MCL-1 (sc-819, Santa Cruz Biotech), Bak (06-536, Millipore), fosfo-Akt (4060, Cell Signaling) total de Akt (9272, Cell señalización) escindido con PARP (9541, Cell Signaling), survivina (71G4B7, señalización celular), TAp63 (618.902, BioLegend), p27 (sc-528, Santa Cruz Biotech), deltaNp63 (619.002, BioLegend). Después de la incubación con los anticuerpos conjugados con peroxidasa de rábano picante secundario apropiado (Amersham), manchas de transferencia se desarrollaron utilizando la ECL Plus (GE Healthcare) solución de revelado. Después de inmunotransferencia, las membranas fueron teñidas con Coomassie colorante azul (Sigma) para normalizar la carga de proteínas totales.
Análisis del ciclo celular
Aproximadamente 1 × 10
se cosecharon 6 células a través de tripsinización. Las células se lavaron una vez en medio que contiene suero frío, dos veces en PBS frío y después se resuspendieron en 200 ul de PBS 2 mM de EDTA. Se añadieron aproximadamente 600 l de etanol frío al 70% gota a gota a las células, mientras que vórtex ellos a velocidad media. Las células se mantuvieron a 4 ° C durante la noche para la fijación. Antes del análisis, las células se centrifugaron a 4 ° C a 1000 rpm durante 5 minutos y el etanol cuidadosamente aspirado. Los sedimentos celulares resultantes se resuspendieron en 0,5 ml de PBS EDTA 2 mM y 10 l inactivado por calor RNasa A (10 mg /ml, Sigma). A partir de entonces, 25 l de yoduro de propidio (PI) se añadió (1 mg /ml, Sigma) a la suspensión celular. Las células se incubaron a 37 ° C en un baño de agua durante 30 minutos e inmediatamente se ensayaron en un flujo Accuri C6 citómetro (BD) utilizando el láser de excitación PI (FL2). El porcentaje de células en cada fase del ciclo celular se determinó en el citómetro de Cflow Plus software, Análisis Cflow 202.1, por área de medición bajo el segmento correspondiente del perfil (como se muestra). Los perfiles se relabeled en MS Excel para mayor claridad.
Las mediciones de proliferación celular
Para determinar las tasas de proliferación celular de células LNCaP en ambos FBS y CSS medios que contienen, 1 × 10
5 fueron sembradas en placas de 6 cm y el recuento de células, utilizando un hemocitómetro, se llevaron a cabo cada 24 horas, por triplicado durante un período de seis días usando un hemocitómetro. medio fresco se añadió cada 2-3 días. Para los experimentos de rescate en la Fig. 1D, las células fueron sembradas en medios de FBS durante 24 horas antes de cambiar a los medios de comunicación CSS. Las células se volvieron a utilizar los medios de comunicación FBS en los puntos de tiempo indicados.
(A) La senescencia asociado beta-galactosidasa (SA-beta-gal) tinción en las condiciones indicadas y los puntos de tiempo. FBS, suero bovino fetal indicando cultura andrógenos repleta; CSS, suero tratado con carbón vegetal que indica andrógeno cultura privados. 9D FBS post-SEN denotan células LNCaP que fueron sometidos a 14 días de cultivo CSS y luego se cambiaron a medios de SFB durante 9 días. La cuantificación de células teñidas positivamente se presenta a la derecha de las imágenes representativas. (B) tinción Ki67 marcador pan-proliferación se muestra en las condiciones indicadas y los puntos de tiempo. DAPI se utiliza para marcar los núcleos celulares con el propósito de contar células Ki67 positivas. Porcentaje de células teñidas se grafica a la derecha. (C) de propidio análisis del ciclo celular yoduro, en los puntos de tiempo indicados y condiciones de cultivo. Tenga en cuenta la fracción de la fase S se reduce de 15,6% en FBS al 0,4% a 10d CSS y al 0,8% después de la restauración de los medios de SFB durante 9 días (9D FBS post-SEN). (D) la curva de proliferación de células LNCaP cultivadas en CSS para 3, 8 o 14 días antes de ser cambiado de nuevo a los medios de FBS. (E) Medición de los niveles de ROS en total a través de citometría de flujo en células LNCaP en día 1, día 4 y día 7 de condiciones de cultivo indicadas. Tenga en cuenta el pico desplazado a la derecha en rojo correspondiente al aumento de los niveles de ROS en las células LNCaP CSS-cultivadas relación con las células cultivadas FBS. (F) de ADN de doble filamento romper (OSD) focos detectados a través de H2AX /53BP1 co-tinción (verde = H2AX, rojo = 53BP1) para las células LNCaP cultivadas en las condiciones indicadas. se muestran imágenes representativas de células con los diferentes números de focos contados. Tenga en cuenta que el porcentaje de células con 5+ focos aumenta con la duración de la cultura CSS.
