Extracto
El cáncer de ovario es una de las principales causas de muerte entre las mujeres y se requiere con urgencia el desarrollo de nuevos enfoques terapéuticos. El factor nuclear-kB (NF-kB) es constitutivamente activado en varios tipos de cáncer, incluyendo el cáncer de ovario y se sabe que apoyar la supervivencia de las células cancerosas. Sin embargo, los mecanismos moleculares de la activación persistente de NF-kB en el cáncer de ovario siguen siendo en gran parte desconocido. Presentamos aquí que, además de la activación canónica se informó anteriormente, el NF-kappa B se activa a través de la vía no canónica en células de cáncer de ovario. silenciamiento de NF-kappa B que induce quinasa (NIK), un regulador central de la vía no canónica, ARN de interferencia mediada por la reducción de la actividad y la expresión del gen indicador NF-kappa B dependiente de la unión, así como del gen diana NF-kB ADN /p52 NF-κB2 expresión. En particular, el crecimiento celular dependiente de anclaje y -independiente estaba alterada en las células agotadas-NIK. El agotamiento de NIK también suprimió la formación de tumores en el ensayo de xenoinjerto de ratón desnudo. Estos resultados indican que NIK juega un papel clave en la activación de NF-kappa B constitutiva y la progresión de las células de cáncer de ovario y sugieren que NIK representa una atractiva diana terapéutica para el cáncer de ovario
Visto:. Uno M, Saitoh Y, Mochida K, Tsuruyama E, Kiyono T, Imoto I, et al. (2014) inductor de NF-B quinasa, una señalización componente central de la vía no-canónica de NF-kB, contribuye a la progresión del cáncer de ovario. PLoS ONE 9 (2): e88347. doi: 10.1371 /journal.pone.0088347
Editor: Javier S. Castresana, Universidad de Navarra, España |
Recibido: 30 Agosto, 2013; Aceptado: January 12, 2014; Publicado: 12 de febrero 2014
Derechos de Autor © 2014 Uno et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado en parte por una subvención de la ayuda-en-Investigación Científica en áreas innovadoras del Ministerio de Educación, Cultura, Deportes, Ciencia y Tecnología de Japón a S.Yamaoka (22117004). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
cáncer de ovario
epitelial es una de las neoplasias ginecológicas más letales y su tasa de supervivencia es mucho menor que otros tipos de cáncer que afectan a las mujeres. Dado que el cáncer de ovario inicialmente presenta síntomas sutiles e inespecíficos, la mayoría de los pacientes se presentan con enfermedad avanzada por lo que el tratamiento quirúrgico agresivo en combinación con la quimioterapia sigue siendo el estándar de cuidado. A pesar de los avances en la quimioterapia mejoró la supervivencia de pacientes con cáncer de ovario, que a menudo no responden a la quimioterapia inicial o recaída después de lograr una respuesta favorable [1]. Por lo tanto, se necesitan nuevos enfoques terapéuticos urgente para lograr un mejor resultado del tratamiento
.
NF-kB es un factor de transcripción implicado en diversos procesos biológicos tales como la respuesta inmune, la inflamación, el cáncer y la muerte celular [2]. En células de mamíferos, el NF-kappa B está compuesto de homo y heterodímeros de cinco miembros, NF-κB1 (p50 y su precursor p105), NF-κB2 (p52 y p100 su precursor), de RelA (p65), RelB y c-Rel . En las células en reposo, la actividad de NF-kappa B está estrechamente regulada por su interacción con las proteínas I? B inhibidoras. El p105 proteína precursora se somete a procesamiento constitutiva por el proteasoma celular que elimina la región de I? B como C-terminal para generar p50. En contraste, la producción de p52 requiere I? B quinasa (IKK) la fosforilación inducida y procesamiento proteasoma mediada de p100. la señalización de NF-kB está mediada por dos caminos llamados los caminos canónicos y no canónicos. La activación de la vía canónica se desencadena principalmente por estímulos de citoquinas tales como factor de necrosis tumoral-α (TNF) y la interleucina-1β, seguido por la activación del complejo IKK, que consta de dos proteínas quinasas IKK y IKKβ y una proteína reguladora NF-kB modulador esencial (NEMO también nombró IKKγ). Activado fosforilación IKK-inducida de I? B? Conduce a su polyubiquitination y proteasomal degradación, seguido por la translocación del heterodímero p50-de RelA al núcleo y la inducción de la expresión del gen diana. La vía no canónica NF-kappa B se