Experimentos de co-cultivo celular y Análisis
Para los experimentos de co-cultivo, 1 × 10
5 células LNCaP-SB5-GFP (generado a partir de células SB0 LNCaP de forma estable transducidas con pWZL-bLAST GFP) se sembraron por cuadruplicado en una placa de 10 cm, ya sea solo o co-mezclados con 1 × 10
5 LNCaP no marcado SB0, SB5 o células LNAI. Las células se sembraron inicialmente en 5% de SFB medio completo (día 0) y en el día 1, los co-cultivos se cambiaron a los medios de comunicación CSS 5% y se mantuvieron durante 7 días, con un cambio de medio cada tres días CSS. culturas representativas se analizaron por duplicado por citometría de flujo en un citómetro de Accuri C6 en el Día 1 para asegurar un número relativamente equivalentes de células verdes y no verdes fueron sobrevivir en la cultura. El uso de las células SB5-GFP chapados solo, gating se llevó a cabo en el canal de FITC para separar las células GFP de las células no-GFP. Las células fueron cerrada más para excluir partículas de bajo FSC /SSC para asegurar que se están analizando sólo las poblaciones de células vivas. En el día 7, la citometría de flujo se utilizó para determinar los porcentajes relativos de GFP-positivas frente a las poblaciones de células no marcadas, así como el número total de células positivas para GFP (SB5). Histogramas y gráficos de puntos se representaron usando el software BD Accuri Análisis C6 para Mac OSX. Todas las mediciones se llevaron a cabo por duplicado en un mínimo de dos experimentos independientes.
senescencia asociada Beta-galactosidasa actividad (SA-beta-gal)
tinción SA-beta-gal se llevó a cabo como se describe en otra parte [31]. Brevemente, las células se lavaron en PBS, se fijaron en 0,2% de glutaraldehído durante 5 min a temperatura ambiente, se lavaron una vez en PBS y se incubaron durante la noche en solución de tinción-recién hecho (1 mg /ml 5-bromo-4-cloro-3-indolil β-galactosidasa (Sigma), 150 mM de NaCl, 2 mM de MgCl
2, 5 mM de K
3Fe (CN)
6, 5 mM de K
4Fe (CN)
6, 40 NaPi mM, pH 6,0). El día siguiente, las células se incubaron durante una hora más a 37 ° C para intensificar la tinción y luego se lava y se almacena en PBS a 4 ° C. Para cuantificar la tinción positiva, & gt; 100 células fueron contados para cada muestra en varios campos de visión con el fin de obtener una desviación estándar. Los experimentos se llevaron a cabo al menos por duplicado, en dos experimentos independientes.
tinción Ki67
Para la detección de la tinción de Ki67, las células se sembraron a 2 x 10
4 células por cámara y se dejaron durante 36-48 horas antes de que cualquiera de cambiar a CSS, el tratamiento bicalutamida o fijación para FBS sólo muestras. Las células se fijaron en paraformaldehído al 4% (16% de stock, Electron ciencias de microscopía) durante 10 minutos a temperatura ambiente, seguido de permeabilización en 0,1% PBST (10 min a RT), y se bloquearon durante 1 hora en 0,1% Triton X, 15% de FBS , en PBS a RT. El anticuerpo Ki67 (Santa Cruz) se diluyó 1:50 en tampón de bloqueo y se incubó a 4 ° C durante la noche. Las células se lavaron 5 veces, 10 minutos cada vez a temperatura ambiente en solución de bloqueo en un agitador. Se añadió el anticuerpo secundario conjugado con fluoróforo apropiado (de cabra anti-ratón-FITC, Santa Cruz) en una dilución 1:100 en tampón de bloqueo y se incubó durante 1 hora a TA en la oscuridad. Las células se lavaron 5 veces en 0,1 TritonX, 10 minutos cada vez en un agitador a temperatura ambiente en la oscuridad. se añadió DAPI medios de montaje (Vectashield) antes de cubreobjetos de montaje. imágenes de inmunofluorescencia fueron adquiridas en una cámara Nikon unido a un microscopio Zeiss vertical.
H2AX /53BP1 tinción
tinción H2AX /53BP1 se llevó a cabo como se describe en otra parte [28]. Brevemente, se sembraron 20.000 células por cámara (BD Falcon, 4-cámara de diapositivas de cultivo) en RPMI 5% de FBS y cambiaron a RPMI 5% CSS 24 horas más tarde. H2AX /tinción 53BP1 se llevó a cabo en los puntos de tiempo indicados. Las células fueron fotografiadas en condiciones de adquisición idénticos en un 6000 B microscopio digital inversa Leica DMI con una cámara DFC350 FX adjunto y el software de fluorescencia FW4000 I. Sólo co-localizados H2AX /53BP1 focos fueron contados como positivo y un mínimo de 100 células se obtuvo a través de múltiples campos.
Tratamiento de Drogas de células LNCaP
p>
t-test
con p & lt de Student de dos colas;. 0,05 consideró significativo
transcriptasa inversa-PCR
ARN total fue aislado de células LNCaP cultivadas en FBS y los medios de CSS durante 14 días, utilizando el Kit RNAqueous-4PCR (Ambion). Un total de 1 g de ARN purificado fue inverso-transcrito utilizando un cebador aleatorio, incluido en el kit, para obtener ADNc a través de la alta capacidad de cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems). El cDNA se utilizó como molde para la amplificación por PCR usando AmpliTaq Gold ® 360 Master Mix (Applied Biosystems) y los cebadores fueron los siguientes
GAPDH cebador directo:.
5 'GACCCCTTCATTGACCTCAAC 3'
GAPDH cebador inverso: cebador directo
'CTTCTCCATGGTGGTGAAGA 3'
IL8 5:
5 'TTTTGCCAAGGAGTGCTAAAGA 3'
IL8 cebador inverso :
5 'AACCCTCTGCACCCAGTTTTC 3'
Los productos de reacción se corrieron en gel de agarosa al 1,5% con bromuro de etidio. GAPDH se utilizó como un control de normalización interna.
Medición de la muerte celular
tratadas y se recogieron las células de control, se resuspendieron en PBS, y se diluyeron 1:01 en 0,4% Trypan blue (Invitrogen). células no teñidas muertas (azul) y vivir de inmediato contaron usando un hemocitómetro. El porcentaje de células muertas se determinó a partir de al menos tres experimentos independientes realizados por duplicado.
Medición de los niveles celulares ROS
El ensayo se llevó a cabo como se describe anteriormente [28]. En resumen, se recogieron las células en confluencia indicadas equivalente a través de tripsinización, se lavaron en helado de solución salina tamponada de Hank 1X (HBSS) y se incubaron con recién preparada 5- (y-6) -chloromethyl-2 ', 7'-diacetato de diclorofluoresceína ( CM-DCF-DA; Molecular Probes /Invitrogen, C6827) durante 20 minutos a 37 ° C. Después, las células se lavaron y se resuspendieron en 1X HBSS antes de la detección de la señal de FITC a través de células activadas por fluorescencia (FACS). análisis de citometría de flujo se realizó en un citómetro de Accuri C6 (BD Biosciences). El eje x representa el canal FITC (FL1) la intensidad de fluorescencia en el diario de escala y el eje y representa el número de células. Los experimentos se llevaron a cabo al menos por duplicado, con perfiles representativos se muestran.
Cristal Violeta tinción
Aproximadamente 3 × 10
5 células fueron sembradas en placas de 10 cm que contenían RPMI más del 5% FBS durante 36-48 horas antes de cambiar a RPMI más 5% de CSS. El medio se actualiza cada 3-4 días. Para la tinción de cristal violeta, se aspiró el medio y las células se lavaron una vez en 1X PBS, se añadió solución de cristal violeta al 1% a cada placa y se dejó manchar durante 2 minutos a temperatura ambiente. La tinción se retiró y cada plato aclaró dos veces en agua desionizada. Los platos se sumergieron en agua durante 20-30 minutos para lixiviar el exceso de colorante y reducir el fondo, y se dejan durante la noche al aire seco antes de contar las colonias o la toma de fotografías. Los experimentos se llevaron a cabo por duplicado
Análisis estadístico
La significación estadística de los resultados se determinó mediante el cálculo de la desviación estándar de la media y por la prueba t de Student de dos colas, con p. & Lt; 0,05 considerados significativo.