activa a través de miembros particulares de la familia de receptores de TNF tales como el receptor B del factor de activación de célula (BAFF), CD40 y receptor de linfotoxina beta que se unen al factor asociado-receptor de TNF (TRAF) 2 o TRAF3. la activación de NF-kB no canónicos ha informado que depender de elevada expresión de NF-kappa B que induce quinasa (NIK), que se consigue de dos maneras, ya sea por deterioro de K48 polyubiquitination de NIK o por la expresión de ARNm mejorado. En las células no estimuladas, TRAF3 une NIK a un multi-subunidad E3 ligase complejo ubiquitina compuesto por TRAF2 y el inhibidor de la apoptosis celular 1 y 2 (cIAP1 y cIAP2), que conduce a K48 polyubiquitination y la degradación proteasomal de NIK, manteniendo así la expresión de NIK a un bajo nivel. En respuesta a la estimulación con citoquinas tales como BAFF o ligando CD40, TRAF3 es reclutado al receptor y sufre degradación proteasomal ubiquitinación mediada. Esto resulta en la estabilización y acumulación de NIK recién sintetizado, mientras que estos estímulos no aumentan el
NIK
nivel de ARNm [3], [4]. En las células cancerosas hematopoyéticas, tales como el mieloma múltiple y la leucemia de células T adultas así como las células de cáncer de pulmón, ya sea la estabilización de la proteína NIK a través de alteración de la regulación negativa de la expresión compleja o aberrante TRAF3 /TRAF2 /CIAP de la
NIK
mRNA se han reportado [5], [6], [7], [8]. En cualquier caso, la acumulación de NIK resulta en la activación del complejo IKK, que a su vez fosforila p100 que conduce a su transformación a p52 y la translocación nuclear de la p52 /RelB heterodímero. En contraste con la activación de la vía canónica, no canónica activación de NF-kappa B no requiere asociación de NEMO con el complejo de IKK y es relativamente persistente [9].
informes anteriores mostraron una activación constitutiva de NF-kappa B y su contribución a la manifestación del fenotipo maligno en varios tipos de cáncer. NF-kB activación da como resultado una elevada expresión de genes relacionados con la progresión del ciclo celular, la supervivencia y la invasión de las células cancerosas. Por ejemplo, la sobreexpresión de ciclina D1, un importante regulador del ciclo celular, promueve la proliferación de células cancerosas, mientras que la expresión desregulada de linfoma de células B-xl protege a las células cancerosas de la apoptosis. Además, la matriz metalopeptidasa 9 (MMP-9) y el factor de crecimiento endotelial vascular promueve la invasión tumoral y la angiogénesis [10]. Como para el cáncer de ovario, la inhibición de la actividad IKKβ, ya sea por un pequeño inhibidor de la quinasa molécula o por el silenciamiento de genes mediada por RNAi, se informó para suprimir la proliferación y la invasión de líneas celulares de cáncer de ovario [11]. El bloqueo de la señalización de NF-kappa B por expresión de una forma dominante negativa de I? B? Altera la tumorigénesis de líneas celulares de cáncer de ovario [12]. Además, se informó de acumulación de de RelA nuclear en tumores de ovario de asociarse con mal pronóstico [13]. Sin embargo, los mecanismos subyacentes a la persistencia de la activación de NF-kB en las células de cáncer de ovario se han mantenido en gran parte desconocido. Ratán y col. mostraron que la expresión de A-7 como factor de elongación de la transcripción, un supresor de la transcripción de genes de RelA-dependiente, es con frecuencia el regulado en células de cáncer de ovario [14]. Recientemente hemos informado de la expresión elevada de NIK y su papel en las propiedades oncogénicas de células adultas de leucemia de células T y de cáncer de pulmón, en el que
NIK
ARNm se expresa de manera aberrante [7], [8]. En el presente estudio, hemos demostrado un papel importante para NIK en la proliferación
in vitro Opiniones y tumorigenicidad de células de cáncer de ovario.
Materiales y Métodos
Declaración de Ética
los experimentos utilizando muestras de cáncer de ovario primario fueron aprobados por el comité de ética de la Universidad de Tokio médica y dental y presta su consentimiento informado por escrito se obtuvieron de todos los pacientes. Todos los experimentos con animales se realizaron con la aprobación del Comité de Estudio de los animales de Tokio la Universidad Médica y Dental (Permiso No. 0120286A) y se ajustaban a las directrices y las leyes pertinentes.
Muestras
Cultivo de células y primarias
Cuatro líneas celulares de cáncer de ovario humano, RMG-I, RMUG-S, RMUG-L y MCAS se obtuvieron de la colección japonesa de Recursos Biológicos de investigación Banco de células (Tokio, Japón) y 2 líneas celulares de cáncer de ovario, MAC-3 y JHOC- 5, eran de la RIKEN Cell Banco de Japón (Tsukuba, Japón) [15]. RMG-I, RMUG-S, RMUG-L y OMC-3 se cultivaron en medio F-12 de Ham suplementado con 10% FBS. JHOC-5 fue cultivada en 01:01 mezcla de medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) y F12 de Ham, que contiene 0,1 mM de aminoácidos no esenciales suplementados con 10% de suero bovino fetal (FBS). MCAS se cultivó en medio esencial mínimo de Eagle que contiene 20% de FBS. Todas las otras líneas celulares de cáncer de ovario fueron descritos en otra parte [16], [17], [18]. líneas de células embrionarias de riñón humano, HEK293 y HEK293T se cultivaron en DMEM que contenía FBS al 10%. HOSE1C es una línea de ovario epitelial humana inmortalizada superficie celular establecida a partir de células de ovario primaria humana epitelio superficial (manguera) después de la infección con el retrovirus que expresan mutante Cdk4, cyclinD1 y la telomerasa transcriptasa humana [19] inversa. las células se cultivaron en HOSE1C 01:01 mezcla de DMEM y F12 de Ham suplementado con 10% FBS. Todos los medios utilizados fueron suplementados con 100 U /ml de penicilina G y 100 mg /ml de sulfato de estreptomicina. muestras de cáncer de ovario primarios se obtuvieron de 12 pacientes en un hospital afiliado de la Medicina y la Universidad de Tokio dental. La edad media de los pacientes fue de 56,5 años, que van desde 27 a 80 años. De los 12 cánceres de ovario, 5 eran histológicamente carcinoma seroso, 4 eran carcinoma de células claras, carcinoma endometrioide eran 2 y 1 era yalk tumor del saco.
Preparación de extractos de células
Para la preparación de conjunto- extractos de células, las células se recogieron y se lisaron en tampón RIPA [Tris 20 mM (hidroximetil) aminometano-HCl (pH 7,5), NaCl 137 mM, 1% Nonidet P-40 (NP-40), 0,5% desoxicolato, 0,1% SDS] . Para la extracción de proteínas citoplasmáticas y nucleares, las células se lisaron en primer lugar en tampón hipotónico [mM 4- (2-hidroxietil) -1-piperazinetanosulfónico (HEPES) (pH 7,8), 0,15 mM de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), ácido 20 0,15 mM ethyleneglycoltetracetic , 10 mM KCl] y se incubaron en hielo durante 10 minutos. NP-40 se añadió a una concentración final de 1%, y las suspensiones celulares se centrifugaron a 14.000 rpm durante 5 minutos. Los sobrenadantes se utilizaron como extractos citoplasmáticos. Los pellets se lavaron tres veces con tampón isotónico [HEPES 20 mM (pH 7,8), NaCl 100 mM, EDTA 0,1 mM y 25% de glicerol], y se resuspendieron en tampón de extracción nuclear [HEPES 20 mM (pH 7,8), NaCl 400 mM, 0,1 EDTA mM, 25% de glicerol y ditiotreitol 1 mM (DTT)]. Después de 30 minutos de incubación a 4 ° C con agitación constante, la suspensión se centrifugó a 14.000 rpm durante 2 minutos. Los sobrenadantes se recuperaron y se usaron como extractos nucleares. Los RIPA, tampones de extracción hipotónicas y nucleares se suplementaron con 1 mg /ml de aprotinina, 1 mg /ml de leupeptina, phenylmethanesulfonylfluoride 0,57 mM, 100 mM de vanadato de sodio, y 20 mM β-glicerofosfato. La concentración de proteína se determinó por el ensayo de Bradford.