resultados y Conclusiones
Características de ADIS en células LNCaP y LAPC4
con el fin de confirmar si la detención proliferativa observada tras la AD se debe a la inducción de la senescencia celular , se utilizó la línea celular sensible a andrógenos bien caracterizado LNCaP ya que posee versiones funcionales de la senescencia tanto importante que median en las vías, p53 y p16
INK4a [32], [33]. Además, congruente con los modelos clínicos de cáncer de próstata, células LNCaP muestran excrecencias espontáneas de variantes de andrógenos refractario siguientes cultivo a largo plazo en medios de andrógenos empobrecido en [20], [34]. En consecuencia, cultivamos células LNCaP en un medio que contenía CSS (en lo sucesivo, la cultura CSS) para imitar AD y la emergencia de tasación de los marcadores de senescencia celular.
Hemos encontrado que, además de la detención proliferativa esperado (Fig. S1A ) y la adquisición de una morfología neuroendocrina [35] (Fig. 1A), las células LNCaP CSS-cultivadas también desarrolló otros marcadores distintos de la senescencia celular (Fig. 1) [36]. Estos incluyen el aumento de la senescencia asociada a beta-galactosidasa (SA-beta-gal) actividad (fig. 1A), disminución de la tinción para el marcador de proliferación sartén, Ki67 (fig. 1B) y un arresto S ciclo G1 /célula (Fig. 1C ). Después de 7 días en cultivo CSS, & gt; 50% de células mostraron estas características y por 10 días en CSS, que la fracción se elevó a & gt; 80% de la población mayor (Fig 1A-B.). El tratamiento con el anti-andrógenos, bicalutamida, el cese de proliferación también inducida y la aparición de un fenotipo senescente, determinada por tinción SA-beta-gal y un G1 /S detención (Fig. S1). Por el contrario, se observó muerte celular mínima sobre CSS o bicalutamida tratamiento como se juzga por la falta visual de células redondeadas, no unidas y la expresión de PARP escindida (datos no mostrados). Significativamente cuando las células fueron restaurados a suero bovino fetal de andrógenos repleta (FBS) medios siguientes 14 días de cultivo CSS, la población mayor retenidos marcadores senescentes (que se muestran en el caso de la restauración de repletar la cultura de SFB durante 9 días, denotados como 9D FBS puesto -sen), lo que indica que la detención proliferación es permanente y no de naturaleza transitoria (Fig. 1A-C).
a fin de distinguir la detención proliferación de la cultura inducida CSS del fenómeno temporal de la quiescencia celular, se cultivó células LNCaP en un medio libre de suero, se sabe que inducen la quiescencia [37], por 7 días en paralelo con células cultivadas en medios de CSS. A partir de entonces cambiamos los dos conjuntos de células de nuevo a los medios de SFB durante 4 días. Considerando que las células LNCaP sometidas a cultivo libre de suero reanudado la proliferación en la restauración de los medios de comunicación completa, que corresponde a un aumento en el marcador de proliferación, ciclina A, las células CSS-cultivadas no lo hicieron (Fig. S2). Como las células LNCaP se someten a ningún duplicaciones adicionales de población, una vez colocada bajo la cultura de andrógenos-privada (Fig. S1 A), pero tomar hasta 4 días para mostrar adquisición significativa de los marcadores de senescencia (Fig. 1A, B), quisimos determinar si esta detención proliferación era reversible antes de 4 días de agotamiento de andrógenos. Para ello, las células LNCaP se volvieron a utilizar los medios de andrógenos repleta a los 3, 8 o 14 días después de la CSS de cultivo (Fig. 1D). Encontramos que las células cambiaron de nuevo a los medios FBS al día 3 eran fácilmente capaz de reanudar la proliferación. En comparación, las células cambiaron a repletar los medios de comunicación en el día 8 no reanudaron la proliferación completo, pero un subconjunto de estas células fueron capaces de seguir dividiendo, lo que sugiere una población celular irreversible parcial detenidos. De acuerdo con nuestros resultados en la Fig. 1A-B, no se observó proliferación cuando las células se cambiaron de nuevo a los medios de comunicación completa después de 14 días en cultivo CSS (Fig. 1D). Por lo tanto, en conjunto, nuestros resultados verifican que AD induce las principales características de la senescencia celular en las células LNCaP.