ensayo de cambio de movilidad electroforética (EMSA)
Cinco g de extractos nucleares se incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente en tampón de unión [10 mM HEPES ( pH 7,8), NaCl 100 mM, EDTA 1 mM, DTT 1 mM, 2,5% de glicerol y 0,5 g de poli (dI-dC)] con 0,5 ng de sonda de NF-kappa B-específico
32P marcado con derivado de la H -2Kb promotor o
marcado con 32P-Oct-1 sonda [20], [21]. Para los ensayos de super-de cambio, extractos nucleares se preincubaron con anticuerpos o antisuero específico durante 1 hora en hielo antes de la incubación con la sonda marcada. Los siguientes anticuerpos o antisuero se utilizaron para la preincubación: anticuerpo para p50 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EE.UU.,#sc-7178 X), IgG de conejo purificado (Cedarlane Laboratories, Hornby, Canadá) y el suero anti-p52 ( Upstate Biotechnology, Lake Placid, Nueva York, EE.UU., 06 a 413). suero pre-inmune, anti-de RelA y antisueros anti-RelB fueron amablemente proporcionados por los Dres. N. R. Arroz (NCI, MA) y A. Israel (Institut Pasteur, París). Para el ensayo de unión competitiva, las proteínas nucleares se incubaron con 100 veces el exceso de oligonucleótido frío molar antes de añadir la sonda marcada. Los complejos de proteína-ADN se separaron en un gel de poliacrilamida que contiene 2,5% de glicerol, seguido de autorradiografía.
actividad de NF-kB de unión a ADN
La unión de p52 o RelB a secuencia de unión a NF-kB se cuantificó con TransAM ™ NF-kB Familia Kit (Active Motif, Carlsbad, CA, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante. Brevemente, se añadieron 5 g de extractos nucleares a una placa de 96 pocillos pre-revestido con el oligonucleótido que contiene la secuencia de consenso NF-kB. La p52 activada o RelB presente en los extractos que se unen a este nucleótido se detectó por anticuerpos secundarios conjugados con HRP.
Immunoblotting
-célula entera (30 g), citoplásmica (30 g) y nuclear (10 mg) lisados se resolvieron mediante SDS-PAGE y se analizaron por inmunotransferencia. Se utilizaron los siguientes anticuerpos: anti-NF-κB2 p52 (C-5) (Santa Cruz Biotechnology,#sc-7386) para la detección de p52 y p100 su precursor; anti-NIK (Señalización Celular, Danvers, MA, EE.UU.,#4994); anti-RelB (C-19) (Santa Cruz Biotechnology,#sc-226); anti-fosfo-Ser866 (p100 /870) (Cell Signaling,#4810); anti-fosfo-I? B? (Ser32 /36) (5A5) (Cell Signaling,#5205); anti-I? B? (C-21) (Santa Cruz Biotechnology,#sc-371); anti-fosfo-IKK (Ser180) /IKKβ (Ser181) (Cell Signaling,#2681), anti-IKK (H-744, Santa Cruz Biotechnology,#sc-7218), anti-IKK /β (H-470, Santa Cruz Biotechnology,#sc-7607), anti-TRAF2 (C90-481) (BD Biosciences, San Jose, CA, EE.UU., 558890); anti-TRAF3 (H-122) (Santa Cruz Biotechnology, SC-1828); anti-cIAP1 (I + amp; D Systems, Minneapolis, MN, USA, AF8181); anti-lamina A /C (4C11) (La señalización celular,#4774); anti-α-tubulina (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EE.UU., T9026). Para la detección de la proteína NIK endógena, las células se trataron con 0,1% de DMSO o 20 M de MG132 (Peptide Institute, Osaka, Japón) durante 6 horas y los extractos citoplasmáticos se sometieron a análisis de inmunotransferencia.
en tiempo real de transcripción inversa -PCR (RT-PCR) análisis
en tiempo real el análisis RT-PCR se realizó esencialmente como se describe anteriormente [7]. Brevemente, el ARN total fue extraído de las líneas celulares y tejidos de cáncer de ovario utilizando ISOGEN (Nippon Gene, Tokio, Japón) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los niveles de mRNA de
NIK
,
Ciclina D1
y
MMP-9
se cuantificaron utilizando el sistema en tiempo real RT-PCR StepOnePlus (Applied Biosystems, Foster City, CA, ESTADOS UNIDOS). El cien ng de ARN total fue sometido a RT-PCR cuantitativa utilizando TaqMan One-Step RT-PCR Master Mix reactivos del kit (Applied Biosystems). La transcripción inversa se realizó a 48 ° C durante 30 minutos y el ADN Taq polimerasa se activó a 95 ° C durante 10 minutos, seguido de 45 ciclos de amplificación de desnaturalización a 95 ° C durante 15 segundos y recocido y extensión a 60 ° C durante 1 minuto . Los niveles de mRNA se normalizaron a los niveles de 18S ARN ribosomal medidos por tiempo real RT-PCR utilizando 100 pg de ARN total. La expresión de miR-31 se examinó utilizando TaqMan® Micro RNA ensayos (Applied Biosystems) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los niveles de miR-31 se normalizaron con los niveles de expresión RNU48.
Los lentivirus
Lentiviral vectores capaces de expresar shRNA orientación
NIK
(PCS-puro-NIKI-1 y PCS -puro-NIKI-2) fueron descritas anteriormente [7]. La secuencia de acceso específica para
proteína verde fluorescente gratis (GFP) 5'-ACCCGCGCCGAGGTGAAG-3 'se insertó inmediatamente aguas abajo del promotor H1 del vector pSuperRetoro (Oligoengine, Seattle, WA, EE.UU.), generando PSR-GFPi . El casete de expresión shRNA se transfirió a lentiviral vector, PCS-puro-PRE, que lleva el gen de resistencia a puromicina expresado bajo el control del promotor de fosfoglicerato quinasa [7]. El plásmido resultante se denominó PCS-puro-GFPi. Para la producción de los lentivirus capaces de expresar shRNA, las células HEK293T se cotransfectaron con el PCS-puro-GFPi (shCtl), PCS-puro-NIKI-1 (shnik-1) o PC-puro-NIKI-2 (shnik-2) junto con la construcción de empaquetamiento pCMV-ΔR8.2 y pHCMV-VSV-G (regalos de tipo Dr. Chen ISY) utilizando FuGENE6 (Promega, Madison, WI, EE.UU.). Los sobrenadantes de cultivo se recogieron y se filtraron a 56 horas después de la transfección. células RMG-I y JHOC-5 se infectaron con estos lentivirus para 12 horas en presencia de 10 mg /ml de polibreno. Se seleccionaron las células infectadas en presencia de 4 mg /ml de puromicina (Sigma-Aldrich) 24 horas después de la infección.
NF-kB del gen reportero de ensayo página 5-JHOC células
RMG-I y eran infectadas con vectores de lentivirus que llevan ya sea un NF-B-sensible promotor impulsado por la luciérnaga
luciferasa
gen (CS-B-R2.2) o el factor de elongación (EF) -1α promotor impulsado por
Renilla luciferasa
gen (pCERp) [8], [22]. piscinas de células resultantes fueron infectados posteriormente con lentivirus capaces de expresar cada shRNA. Después de la selección con 4 mg /ml de puromicina durante 3 días, se recogieron las células y las actividades de luciferasa se midieron utilizando Dual-Luciferase reportero sistema de ensayo (Promega). la actividad de la luciferasa de la luciérnaga NF-KB dependiente se normalizó con
Renilla
actividad luciferasa EF-1α promotor impulsado dependiente.
Cell-ciclo de análisis
Las células fueron fijadas en 70% etanol y se incubaron con 0,5 mg /ml de ARNasa durante 45 minutos y después se tiñeron con 30 mg /ml de yoduro de propidio durante 30 minutos a temperatura ambiente. El contenido de ADN de las células se midió utilizando el sistema de FACS Calibur (BD Biosciences) y se analizaron software CellQuest (BD Biosciences).
Soft agar ensayo
células
RMG-I que expresan shCtl o shnik-1 eran se sembraron en medio F-12 que contiene 0,33% de agar. Después de 4 semanas de incubación, las colonias más grandes que 60 micras de diámetro fueron contados para evaluar el crecimiento celular independiente de anclaje.
Ratón modelo de tumor de xenoinjerto
BALB /cAJcl-nu /nu (CLEA Japan , Tokio, Japón) se mantuvieron bajo condiciones específicas libres de patógenos en el Centro de Experimentación Animal de Tokio y Dental Medical University. células RMG-I que expresan shCtl o shnik-1 se suspendieron en medio libre de suero. ratones atímicos (5-6 semanas de edad) se inocularon por vía subcutánea en la región postauricular con 5 × 10
6 células. El volumen del tumor se registró cada semana. El diámetro mayor longitudinal (longitud) y el mayor diámetro transversal (anchura) se midieron con un calibrador. El volumen del tumor se calculó usando la siguiente fórmula: volumen del tumor = longitud x anchura
2/2. Todos los ratones se sacrificaron 3 semanas después de la inoculación y se midió el peso de cada tumor.