El fenotipo ADIS se observa en las células LNCaP fue precedido por el aumento progresivo de los niveles totales de ROS celulares, observó a sólo un día después de cambiar las células a los medios de CSS (Fig. 1E), así como por la aparición de progresivamente mayores cantidades de co-localizada gamma-H2AX y 53BP1 focos (Fig. 1F). Estos focos son indicativos de una respuesta de daño en el ADN de montaje (DDR), presumiblemente en respuesta a daños en el ADN sin reparar persistente [28], [38]. La elevación asociada a ADIS en los niveles de ROS y focos daño en el ADN son consistentes con la etiología conocida de la senescencia celular [36], lo que refuerza aún más que AD genera tensiones aguas arriba sabe para accionar la senescencia celular.
ADIS está mediada por la p16
Camino INK4a y asociado con la supresión de la ruta de p53
Dos de las principales vías de supresores de tumores, p53 /p21
Cip1 /Waf1 y p16
INK4a, normalmente median la senescencia [39], [ ,,,0],40]. Dependiendo del tipo de célula o factor de estrés, el fenotipo senescente se asocia con la activación de una o ambas vías de [39], [41]. Sin embargo, incluso si se activan ambas vías, se puede predominar para hacer cumplir el fenotipo senescente [28], [40]. De acuerdo con ello que analizaron las células LNCaP a aumentar la duración de la cultura CSS mediante el sondeo lisados de proteínas totales de estas muestras para los niveles de las proteínas que median en la senescencia, p16
INK4a y p53 /p21
Cip1 /WAF1. Como era de esperar, la expresión de AR disminuyó con el aumento de la duración de la cultura CSS (Fig. 2A). Aunque,
a priori
, la existencia de un DDR persistente (Fig. 1F) nos llevó a esperar que la vía de p53 /p21 estaría implicado, encontramos en cambio que ADIS se asoció con el aumento de la expresión de p16
INK4a (Fig. 2A). Sorprendentemente niveles de p53 y su proteína reguladora del ciclo de las células efectoras, p21
Cip1 /Waf1, disminuyó con el aumento de la duración de la cultura CSS (Fig. 2A). Además, la adición de 10 nM dihidrotestosterona (DHT) a los medios de CSS fue capaz de prevenir tanto la disminución observada en los niveles de AR y de ciclina A y los cambios asociados-ADIS a p16
INK4a y la expresión de p53 (Fig. S3A). Este hallazgo verifica estos cambios moleculares se producen específicamente debido a la ausencia de andrógeno en el medio de cultivo.
(A) La inmunotransferencia se llevó a cabo en aproximadamente 35 g de las muestras de proteína indicados con anticuerpos contra las proteínas denotados. Tinción con azul de Coomassie se utilizó para normalizar para la carga de proteína total. Tenga en cuenta que la expresión AR disminuye como se esperaba en la cultura CSS. La tendencia de la p53, p21 y la proteína p16 expresión se mantiene después de la restauración de andrógenos repleta cultura post-senescencia (post-SEN) que indica la permanencia de los cambios. (B) La inmunotransferencia que muestra los efectos de la precipitación mediada por shRNA de p16 en ADIS. Nota niveles elevados de AR y ciclina A en células shp16 bajo CSS cultura en relación al control o células shp53 desmontables. (C) Efecto de la supresión de p16 en la tinción SA-beta-gal. Las células indicadas se cultivaron en CSS durante 14 días y luego se cambiaron a FBS- que contiene los medios de comunicación durante 9 días. Tenga en cuenta la disminución observada en la tinción SA-beta-gal en las células shp16. * P & lt;.
0,05
De manera significativa, p16
INK4a niveles de expresión se mantuvo alta y p53 /p21 se mantuvieron bajas en la población mayor, incluso después de la cultura repleta de andrógenos fue restaurada (Fig. 2A). Esta observación apoya la permanencia de los circuitos molecular asociada a la senescencia activado por la cultura de andrógenos privado a pesar de la recuperación parcial de los niveles de expresión de AR (Fig. 2A). p16 elevada
niveles INK4a junto con la elevada tinción SA-beta-gal, reducción de la proliferación y la disminución de AR y ciclina A expresión también se observó después del cultivo CSS del andrógeno-sensibles, pero la línea celular LAPC4 p53 mutante [32] (fig. S4A-D). 5A.