Estadísticas
Los datos se presentan como media ± SD imágenes o como representativos de al menos tres experimentos independientes. El análisis estadístico se realizó mediante la prueba t de Student de dos colas. Para el análisis de la muestra del paciente y el modelo de ratón, las diferencias significativas entre los grupos se determinaron mediante la prueba de Mann-Whitney. Un
P
valor de & lt; 0,05 se consideró estadísticamente significativa
Resultados
noncanonical la activación de NF-kB en las células de cáncer de ovario
Para explorar cómo NF. -κB es constitutivamente activado en las células de cáncer de ovario, se examinaron en primer lugar a ADN de NF-kB actividad de unión por la EMSA. Las células de cáncer de ovario mostraron la actividad de NF-kB de unión a ADN marcadamente elevada en comparación con las células HEK293 se sabe que tienen una actividad basal NF-kB. HOSE1C, una línea de células epiteliales de ovario inmortalizado superficie mostró una actividad de unión a NF-kB tan bajo como células HEK293 y se utilizó como control en los siguientes estudios (Figura 1A). La unión a la sonda radiomarcada se compitieron eficazmente con una cantidad en exceso de sonda fría, lo que demuestra la especificidad de la unión (Figura 1B). A pesar de que la activación persistente de NF-kappa B ha sido reportado en el cáncer de ovario, los complejos de unión de ADN-B-NF implicados en estas células se desconoce. Los ensayos de desplazamiento super-revelaron que no sólo NFKB1 /p50 y Rela sino también NFKB2 /p52 y RelB estaban involucrados en los complejos NF-kB de unión al ADN en RMG-I y JHOC-5 células (Figura 1B). Immunoblottings mostraron estas líneas celulares expresan específicamente a las formas fosforiladas de IKK, IKKβ y I? B (Figura 1C). La fosforilación de I? B? IKKβ y fue más intensa en las células JHOC-5 y MCAS mientras IKK era predominantemente fosforilada en RMG-I y OMC-3 células, lo que sugiere la activación preferencial de las vías canónicas y no canónicos en cada líneas celulares. El hecho de que la expresión de p100 /NFKB2 depende en gran medida de la activación de NF-kB a través de la vía canónica puede explicar en parte la expresión abundante de NFKB2 /p100 y su forma fosforilada, así como p52 en células JHOC-5. Se detectó la forma fosforilada de p100 en las líneas celulares de cáncer de ovario a excepción de RMUG-S, pero no en el control 293 o células HOSE1C. La presencia de de RelA y RelB en el núcleo en correlación con los resultados de EMSA (Figura 1D). Estos resultados indican que las vías de NF-kB tanto el canónicas y /o noncanoncal se activan diferencialmente en células de cáncer de ovario.
(A) Cinco microgramos de extractos nucleares de las líneas celulares indicadas se sometieron a EMSA usando
oligonucleótidos que contienen una secuencia de unión a NF-kB o secuencia de unión Oct-1 como sondas marcada con 32P. (B) Para las muestras nucleares ensayo de competición se preincubaron con 100 veces el exceso de oligonucleótido frío molar antes de añadir la sonda marcada (panel izquierdo). componentes de unión al ADN de NF-kB en las líneas celulares indicadas se determinaron por super-cambio de EMSA (panel derecho). Los extractos nucleares (5 g) de las líneas celulares indicadas se preincubaron durante 30 minutos con IgG purificada de ratón, anti-p50 o anticuerpos anti-c-Rel, pre-inmune (PI), anti-p52, anti-de RelA o anti-RelB sueros y, a continuación, sometido a la EMSA con la sonda NF-kB-específica. extractos (C y D) nucleares (10 g), citoplásmica (30 mg) o de células enteras (30 g) se sometieron a SDS-PAGE seguido de Immunoblottings con los anticuerpos indicados.
NIK juega un papel fundamental en la activación de NF-kappa B constitutiva en las células de cáncer de ovario
la expresión elevada de NFKB2 /p52 nos llevó a examinar la expresión de NIK en las células de cáncer de ovario. El análisis cuantitativo de RT-PCR reveló que las células de control mostraron HOSE1C mayor diferencia CT que probaron las 28 líneas celulares de cáncer de ovario, entre los que 17 líneas celulares expresaron de 4 a 16 veces más
NIK
mRNA que las células de control HOSE1C (Figura 2A). Un informe reciente ha demostrado que la pérdida de microARN miR-31 de la orientación
NIK
subyace a la activación constitutiva de NF-kB en las células de leucemia de células T adultas [23]. Por lo tanto, se evaluó el miR-31 expresión en células de cáncer de ovario por RT-PCR cuantitativa. Cuatro de 6 líneas celulares de cáncer tenían menos de 1/8 de miR-31 de ARN en las células HOSE1C aunque correlación entre
NIK
y miR-31 expresión de ARN no fue significativa (Figura 2B y 2C). Es importante destacar que, cuantitativa análisis RT-PCR de los tejidos de cáncer de ovario reveló una mediana de incremento de 2,4 veces en la
NIK
la expresión del ARNm en comparación con tejidos ováricos normales (Figura 2D). Sin embargo, el miR-31 expresión en tejidos de cáncer de ovario no difirió significativamente de los de los tejidos ováricos normales ni estadísticamente correlacionada con
NIK
expresión de ARNm (Figura 2E y 2F). Por lo tanto, ciertos casos de
NIK
la acumulación de ARNm puede no sólo se explica por la reducción de expresión de miR-31 y sugerir previamente dio a conocer el mecanismo (s) de
NIK
sobreexpresión de ARNm.
( a y D) ARN total fue extraído de las líneas celulares indicadas o tejidos de cáncer de ovario y se sometieron a tiempo real de RT-PCR para cuantificar
NIK
la expresión del ARNm. (A) El Ct se determina como la diferencia entre el valor Ct de
NIK
mRNA y la de rRNA 18S diluidas. Un solo asterisco denotan disminución significativa (
P
& lt; 0,05) en el valor Ct comparación con las células HOSE1C. (D) El
NIK
niveles de mRNA se normalizaron a 18S ARN. Relativa
NIK
niveles de ARNm se muestran por veces de incremento en la abundancia de ARNm en relación con el promedio de los ovarios normales (arbitrariamente fijado en el 1). (B y E) El ARN total utilizado en los paneles A y D se sometió a tiempo real de RT-PCR para el miR-31 de la cuantificación. (B) El Ct se determina como la diferencia entre el valor Ct de miR-31 y la de RNU48 control interno. Un solo asterisco denotan aumento significativo (
P
& lt; 0,05) en el valor Ct comparación con las células HOSE1C. (E) Los niveles de miR-31 se normalizaron a los niveles RNU48 correspondientes. Los niveles relativos de miR-31 se muestran mediante veces de incremento en el miR-31 de la abundancia relativa de la media de los ovarios normales (arbitrariamente fijado en el 1). (C, F) de Pearson coeficiente de correlación R
2 entre el ARNm NIK y los niveles de miR-31 se calculó. (G) Treinta microgramos de lisados se sometieron a SDS-PAGE seguido de Immunoblottings con los anticuerpos indicados. Para la detección de endógeno NIK, las células se trataron con MG132 (20 mM) o DMSO durante 6 horas antes de la preparación de los extractos citoplásmicos. n.s., no significativo.
expresión de la proteína NIK está estrechamente regulada por polyubiquitination y la degradación mediada por proteasoma y generalmente se mantiene indetectable por inmunotransferencia sin inhibir su degradación rápida. La expresión de TRAF2, 3 y cIAP1 en líneas celulares de cáncer de ovario que regulan negativamente la expresión NIK permaneció comparable con las células control (Figura S1). Como no fuimos capaces de detectar la proteína NIK por inmunotransferencia simple o inmunotransferencia inmunoprecipitación acoplado usando lisados citoplásmicos de estas células, se trataron las células con un inhibidor del proteasoma MG132 antes de la extracción de proteínas. La proteína NIK era fácilmente detectable en las células de cáncer de ovario en presencia de MG132, pero no en HOSE1C de control ni las células HEK293 (Figura 2G), lo que indica una mayor producción de la proteína NIK en células de cáncer de ovario. Estos datos indican que colectivamente NIK se expresa de manera aberrante en el nivel pretranslational en las células de cáncer de ovario.
informes anteriores demostraron que mal pronóstico de los pacientes con cáncer de ovario se correlaciona con la sobreexpresión de pro-MMP-9 y ciclina D1 [24], [25], cuya expresión se sabe que está regulada por NF-kB. Los análisis de RT-PCR cuantitativa demostró que
MMP-9
niveles de mRNA de la mayoría de las líneas celulares de cáncer de ovario fueron superiores a la de las células HOSE1C de control. El
MMP-9
niveles de mRNA en cada línea celular no se correlacionó con el
NIK
los niveles de mRNA (Figura 3A). Los niveles de
cyclinD1
mRNA en todas las líneas celulares de cáncer de ovario probadas superaron la de las células HEK293, mientras que las células HOSE1C expresaron abundantemente
cyclinD1
mRNA debido a la expresión forzada de este gen para la inmortalización. En los tejidos de cáncer de ovario,
MMP-9
la expresión de ARNm fue significativamente regulada hacia arriba y
ciclina D1
niveles de mRNA tendió a aumentar en los tejidos de cáncer de ovario, aunque éstas expresión del ARNm en cada muestra no se correlacionó con
NIK
expresión de ARNm (Figura 3B).
el ARN total extraído de las líneas celulares indicadas (a) o tejidos de cáncer de ovario (B) se sometió a tiempo real de RT-PCR para cuantificar
MMP-9
o
ciclina D1
la expresión del ARNm. (A) El Ct se determina como la diferencia entre el valor Ct de
MMP-9
o
Ciclina D1
mRNA y la de rRNA 18S diluidas. Un solo asterisco indican diferencia significativa (
P
& lt; 0,05) en el valor Ct comparación con las células HOSE1C (
MMP-9
) o células HEK293 (
Ciclina D1
). (B) Los niveles de mRNA se normalizaron a 18S RNA. los niveles de ARNm relativos se muestran por el aumento de veces en la abundancia de ARNm en relación con el promedio de ovarios normales (arbitrariamente fijado en 1). Pearson coeficiente de correlación R
2 entre
MMP-9
o
Ciclina D1
y
se muestra NIK
niveles de mRNA. relativa niveles de mRNA se calcula como el aumento de veces en la abundancia de ARNm en relación con la de las células HOSE1C (
MMP-9
) o células HEK293 (
Ciclina D1
).
Para explorar cómo NIK regula la transcripción de genes NF-kB-dependiente en líneas celulares de cáncer de ovario, establecimos un sistema celular reportera NF-kB por transducción de lentivirus. 5-JHOC células RMG-I y se infectaron con vectores de lentivirus que lleva un Firefly
luciferasa
unidad de transcripción bajo el control de promotor dependiente de NF-kB o
renilla luciferasa unidad
la transcripción bajo el control de promotor del factor de elongación constitutiva 1α-deriva como un control interno. piscinas celulares establecidas se infectaron posteriormente con lentivirus capaz de expresar ya sea shRNA orientación
NIK
o
GFP
y se sometieron a ensayos de luciferasa. El agotamiento de NIK se verificó por RT-PCR cuantitativa e inmunotransferencia en presencia de MG132 (Figura 4A). el agotamiento de NIK reducción de expresión p52 y la expresión del gen indicador NF-KB dependiente de la RMG-I y JHOC-5 células (Figura 4B y 4C). La expresión de shRNA otra orientación
NIK
ARNm produjo la supresión similar de la transcripción dependiente de NF-kB, excluyendo la posibilidad de efectos fuera del objetivo (Figura S2A, B).
(A) RMG- I y JHOC-5 células fueron infectadas con vectores de lentivirus que expresan shRNA orientación
NIK gratis (shnik-1) o
GFP gratis (shCtl). ARN total fue extraído a partir de estas células y se sometió a tiempo real de RT-PCR para cuantificar
NIK
expresión mRNA. El
NIK
niveles de mRNA se normalizaron a 18S ARN. Relativa
NIK
niveles de ARNm se muestran por veces de incremento en la abundancia de ARNm en relación con el promedio de shCtl (arbitrariamente fijado en el 1). Un solo asterisco denotan disminución significativa (
P Hotel & lt; 0,05) en comparación con las células shCtl. En paralelo, las células se trataron con MG132 (20 mM) durante 6 horas antes de la preparación de los extractos citoplásmicos. extractos citoplasmáticos (30 g) se sometieron a análisis de inmunoblot con los anticuerpos indicados. (B) RMG-I y JHOC-5 células infectadas con un vector de lentivirus que lleva un casete de expresión de luciferasa de la luciérnaga NF-kappa B-dependiente y que la realización de un EF-1α dependiente de promotor
Renilla
casete de expresión de luciferasa. piscinas celulares establecidas se infectaron con vectores de lentivirus que expresan shRNA orientación
NIK gratis (shnik-1) o
GFP gratis (shCtl). Las células se seleccionaron con puromicina (4 mg /ml) durante 72 horas y se sometieron a la ensayo de luciferasa dual, en el que la actividad de luciferasa de la luciérnaga se normalizó con
Renilla
actividad de la luciferasa. actividades relativas de luciferasa se expresan como unidad de luz en comparación con el control (shCtl). Yang et al.